Abstract
intratumorale heterogenitet utfordringer eksisterende paradigmer for anti-kreft terapi. Vi har tidligere demonstrert at humane embryonale stamceller (hESC)-avledede cellemikromiljø hos immunkompromitterte mus, muliggjøre funksjonell forskjell fra heterogene tumorceller, inkludert celler som ikke vokser inn i en tumor i en konvensjonell direkte tumor xenograft plattform. Vi har identifisert og karakterisert seks cancercellepopulasjoner hver klonalt ekspandert fra en enkelt celle, er avledet fra human ovarie klar cellekarsinom av en enkelt svulst, for å demonstrere slående intratumoral fenotypisk heterogeniteten som er dynamisk avhengig av tumorvekst mikromiljøet. Disse kreftcellepopulasjoner, karakterisert som kreft stamcellepopulasjoner, trofast rekapitulere hele spekteret av histologisk fenotypiske heterogenitet kjent for menneskelig eggstokkreft klarcellet karsinom. Hver av de seks subpopulasjoner viser en forskjellig grad av morfologisk og tumorigent differensiering, karakterisert ved vekst i hESC-avledede mikromiljøet favoriserer veksten av CD44 + /aldehyd-dehydrogenase positive lommer av selvpolerende celler som oppretttumorvekst gjennom en prosess med tumorigen differensiering til CD44- /aldehyd-dehydrogenase-negative derivater. Påfallende, disse derivatkontraktene cellene vise mikroavhengig plastisitet med kapasitet til å gjenopprette selvfornyelse markører og CD44 uttrykk. I denne studien, avgrense vi tydelig genekspresjon og epigenetiske profiler av to slike subpopulasjoner, som representerer ytterpunktene av fenotypiske heterogenitet i form av nisje-avhengige selvfornyelse og tumorigent differensiering. Ved å kombinere Gene Set Enrichment, Gene ontologi og Pathway-fokusert rekke analyser med metylering status, foreslår vi en rekke robuste forskjeller i tumor selvfornyelse og differensiering trasé som ligger til grunn for slående intratumoral fenotypiske heterogenitet som karakteriserer denne og andre faste tumor malignitet.
Citation: Abelson S, Shamai Y, Berger L, Skorecki K, Tzukerman M (2013) nisje-Dependent Gene Expression Profil intratumorale Heterogene Ovarian Cancer Stem Cell pasientgrupper. PLoS ONE 8 (12): e83651. doi: 10,1371 /journal.pone.0083651
Redaktør: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, USA
mottatt: 21. mai 2013; Godkjent: 06.11.2013; Publisert: 17.12.2013
Copyright: © 2013 Abelson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Finnancial støtte for denne forskningen ble gitt av Daniel M. Soref Charitable Trust, den Skirball Foundation og med et forskningsstipend fra Israel Science Foundation (tilskudd No. 453 /06MT og stipend nr 62/10 MT) .De finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
det er nå allment forstås at en enkelt svulst er sammensatt av heterogene cellepopulasjoner, som hver viser en sammensatt cellulær morfologi, fenotypisk ekspresjon, startfasen kapasiteter og iboende eller ervervet resistens overfor anti-kreft medikamenter. Den nylig publisert forskning som beskriver intratumoral heterogenitet av tykktarmskreft celle og funksjonell atferd, som vises av omfattende variasjon i vekstdynamikk, utholdenhet gjennom serie xenograft passasjer og respons på behandlingen ytterligere understreker kompleksiteten av humane tumorer [1].
aggressivitet og oppfinnsomhet av kreft hos mennesker utgå hovedsakelig fra slike komplekse intratumoral heterogenitet, noe som igjen har blitt tilskrevet genetiske og epigenetiske endringer kombinert med adaptive responser til svulsten mikromiljøet. Samle bevis viser at modellen av «kreftstamceller «(CSC) og klonal evolusjon modell, gjensidig bidra til intratumoral heterogenitet, som CSC selv gjennomgå klonal evolusjon [2-7]. Den kontinuerlige akkumulering av mutasjoner genererer heterogenitet av celler i en fast tumor og dens metastaser, og kan reflektere den prosess hvorved visse undergrupper av tumorceller bli mer aggressive i prosessen for tumorprogresjon. En viktig innsikt er knyttet til forståelsen av at selvfornyelse kapasitet på kreftstamceller er ikke en holdbar staten, men heller dynamisk og nisje-avhengige. Tumor stroma interaksjons signaler også regulere epithelial kreftcelle plastisitet via epitelial til mesenchymale overgangen programmer (EMT) som i tillegg til å legge til rette for invasjon og metastasering av kreft celler, gjør konvertering av ikke cscs inn cscs og kan påvirke endring av svulsten mikromiljøet ved å konvertere kreftcellene i svulsten støttende stroma [8-11]. Som sådan, kompleksiteten og plastisitet av faste tumorer stråler ut fra kravet om en støttende mikromiljøet som gir et kompatibelt nettverk av interaksjoner mellom de heterogene kreftceller og forskjellige tumorbærende celler [12-16]. Rekruttering av tumor støtte multipotente stamceller kombinert med omfattende ombygging av tilstøtende vev er en viktig prosess for å tilveiebringe et mikromiljø som bærer kreftcelle proliferasjon, migrering og invasjon [17,18]. De spesifikke fremgangsmåter som er blitt mest omfattende studert inkluderer neoangiogenesis [19], tiltrekning av inflammatoriske celler [20] og kreft tilhørende fibroblaster [21-23], som sammen med den ekstracellulære matriks (ECM) skape kompleksiteten av tumormassen [24] .
xenotransplantasjon modeller for generering av humane tumorer hos immundefekte mus er begrenset av forskjeller mellom de murine og humane mikromiljøet, særlig med hensyn til nisjeavhengige egenskaper av CSC selvfornyelse [25,26]. I mange tilfeller fører denne begrensningen til forskjellige lese outs av forskjellige tumor subkloner i xenotransplantasjon assays [5,21,27,28]. Derfor har vi etablert og validert en svulst mikromodell basert på potensialet i humane embryonale stamceller (hESC) for å generere teratomas i immunsvikt mus. Denne modellen har den enkle standard-xenograft-modeller, men den fordel at svulsten mikromiljøet omfatter et bredt spekter av ikke-transform differensierte vev avledet fra alle tre bakterie lag og strukturer av human opprinnelse [29,30]. Vi har tidligere vist at dette
in vivo
modellen gir en fortrinnsrett tumorigenesis mikromiljøet med følgende funksjoner: a) forbedret tumorcelle levedyktighet; b) fremtredende tumorcelle invasjon; c) tumorindusert vaskulogenese; og d) relativ beskyttelse fra immunotoksin indusert regresjon [29,30].
Eggstokkreft klarcellet karsinom (OCCC), er preget av slående intratumoral morfologiske heterogenitet, inkludert celler med funksjoner for avansert eggstokkreft strukturell variasjon på den ene siden, og celler med funksjoner i tumorigent differensiering (f.eks invasjon, spredning) og tilsvarende celleoverflaten og intracellulær markør heterogenitet [31-35]. Vi har isolert og karakterisert seks forskjellige cancercellepopulasjoner (CCSPs) fra en tumor i en enkelt pasient, og demonstrerte nisje avhengig tumorigen kapasiteter og histologiske fenotyper når dyrket i hESC-avledede teratom vev, som kumulativt rekapitulere hele spektret av tumor heterogenitet [ ,,,0],36]. De seks CCSPs ble karakterisert som eggstokkreft CSC i kraft av funksjonelle og fenotypiske uttrykk for CD44 + CD24 + EpCAM + og ALDH1 aktivitet [5,36]. I tillegg har disse seks forskjellige subpopulasjoner vært funksjonelt karakterisert som viser de viktigste stamcelleegenskaper både selvfornyelse og tumorigent differensiering kapasiteter i en nisje avhengig måte. I murine nisje, er det begrenset støtte for selvfornyelse av CSC, sammen med en høy grad av tumorigent differensiering, mens hESC-avledet nisje mer fremtredende opprett CSC selvfornyelse i motsetning til differensiering. Dermed gir den hESC-baserte modellen et viktig
in vivo
plattform i lys av den essensielle rollen CSC selvfornyelse i motstand mot anti-kreft terapi og i gjengivelsen intratumoral heterogenitet mottagelig for biologisk analyse samt anticancerterapi testing [5]. Videre ble det nylig vist at hESC-basert modell uttrykke
bona fide
menneskelige tumor blodkar og forbedre tumor engraftment renten med primære humane eggstokkreft stilk-lignende celler (CSC) [37]. Derfor ønsket vi å undersøke de respektive genuttrykk profiler av to forskjellige OCCC-avledet CCSPs representerer de ekstreme ender av spekteret i form av nisje-avhengige selvfornyelse versus tumorigent differensiering. De oppnådde resultater markere veier styrende intratumoral heterogenitet ved genekspresjon og epigenetiske nivåer, og det viktige bidrag av tumoren mikromiljøet til denne heterogenitet.
Materialer og metoder
Utledning av eggstokkreft celle subpopulasjoner
Innsamling av ascitesvæske ble utført med et skriftlig informert samtykke fra en 64 år gammel pasient diagnostisert med stadium IV Ovarian Clear Cell Carcinoma og protokollen ble godkjent av institusjonelle Etikk Review Committee av Rambam Medical Center. Seks ulike kreftcellepopulasjoner, clonally utvidet fra en enkelt celle, inkludert CCSP C12 og C13, ble avledet fra ondartet ovarian ascites og dyrket i kultur som tidligere beskrevet [5,36]. Klonalitet analyser ved anvendelse av den HUMARA metoden [38] og Forensic STR analyse viste en monoklonal opprinnelse for alle de seks CCSPs undersøkt (data ikke vist). Ikke desto mindre, karyotype-analyse av metafase-kromosomer ekstrahert fra hver celle subpopulasjon kreft, spredt på objektglass og analysert ved Spectral-karyotyping (SKY), viste et høyt nivå av kromosomale endringer og variasjoner mellom CCSPs (data ikke vist). Det bør bemerkes at selv holdt i kultur i mer enn 6 år, er cellekulturer gjentatte ganger initiert fra frosne aksjer hver 3-4 måneder, og CCSPs varig og konsekvent opprettholde «
bona fide
» ovarian kreft egenskaper , CSC egenskaper og xenopodet svulst histologisk fenotype [5,36].
Dyr, teratom, tumordannelse og vev håndtering
SCID /beige mus ble kjøpt fra Harlan Laboratories Ltd, Jerusalem, Israel. Musene ble plassert og holdt under spesifikke patogen-frie forhold som instruert av komiteen for Kontroll av forsøk med dyr ved Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel. Dette ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Technion (Protocol # IL-026-02-12). Mus ble observert for teratom og tumordannelse gang i uken og avlivet ved hjelp av CO
2 innånding. For teratom formasjon, udifferensiert hESC fra klon H9.1 (46XX), ble injisert i mus bakben muskulaturen (5×10 ~
6 celler pr injeksjon) [29]. Ved 7-8 uker etter første injeksjon av hESC, 4X10
6 kreftceller ble injisert inn i teratom (i.t. tumorer) og fikk vokse i ytterligere 20 til 60 dager. Kontroll svulster avledet fra direkte innsprøyting (im svulster) av 4×10
6 celler inn i bakben muskulaturen ble høstet ved 20 til 60 dager etter injeksjon.
genuttrykkstudier
Uttrykket studiene var gjennomført med tre uavhengige prøvesett ved hjelp av Illumina HumanWG-6 V3.0 uttrykk beadchip Array. De skannede bildene ble analysert ved hjelp av Illumina er GenomeStudio V.2009.1 programvare (Illumina Inc. San Diego, CA, USA) for utvinning og kvalitetskontroll. Rådata innhentet fra tre uavhengige microarray eksperimenter ble importert til genomikk programvare (Genomics Suite; Partek Inc., St Louis, MO), normalisert, og en fjerning av alle ikke-biologiske, «batch effekter», som kan forstyrre resultater utført. Genuttrykket signalene ble forvandlet ved å beregne basis to logaritmer. Gener som den oppgitte transkripsjon ikke ble uttrykt over bakgrunns definert av negative kontroll sonder av Illumina beadchip i alle prøvene ble filtrert ut. Dataene har blitt deponert i National Center for Biotechnology Information GEO7, og er tilgjengelig gjennom GEO Series tiltredelse GSE43208.
Differensial uttrykk for enkeltgener
Gener som er forskjellig regulert i hver gruppe, var valgt basert på deres ganger endring. Gjennomsnittet av de normaliserte signalene genene blant de forskjellige gruppene ble sammenlignet, og t-test ble anvendt for vurdering av den statistiske signifikans av folden forskjellen mellom dem. Gener ble valgt basert på fold endring ( 2), og tilsvarende statistisk signifikant p-verdi ( 0,05). For å redusere sjansen for falske positiver, gener som ikke følger to fold terskelen i hver av de 3 uavhengige genuttrykk arrays ble utelatt.
Gene Set Enrichment analyser (GSEA)
GSEA ble utført ved hjelp av JAVA-basert programvare [39]. The Leading Edge analyseverktøyet (LEA) ble brukt til å trekke ut kjernen genet medlemmer av beriket gensettene for å lage lister av gener som gjør det største bidraget til de tilsvarende berikelse score (ES) oppnås for enten C12 im, C12 det, C13 im, og C13 det klasseskiller. En konservativ terskelen False oppklaringsprosenten (FDR) 0,05 og p-verdi 0,05 ble bestemt etter 1000 tilfeldige permutasjoner. Bare ledende gener som ble delt av minst 5 statistisk beriket gensettene brukt senere for Gene ontologi analyser.
Gene ontologi (GO) analyse
Gorilla web-basert verktøy (http : //cbl-gorilla.cs.technion.ac.il) som bruker rangeres genet lister ble anvendt for å identifisere anrikede GO-markeringer [40]. Som target liste innganger, brukte vi kjerne genet medlemmer av GSEA LEA verktøy korrelerer C12 eller C13 avledet svulster som utvikles intra-muskulær (i.m) eller intra-teratom (i.t.). De fire mål-listene ble brukt hver for seg, mens en liste som representerer alle de gener som ble testet i den Illumina genekspresjon plattform tjente som bakgrunn for hver av analysene. En konservativ terskel p-verdi 0,005 ble valgt etter Bonferroni korreksjon for multiple sammenligninger
Restriktive analysekriteriene
1) Gener som ikke fulgte den to ganger terskelen i hver av de tre uavhengige. genekspresjon arrays ble utelatt (svært restriktive kriterier). 2) I GSEA, konservative nominell p-verdi 0,05 (NOM p) og FDR q-verdi 0,05 ble valgt 3) LEA ble brukt. 4) I GO berikelse analyse, cutoff p-verdi. 0,005 ble valgt
Pathway-Fokusert Arrays
Den menneskelige Wnt, Sonic Hedgehog, og Notch signalveien RT
2 Profiler PCR arrays (SuperArray Bioscience, Frederick, USA) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner med en mikrogram av RNA som utgangsmateriale i hver matrise. Analyse av data ble utført med SABiosciences web-basert PCR Array dataanalyse programvare (https://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php) og oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) programvare (Oppfinnsomhet Systems, Redwood City, California).
RNA ekstraksjon fra laser mikro-dissekert tumorprøver, og fra
i
vitro
voksende celler, QRT-PCR-analyser og Bisulfite sekvensering er beskrevet i Materialer og metoder S1. Gener spesifikke primere som brukes for QRT-PCR og bisulfitt analyser er gitt i tabell S2 og S3.
Resultater
Expression profiler av OCCC-avledet heterogene kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
Vi har nylig rapportert observasjonen som konsekvent heterogenitet i tumorigene egenskaper blant seks forskjellige OCCC-avledet CCSPs var mest påfallende reflektert i sin nisje avhengige
in vivo
tumorigene kapasitet og tumorcelle fenotyper [36], og at den hESC-avledet nisje støtter videre selvfornyende CSC og eksponerer deres hele repertoaret av tumorigene fenotyper [5]. For å belyse svulsten mikromiljøet bidrag til dette heterogenitet, fokuserte vi på genuttrykk microarray analyser for å karakterisere genuttrykk profiler av to forskjellige kreftcellepopulasjoner, CCSP C12 og C13 som vokser med hell i både xenotransplantasjon og hESC-baserte teratom modeller, og som utviser ekstreme tumorigene fenotypiske egenskaper og nisje-avhengige selvfornyelse kapasitet [5,36]. C12-deriverte svulster er preget av en overflod av høyt differensierte eggstokkene strukturer, mens C13-deriverte svulster utviser dårlig eggstokkene strukturell differensiering [36]. I tillegg C13 bevarer sin evne til selvfornyelse som demonstrert ved
in vivo
opprettholdelse av tumorigene cancerceller både i murine og den hESC-avledede cellevevet, mens C12 ikke klarer å opprett tumorigene celler i den murine vev, men genererer svært aggressive og invasive svulster innenfor hESC-avledet cellevevet [5]. I lys av dette slående effekt, ønsket vi å avgrense genuttrykk profilen til CCSP C12 og C13 avledet svulster som en refleksjon av samspillet mellom kreftceller og svulsten mikromiljøet. RNA prøver ble ekstrahert fra C12 og C13 dyrket i cellekultur, og fra tumorer som genereres i.m og i.t. (hver prøve i triplikat), og hybridisert til hele genomet ekspresjonssystemer matriser (se Materialer og Metoder). Skjematisk fremstilling av analyseprosedyren er beskrevet i figur 1. Matrise-analyser ble utført på følgende nivåer: C12 C13 versus
in vitro
dyrkede celler, C12-C13 versus im tumorer og C12 C13 versus tumorer det (figur 1A , B). Hovedkomponentanalyse (PCA) for de oppnådde data ble utført for å vurdere den relative hierarkiske bidraget av forskjeller i genekspresjon blant prøvene (figur 2A). Tydelig clustering av C12
in vitro
dyrket celler prøver og C13
in vitro
dyrket celler prøvene ble imidlertid observert en åpenbar sammenheng er demonstrert mellom C12 im og det prøver og mellom C13 im og det prøver, indikerer signifikante forskjeller i genuttrykk profiler mellom CCSPs C12 og C13. Hierarkisk klyngeanalyse (HCA) av hver prøve in triplo ytterligere bekrefter disse resultatene (figur 2B). Differensielt uttrykte gener (DEG) mellom C12 og C13
in vitro
dyrket cellene og mellom svulster generert im og det ble identifisert på grunnlag av ganger endring ( 2) og tilsvarende statistisk signifikante p-verdier ( 0,05) . Overlapping av ° på tvers av alle undersøkte prøver viste 47 overlappende gener som ble vesentlig endret (figur 1A) som omfatter kjerne forskjellene mellom C12 og C13 cancercellepopulasjoner, hvorav, 26 og 21 gener viste forhøyet ekspresjon i C12 og C13 henholdsvis (tabellene 1 og 2).
En
, arbeidsflyt av analysene utført for genekspresjon profilering av kreft celle subpopulasjoner (CCSPs) C12 og C13
i
vitro Hotell og
i
vivo
.
B
, Identifisering av differensielt uttrykte gener mellom C12 og C13
i
vitro
dyrket celler og mellom svulster generert intramuskulær (im) og intrateratoma (det), og Gene ontologi merknader som korrelerer med svulster generert im og det
En
, PCA Resultatene er gitt som to-dimensjonale representasjoner basert på innskudds score for de to første komponentene. Diskriminering mellom kreft celle subpopulasjoner (CCSPs) C12 og C13 prøvene er vist som angitt i fargen fangst.
B
, hierarkisk clustering av prøvene ved hjelp av alle 48,803 sondeelementer på Illumina perle chip viste variasjon mellom CCSPs C12 og C13 prøver.
Forhøyet i CCSP C12
C12 vs C13 celler
C12 vs C13 im
C12 vs C13 det
Illumina probe_ID
Gene Symbol
Gene Navn
fold change
p-verdi
fold change
p-verdi
fold endring
p-verdi
ILMN_1677814ABCC3ATP-bindende kassett, sub-familien C (CFTR /MRP), medlem 310.030.00212.40010.400.003ILMN_2081070BTCbetacellulin6.380.0012.7103.290ILMN_1677108CAPN13calpain 135.800.01211.070.0015.930.005ILMN_1777190CFDcomplement faktor D (adipsin) 4.370.0013.6803.140.001ILMN_1656560DKFZP564O0823prostate androgen-regulert mucin-lignende protein 15.2503.780.0013.830.004ILMN_1815673DKK3dickkopf WNT signalveien inhibitor 32.630.0256.380.0036.270.004ILMN_2398159DKK3dickkopf WNT signalveien inhibitor 33.210.0098.700.0018.490.001ILMN_1729455EML1echinoderm microtubule assosiert protein som 13,150. 0105.680.0035.680ILMN_1743445FAM107Aamily med sekvenslikhet 107, medlem A29.680.00917.21016.300ILMN_1715748FLNCfilamin C, gamma10.7003.750.0064.380.001ILMN_1799744GALCgalactosylceramidase9.140.00112.380.00113.480ILMN_1726666GPX3glutathione peroksidase 3 (plasma) 169.140409.810368.950ILMN_1696183HBQ1hemoglobin, theta 17.6802.9903.020ILMN_2217329IAH1isoamyl acetat-hydrolyserende esterase en homolog (S. cerevisiae) 13.4309.4506.930ILMN_1673521KISS1RKISS1 receptor5.6204.1403.970ILMN_1662358MX1myxovirus (influensavirus) motstand 1, interferon-induserbar protein P78 (mus) 17.36039.970.00127.660ILMN_1709814NMRAL1NmrA lignende familie domene som inneholder 18.7409.41010.100ILMN_1680339PDGFRLplatelet-avledet vekstfaktor reseptor-like2.950.0035.200.0015.310.001ILMN_1792506PLA1Aphospholipase A1-medlem A4.8402.4902.840.003ILMN_1736533RND2Rho familie GTPase 26.800.0017.360.0016.500.002ILMN_1726928TCEA3transcription forlengelse faktor A (SII ), 312.4903.970.0015.620ILMN_1760245TMEM42transmembrane protein 426.780.0015.260.0015.190ILMN_1713990TRIP6thyroid hormonreseptor Interactor 63.370.0016.210.0015.120.004ILMN_1670377ZNF20zinc finger protein 203.950.0016.4905.680ILMN_1798533ZNF22zinc finger protein 227.7206.7206.570ILMN_2117904ZNF22zinc finger protein 227.6906.5107.660ILMN_1728710ZNF816Azinc finger protein 8166.510.0017.040.0017.220 ILMN_1802053ZNF91zinc finger protein 914.180.0063.9003.770.001Table 1. differensielt uttrykte gener mellom kreftcelle subpopulasjoner (CCSPs) C12 og C13
i
vitro
dyrket celler og mellom svulster generert intramuskulær (im) og intrateratoma (det).
Verdier på null (0) = mindre enn 0,001 CSV ned CSV Forhøyet i CCSP C13
C13 vs C12 celler
C13 vs C12 im
C13 vs C12 det
NAVN
Gene Symbol
Gene Navn
fold change
p-verdi
fold change
p-verdi
fold change
p-verdi
ILMN_1802167ALDH1L1aldehyde dehydrogenase en familie, medlem L15.1103.870.0016.570.001ILMN_1805410C15orf48chromosome 15 åpne leserammen 488.380.0073.060.0092.830.002ILMN_1774287CFBcomplement faktor B4.450.0013.500.0015.350ILMN_1810942CYP3A5cytochrome P450, familie tre, underfamilien A, polypeptid 54.870.0115.760.0179.230.007ILMN_1725597FXYD4FXYD domene som inneholder ion transport regulator 44,570. 0056.080.0056.800.004ILMN_1660973GAD1glutamate decarboxylase 15.440.0012.520.0022.550.001ILMN_1712082GCNT3glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type5.900.0093.6504.190.002ILMN_1739813HYAL1hyaluronoglucosaminidase 14.030.00815.84014.140ILMN_2314417HYAL1hyaluronoglucosaminidase 12.430.0046.050.0025.650.001ILMN_1778010IL32interleukin 322.870.0096.450.0015.180ILMN_1705814KRT80keratin 803.990.0153.840 .0023.570ILMN_1692223LCN2lipocalin 220.320.0052.500.0023.820.006ILMN_1814270LY6Dlymphocyte antigen 6 kompleks, locus D10.2909.520.00212.990ILMN_1802780M160CD163 molekyl-liknende 13.290.0015.320.0044.830.001ILMN_1651568MUC13mucin 13, celleoverflaten associated4.570.0053.980.0027.130ILMN_1709809NHP2L1NHP2 ikke-histon kromosom protein 2-aktig 1 (S. cerevisiae) 11.1407.9505.260.001ILMN_1773389PLTPphospholipid overføring protein6.3803.280.0034.610.006ILMN_1713829PTGESprostaglandin E synthase5.9108.5309.180ILMN_1651429SELMselenoprotein M2.530.0013.510.0023.800.001ILMN_1683670SLC10A2solute bærer familie 10 (natrium /gallesyre kotransporter), medlem 25.650.00115.1105.140.006ILMN_1739001TACSTD2tumor-forbundet kalsium signal svinger 276.1505.310.0125.460.004ILMN_1725387TMEM200Atransmembrane protein 200A4.540.0047.310.0047.950.003Table 2. differensielt uttrykte gener mellom kreftcelle subpopulasjoner (CCSPs) C13 og C12
i
vitro
dyrket cellene og mellom svulster generert intramuskulær (im) og intrateratoma (det)
Verdier på null (0) = mindre enn 0,001 CSV ned CSV
mikromiljøet -. avhengig svulst genuttrykk profil
for å undersøke genuttrykket profilen av CCSP C12 og C13 – avledet svulster som en refleksjon av samspillet mellom kreftceller og svulsten mikromiljøet (figur 1B), søkte vi gen sett berikelse analyse (GSEA) [39] for å vurdere om forskjellige gensettene var statistisk signifikant. For dette formålet brukte vi totalt 3279 gensettene som er publisert i Molecular Signaturer Database of GSEA offisielle nettside (https://broadinstitute.org/gsea). GSEA oppdager anrikning av hele sett med funksjonelt-relaterte grupper av gener ved å sammenligne uttrykk data med utvalgte gensettene fra tilgjengelige genet sett databaser. De gensettene med nominell p-verdi 0,05 (NOM p) og FDR q-verdi 0,05 ble brukt for å minimere identifisering av falske positiver i GSEA analyse. Av de 3279 gensettene som ble testet i den C12 i.m versus i.t. sammenligning, 401 gensettene anriket med C12 i.t., og 43 gensettene anriket med C12 i.m. Videre, i C13 i.m versus i.t. sammenligning ble 120 sett anriket med C13 i.t. klasse, og 43 gensettene korrelert med C13 i.m klasse (tabell 3). For å tolke denne store mengder data effektivt, brukte vi LEA verktøy for GSEA programvare, trekke ut kjernen genet medlemmer av beriket gensettene som bidrar mest til de tilsvarende ES verdier. Ved å ta i betraktning bare ledende edge gener, genererte vi 4 genet lister som representerer de viktigste undergruppene for C12 i.m, C12 i.t., C13 i.m og C13 i.t. Figur 3 viser de 100 mest differensielt uttrykte gener rangert etter GSEA for C12 og C13
in vitro
dyrket celler (figur 3A) og for C12 i.m og i.t. (figur 3B) og C13 i.m og i.t. (Figur 3C).
Beriket gensettene
Gene Set Name Ver.2.5
Gene Sett Størrelse
ES
NES
NOM p
FDR q
C12 i.m DAC_IFN_BLADDER_UP17-0.755-2.27700GNF2_IGF125-0.667-2.18200.002GNF2_LYN26-0.630-2.15000.003MODULE_345114-0.495-2.22300.003MODULE_436124-0.449-2.08200.006MODULE_7121-0.633-2.01400.01IFN_BETA_UP65-0.477-1.96700.011MODULE_171128-0.428-1.97900.014PROTEASOME17-0.588-1.7620.0060.045ANDROGEN_AND_ESTROGEN_METABOLISM23-0.552-1.7910.010.038 C12 i.tHSA04512_ECM_RECEPTOR_INTERACTION850.7942.65200HSA01430_CELL_COMMUNICATION1350.7082.51600DNA_REPLICATION_REACTOME440.6912.10400.002CANCER_UNDIFFERENTIATED_META_UP680.6412.08300.003HSA04350_TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY880.5721.94500.012CELL_ADHESION1710.5181.86700.022HSA04310_WNT_SIGNALING_PATHWAY1470.5151.82700.03CELL_CYCLE770.5651.8520.0010.024HSA05217_BASAL_CELL_CARCINOMA550.6171.9400.0010.013SRC_ONCOGENIC_SIGNATURE580.5621.7530.0060.044 C13 i.m BECKER_TAMOXIFEN_RESISTANT_UP38-0.487-3.12600DSRNA_UP36-0.436-2.13200CMV_8HRS_UP32-0.451-2.08800MODULE_35528-0.416-2.10900DAC_IFN_BLADDER_UP17-0.535-2.21300.001HPV31_DN48-0.379-2.16700.002CMV_24HRS_UP72-0.263-1.26100.007NF90_UP24-0.487-1.92600.008RIBAVIRIN_RSV_UP22-0.409-1.79800.016ET743_RESIST_UP17-0.385-1.68900.036C13 den HSA01032_GLYCAN_STRUCTURES_DEGRADATION300.5931.59000.002MYC_ONCOGENIC_SIGNATURE1900.4941.52100.006RAS_ONCOGENIC_SIGNATURE2490.4491.39600.029HSA04910_INSULIN_SIGNALING_PATHWAY1350.4541.3860.0010.032HSA04012_ERBB_SIGNALING_PATHWAY870.4851.4330.0020.019HSA04370_VEGF_SIGNALING_PATHWAY700.4821.4150.0040.023HSA04150_MTOR_SIGNALING_PATHWAY480.5201.4770.0050.011HSA04512_ECM_RECEPTOR_INTERACTION850.4541.3350.0120.052HSA04330_NOTCH_SIGNALING_PATHWAY460.4881.3810.020.033HSA00100_BIOSYNTHESIS_OF_STEROIDS240.5421.4180.0310.022Table 3. Representant beriket gensettene for CCSPs C12 og C13-avledede svulster generert intramuskulær (im) og intrateratoma (det).
Verdier på null (0) = mindre enn 0.001MSigDB Ver.2.5ES = Enrichment Score NES = Normalisert Enrichment Resultat FDR = False funnraten CSV ned CSV
De 100 mest differensielt uttrykte gener mellom kreftcelle subpopulasjoner (CCSPs) C12 og C13
i
vitro
dyrket celler (
A
), CCSP C12-deriverte svulster generert intramuskulær (im) og intrateratoma (den) (
B
) og CCSP C13-avledet svulster generert im og det (
C
). Differensial uttrykket av gener ble beregnet i henhold til signal-til-støy beregninger. De 50 symboler representerer gener som ble forhøyet i tumorer utviklet i.t. De neste 50 symboler representerer gener som forhøyet i tumorer utviklet i.m. Gener som er plassert høyere i hver av de to 50 grupper genet indikerer en større forskjell nivå enn gener som befinner seg på lavere posisjoner. Expression verdier er representert som vist i fargen bildetekst.
Gene ontologi (GO) berikelse analyse
De resulterende genet listene ble utsatt for GO berikelse analyse [40], med gorilla web-basert programvare. Inngangen til denne analysen besto av lister over ledende gener og en bakgrunn liste som representerer alle genene testet i Illumina genuttrykk plattform. Med et konservativt kriterium for Bonferroni justert p-verdi 0.005, fikk vi to lister med beriket GO vilkår pr CCSP, som representerer interaksjonen med to forskjellige microenvironments. Viktigere, i den murine nisje, ble bare et begrenset antall av forskjeller mellom de to CCSPs funnet (figur 4A, C). 10 og 7 GO vilkårene ble beriket i CCSP C12 og C13 henholdsvis. Alle de 7 GO vilkår som ble beriket i CCSP C13 i.m ble også beriket i CCSP C12 i.m med liknende berikelse score (ES) verdier. Alle slike utpekte GO betingelser er relatert til immunresponssystemet og som er involvert i «celle respons på en stimulus som produseres av en levende organisme». Anrikning av disse GO betingelser viser en endring i den tilstand eller aktiviteten av den CCPSs som et resultat av interaksjon med det heterologe ytre miljø som ville være forventet. På den annen side, i den hESC-avledede mikro langt større forskjeller mellom de to CCSPs ble observert (figur 4B, D). Ccsp C12 oppviste anrikning av flere GO termer relatert til cellesyklusen, noe som kanskje reflekterer effekten av hESC-avledet mikromiljø som en mer støtte nisje i motsetning til den murine mikromiljøet. Videre GO termer relatert til prosessen med epiteliale til mesenchymale overgang (EMT) ble også anriket på C12-avledede tumorer i hESC-avledet mikromiljøet. I forhold til C12, CCSP C13 avledet svulster i hESC-avledet mikroutstillings bare noen få, lav ES verdi beriket GO vilkår, hovedsakelig knyttet til metabolske prosesser. Listene over beriket GO vilkår i C12 og C13 – avledet svulster generert i.m og i.t. er presentert i tabell S1.
Statistisk signifikante GSEA gensettene utsatt for forkantanalyse (LEA) og de resulterende gener ble gruppert i ontologiske kommentarer av biologiske prosess kategorier. De kakediagrammer presentere beriket GO merknader og deres matchende berikelse score (ES) for:
En
, GO merknader oppregulert i C12 svulster generert i.m sammenlignet med C12 svulster generert i.t.
B
, GO merknader oppregulert i C12 svulster generert i.t. sammenlignet med C12 svulster generert i.m (20 GO merknader med de høyeste berikelse score er vist).
C
, GO merknader opp regulert i C13 svulster generert i.m sammenlignet med C13 svulster generert i.t.
D
, GO merknader oppregulert i C13 svulster genereres det sammenlignet med C13 svulster generert im
Til sammen viser denne analysen de forskjellige veier av interaksjoner mellom CCSPs C12 og C13 med mikromiljøet under prosessen for tumorprogresjon. I motsetning til den konvensjonelle murine modellen demonstrerer hESC-baserte modellen har en mer kompleks kreftcelle-mikromiljøet interaksjon, som kan tilveiebringe et mer autentisk refleksjon av abonnenten forholdet mellom tumorcellene hos en pasient og de komplekse humane vev som omgir tumoren.
