Abstract
ursolic syre (UA), en naturlig penta triterpenoid karboksylsyre distribuert i medisinske urter, utøver antitumor effekter og fremstår som en lovende sammensatt for kreft forebygging og behandling, men dens avgiftsvirkningsmekanismer i tykktarm kreft celler forblir i stor grad ukjent. Her har vi identifisert de molekylære mekanismer som UA hemmet celleproliferasjon og indusert apoptose i menneskets tykktarm kreft SW480 og LoVo celler. Behandling med UA ført til betydelige hemninger i celle levedyktighet og klone dannelse og endringer i cellen morfologi og spredning. UA også undertrykt tykktarmskreft cellemigrasjon ved å hemme MMP9 og oppregulering CDH1 uttrykk. Videre undersøkelser viste at UA hemmet fosforylering av Akt og ERK proteiner. Forbehandling med en Akt eller ERK-spesifikk hemmer betydelig avskaffet spredning hemming av UA. UA også i betydelig grad hemmet tykktarmskreftcelle COX-2 ekspresjon og PGE2 produksjon. Forbehandling med COX-2-hemmer (celecoxib) avskaffet UA-indusert celleproliferasjon. Videre fant vi at UA effektivt fremmet NF-kB og p300 trans fra cellekjerner til cytoplasma, og svekket P300-mediert acetylering av NF-kB og CREB2. Forbehandling med et P300-inhibitor (roscovitine) avskaffet UA-indusert celleproliferasjon, som er speilvendt av P300 overekspresjon. Videre UA behandling indusert koloncancer celle apoptose, øket spaltning av PARP, caspase-3 og 9, og trigget frigjøring av cytokrom c fra mitokondrie-inter-membran plass inn i cytosol. Disse resultatene indikerer at UA hemmer celleproliferasjon og induserer apoptose i tykktarmskreftceller ved samtidig modulasjon av de flere signalveier som MMP9 /CDH1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /NF-kB /CREB2, og cytokrom c /caspase trasé
Citation. Wang J, Liu L, Qiu H, Zhang X, Guo W, Chen W, et al. (2013) ursolic Acid Samtidig er målrettet mot flere signalveier å undertrykke spredning og indusere apoptose i Colon kreftceller. PLoS ONE 8 (5): e63872. doi: 10,1371 /journal.pone.0063872
Redaktør: Chunhong Yan, Albany Medical College, USA
mottatt: 04.01.2013; Godkjent: 10 april 2013; Publisert: May 30, 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Natural Science Foundation National of China (81071687, 81272195), Statens «863 Program» of China (SS2012AA020403), Stiftelsen doktorgradsprogrammene for Ministry of Education of China (20110171110077), og staten Key Laboratory of Oncology i Sør-Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært tilhørighet (e) av Wenlin Huang til «Guangzhou Double Bioproduct Inc «. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Colon og endetarmskreft (colorectal cancer, CRC), den tredje vanligste kreftformen i verden har blitt en av de viktigste årsakene til dødsfall fra kreft [1]. Kirurgi, cellegift og strålebehandling er de primære og vanlige behandlinger for tykktarmskreft. Selv om kjemoterapi er adjuvant til kirurgi, kur rate av tykktarmskreft var fortsatt ikke ideelt, spesielt for de senere stadium pasientene. Den metastase og tilbakefall etter kirurgi eller de som produseres kjemoterapi motstand fører vanligvis til den endelige døden. Dermed har komplementære og alternative behandlingsstrategi bli nødvendig å øke overlevelsen av tykktarmskreftpasienter. Kinesisk urtemedisin blir mer og mer populært i kreftbehandling kombinert med konvensjonell terapi på grunn av sin naturlige opprinnelse, lav toksisitet og effektivitet for å forebygge og behandle kreft, inkludert tykktarmskreft [2].
ursolic syre (UA) , en naturlig penta triterpenoid karboksylsyre ekstraheres fra medisinske urter og spiselige planter, utøver et bredt spekter av biologiske aktiviteter, inkludert hepatobeskyttende [3], anti-bakterielle [4], antivirale [5], og anti-inflammatorisk [6]. Videre har det vært implisert i forebygging og beskyttelse mot kreft [7]. Sin anti-tumor virkning er tilskrevet dens evne til å forhindre tumorgenese [8], hemme kreftcelleformering, og induserer kreft celle apoptose [6], [9]. De signalbaner som er involvert i UA-aktivitet kan være forskjellig i forskjellige kreftcellelinjer, og partielle signalveier kan bli regulert samtidig eller suksessivt, og synergized for å bidra til UA behandling. Men de nøyaktige molekylære mekanismer for UA involvert i spredning hemming og apoptose induksjon i tykktarmskreft var fortsatt ikke klar nok.
Enzymet cyklooksygenase-2 (COX-2), som er ansvarlig for katalyse av konvertering av arakidonsyre syre til prostaglandiner og tromboksan A
2, er kjent for å være involvert i flere patofysiologiske prosesser, herunder in fl inflammasjon og tumorigenesis [10], [11]. COX-2 er umulig å oppdage i de fleste normale vev, men det er ofte overuttrykt i mange premaligne, ondartede og metastatisk kreft hos mennesker, inkludert tykktarmskreft, med sin nedstrøms produkt prostaglandin E2 (PGE2). Den økende bevis angitte nøkkelroller av COX-2 i kreftutvikling og kreft progresjon er gjennom deltakelse i startfasen, fremme svulst vedlikehold og progresjon, og oppmuntre tumor metastatisk spredning [12], [13]. Den selektive inhibering av COX-2-aktivitet reverserer carcinogenesis av tykktarmskreft og er blitt vist å indusere apoptose og hemmer proliferasjon og angiogenese [14], [15]. Noen av inhibitorer også har vist seg å være potensielt attraktiv kjemoterapeutiske medikamenter for behandling av kolorektal cancer i kombinasjon med andre vanlige kjemoterapeutiske midler [16], [17]. COX-2 ekspresjon er strengt regulert på transkripsjonsnivået ved binding av transactivators så som NF-kB, CREB2 og ko-aktivatorer såsom p300 til tilsvarende steder som ligger i dens promoter [18] – [21]. Men om UA spiller sin anti-tumor effekt gjennom reguleringer av COX-2, NF-kB og p300 signale er fortsatt dårlig forstått i human kolorektal kreft, og de tilhørende underliggende signalveier forblir unnvikende.
Her vi evaluert effekten av UA på tykktarmskreft celleproliferasjon, migrering og apoptose i tykktarm kreft celler og analysert regulering på viktige proteiner av noen signalveier involvert i celleproliferasjon, migrasjon og apoptose. Resultatene viste at anti-spredning, anti-migrerings og pro-apoptotiske virkninger av UA i kolon kreftcellene ble formidlet gjennom samtidig modulering av flere signalveier, inklusive MMP9 /CDH1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /NF -κB /CREB2 og cytokrom c /caspase-avhengige veier. Vår studie ikke bare avdekker de underliggende molekylære mekanismer av UA handling i menneskelige tykktarmskreftceller, men antyder også det store potensialet for UA i human kolorektal kreft forebygging og behandling.
Resultater
UA hemmet Cell spredning og Clone Dannelse og Induced Cell morfologi Endre
Vi analyserte første kvantitativt effekten av UA på celleproliferasjon i 48 timer etter behandling i SW480 og LoVo celler ved en MTT analyse. Behandling med UA ved en dose på 10 uM til 60 uM i betydelig grad hemmet cellelevedyktighet på en konsentrasjonsavhengig måte, noe som resulterer i en 20% til en 83% inhibering i SW480-celler og en 5% til 55% inhibering i LoVo-celler, henholdsvis ( fig. 1A). Vi har også bestemt virkningene av UA på tumorceller clonogenicity. UA inhiberte også markert klon formasjon på en doseavhengig måte (fig. 1B), som resulterer i en signifikant inhibering av klon formasjonsforhold i både SW480 og LoVo-celler (fig. 1C).
human koloncancer-cellelinjen SW480 og LoVo og normal cellelinjer CCD841 og LO2 ble behandlet med UA på de angitte doser. Ved 48 timer etter behandling, ble cellenes levedyktighet bestemt ved en MTT-assay (A, E), og den tumorcelle-induserte klon-dannelse ble analysert (B, C). Endringer i cellemorfologi, spre og blebbing i celler behandlet uten eller med UA (10 uM og 20 uM) i 48 timer ble det observert og cellene ble fotografert ved hjelp av et mikroskop utstyrt med digitalkameraet (D). Den prosentvise cellelevedyktigheten eller klon dannelse graden i hver behandlingsgruppe ble beregnet i forhold til celler behandlet med DMSO bærerkontroll. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. *,
P
. 0,05, signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene og DMSO kontrollgrupper
Vi neste analysert UA-mediert endringer i celle morfologi og spredning i SW480 og LoVo celler . Behandling av cellene med DMSO, et kjøretøy kontroll, dannet en celle laget, og ble observert mer spredning, filopodia og blebbing. I motsetning til dette forårsaket UA behandling en markert reduksjon av celle-til-celle-kontakt, og hadde lavere sprer seg med færre dannelse av filopodia i begge SW480 og LoVo-celler og indusert membran blebbing i celle behandlet med UA (fig. 1 D).
Vi evaluerte også effekten av UA på celleproliferasjon i menneskelig normal cellelinjer CCD841 og LO2. Behandling med UA ved doser ≤20 mikrometer ikke hemme cellenes levedyktighet i både normale cellelinjer, demonstrere potensialet spesifisitet av UA i hemme tumor celleproliferasjon ved dose ≤20 mikrometer.
UA Målrettet MMP9 /CDH1 Signa å hemme cellemigrasjon
Vi neste undersøkt effekten av UA på celle migrasjon ved å ansette en ripe analysen. I samsvar med data fra celleproliferasjon og clonogenicity hemming, behandling med UA ved 5 uM effektivt inhiberte cellemigrering i både SW480 og LoVo-celler (Fig. 2A). Den delen av gapet eller såre plass mellom cellelagene etter at en ripe ble okkupert helt av migrerende celler etter 56 timer. I motsetning til dette ble den tomme plass av cellene som ikke opptas av de vandrende celler behandlet med UA (fig. 2A).
(A), Cellemigrering ble analysert ved hjelp av en skrape assay. SW480 og LoVo celler ble dyrket til full konfluens. Av cellemonolagene ble såret med en steril pipette, og ble vasket med medium for å fjerne frigjorte celler fra platene. Celler ble forlatt enten ubehandlet eller behandlet med angitte doser av UA. Etter 56 timer ble såret gapet observert og cellene ble fotografert. (B, C), SW480-celler ble behandlet med UA ved de angitte doser. 56 timer etter behandling, ble ekspresjonen av MMP9 (B) eller CDH1 (C) kvantitativt analysert ved hjelp av et sanntids qPCR-analyse. *,
P
. 0,05, signifikante forskjeller mellom UA-behandlede grupper og DMSO-behandlede grupper
MMP9 og CDH1 er to viktige molekyler involvert i celle invasjon og migrasjonsmessige signalveien [22], [23]. Vi neste analysert kvantitativt effekten av UA på uttrykk for MMP9 og CDH1 av en real-time qPCR analyse i SW480 celler. Som forventet, UA 20 uM og 40 uM markert undertrykket mRNA-nivået av MMP9-genet (Fig. 2B), mens ført UA behandling til en betydelig økning i CDH1 mRNA-ekspresjon (Fig. 2C). Disse resultatene indikerer at UA spiller en viktig rolle i å undertrykke migrasjon og invasjon via modulering av MMP9 og CDH1 signalering.
UA inaktivert Akt og ERK Signa å hemme Cell Proliferation
PI3K /Akt og MAPK signalveier spiller avgjørende roller i å kontrollere cellevekst og tumorigenesis. For å evaluere hvorvidt UA er i stand til å modulere PI3K /Akt og MAPK signalering for å føre til hemming av celleproliferasjon, undersøkte vi effekten av UA på fosforyleringen av signalmolekyler i disse to baner i SW480-celler ved hjelp av Western blot-analyse. Behandling med UA ved 20 uM betydelig hemmet ekspresjon av fosforylert Akt og mTOR-protein, men øket fosforylert PTEN ekspresjon (Fig. 3A). Vi oppdaget også en markert reduksjon i de fosforylerte ERK proteiner i en doseavhengig måte (fig. 3B). Nivåene av det totale protein ekspresjon av Akt, mTOR, PTEN (Fig. 3A) og ERK (fig. 3B) ble ikke endret.
(A, B), ble SW480-celler behandlet med UA på 20 uM eller 40 uM i 48 timer. Uttrykket av fosforylert eller total PI3K, Akt, mTOR, PTEN, JNK, ERK1 /2 proteinene ble oppdaget av Western blot. GAPDH ble anvendt som en kontrollprøve for lasting. (C, D), SW480-celler ble behandlet med et PI3K /akt-selektiv inhibitor LY294002 (LY, 5 pM) (C) eller med en ERK-selektiv inhibitor U0126 (20 uM) (D) i 4 timer, og deretter behandles med UA på 20 mikrometer. Ved 48 timer etter behandling, ble cellenes levedyktighet bestemt ved MTT-analyse. Den prosentvise cellelevedyktighet i hver behandlingsgruppe ble beregnet i forhold til celler behandlet med bærerkontrollen DMSO. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. *,
P
0,05, signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene og kontrollgruppene
For ytterligere å bekrefte involvering av Akt og ERK signalveier i UA-mediert hemming av. celleproliferasjon, vi neste analysert effektene av Akt eller ERK-selektiv inhibitor på UA-mediert proliferasjon hemming i SW480 celler. Forbehandling av celler med PI3K /akt-inhibitor LY294002 (LY) ved 5 uM (fig. 3C) eller ERK Inhibitor U0126 20 uM (fig. 3D) hemmet celleproliferasjon, og en kombinasjon av UA (20 uM) med disse inhibitorene noe økt inhibering av celleproliferasjon (fig. 3C og 3D). Men tilsetning av UA ikke vesentlig endrer spredning hemning i SW480-celler forbehandlet med Akt inhibitor LY (fig. 3C) eller ERK-inhibitor U0126 (fig. 3D), noe som bekrefter rollen til UA i reguleringen av Akt og ERK-signalering.
UA Målrettet COX-2 PGE2 og signalering for å inhibere celleproliferasjon
COX-2 ekspresjon er vist å oppregulere EGFR, PI3K /Akt og ERK signalering, for derved å indusere tumorcelleformering, migrering og invasjon [24], [25]. For å avgjøre om UA-mediert hemming av celleproliferasjon er mediert gjennom modulering av COX-2 signalisering i tykktarm kreft celler, vurderte vi effekten av UA på COX-2 uttrykk ved protein og mRNA nivåer av Western blot og RT-PCR. Behandling med UA i doser på 20 uM og 40 uM dramatisk hemmet ekspresjon av COX-2-protein (fig. 4A) og mRNA (fig. 4B) i SW480 og LoVo-celler. Den kvantitative densitometry Analysen viste også at UA ved 20 uM og 40 uM i betydelig grad undertrykkes COX-2-mRNA i begge SW480 og LoVo-celler (fig. 4C).
(A-D), ble SW480 og LoVo-celler behandles med UA i 48 timer. Ekspresjon av COX-2-protein (A) og mRNA (B) ble analysert ved Western blotting og RT-PCR, respektivt. Densitetene til COX-2-mRNA og forholdet av COX-2 /GAPDH ble kvantitativt analysert (C). Produksjonen av PGE2 ble påvist ved Elsia analyse (D). GAPDH ble brukt som kontroller for utvalg lasting. (E), SW480-celler ble behandlet med en COX-2-selektiv inhibitor celecoxib (CB, 20 mM) i 4 timer, og deretter behandlet med UA ved 20 uM. Ved 48 timer etter behandling, ble cellenes levedyktighet bestemt ved MTT-analyse. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. *,
P
. 0,05, signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene og kontrollgruppene
PGE2 er en nedstrøms produkt av COX-2, og det er syntetisert via cyklooksygenase og prostaglandin syntase veier. Vi behandlet SW480 og LoVo celler med UA på 20 mikrometer og bestemt effekten av UA på PGE2 produksjon. Resultatene viste at UA behandling signifikant redusert PGE2 produksjon i begge celler (Fig. 4D).
For ytterligere å bekrefte at det UA-mediert inhibering av celleproliferasjon er gjennom regulering av COX-2-signalisering i tykktarmskreftceller, vi forbehandlet SW480-celler med celecoxib (CB, 10 pM), en COX-2-selektiv inhibitor, og testet effekten av UA på celecoxib-mediert inhibering av celleproliferasjon. Som vist på fig. 4E, forbehandling med celecoxib (CB) betraktelig hemmet cellelevedyktigheten, mens UA 20 uM ikke vesentlig endre inhibering mediert av celecoxib. Disse resultatene viste at inhibering av tykktarmskreft celleformering ved UA kan også delvis mediert ved inhibering av COX-2-signalering.
UA indusert translokasjon av NF-kB og p300 fra cellekjerner til Cytoplasma
ekspresjon av COX-2 er regulert av translokasjon og interaksjonen av transaktivator NF-kB og coactivator p300 i tumorcellekjerner. Vi neste utført immunfluorescens analyse for å evaluere effekten av UA på kjernefysiske lokalisering og samhandling av NF-kB og p300 i tykktarm kreft SW480 og LoVo celler. Vi har oppdaget at den konstitutive translokasjon av p50 og p65 NF-kB og p300 til cellekjerner (fig. 5A og 5B) og ko-lokalisering av p65 med p50 (fig. 5A) eller p300 (fig. 5B) i både SW480 og LoVo celler. Behandling med UA ved 20 uM og 40 uM indusert translokasjon av NF-kB (Fig. 5A) og P300 (Fig. 5B) fra cellekjerner til cytoplasma. Resultatene indikerer at UA rettet mot NF-kB og p300 signalering ved å fremme deres translokasjon fra cellekjerner til cytoplasma i tykktarmskreftceller.
Humant SW480 og LoVo-celler dyrket på kammers objektglass ble behandlet med UA. Ved 48 timer etter behandling, ble sub-cellulære lokalisering av p50, p65 og p300 og ko-lokalisering av p65 til p50 (A) eller p300 (B) undersøkt ved hjelp av konfokal mikroskopi-analyse med et konfokalt mikroskop. Mer enn 100 celler ble inspisert per forsøk, og celler med typisk morfologi ble presentert.
UA Målrettet p300 Signa å hemme NF-kB /CREB-2 acetvlering og Cell Proliferation
P300-mediert acetylering av transactivators og deres binding til COX-2-gen fremme spiller avgjørende roller i COX-2 ekspresjon. Vi bestemte neste effekten av UA på P300-mediert acetylering av transactivators NF-kB og CREB2 i tykktarm kreft SW480 celler. Behandling med UA 20 uM i P300-transfekterte SW480 celler markert hemmet de acetylerte nivåene av p50 /p65 og CREB-2-proteiner (fig. 6A), mens ekspresjonen av disse proteinene ikke forandret (fig. 6B).
(A, B), SW480-celler ble transfektert med FLAG-P300 i 24 timer og deretter behandlet med UA i 48 timer. Atom ekstrakter ble utarbeidet og p50, p65 og CREB2 ble immunopresipitert med en acetyl-lysin antistoff. De acetylerte proteiner (A) og protein ekspresjon (B) av p50, p65 eller CREB2 ble analysert ved hjelp av Western blot. (C, D), SW480-celler ble forbehandlet med en p300-selektiv inhibitor roscovitine (ROSC, 20 pM) (C), eller transfektert med en p300-uttrykkende vektor (D) i 8 timer, og deretter behandlet med UA. Ved 40 timer etter behandling, ble cellelevedyktigheten bestemt. Tom vektor (EV) ble anvendt en transfeksjon kontroll. Hver søyle representerer middelverdi ± standardavvik for tre eksperimenter. *,
P
. 0,05, signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene og kontrollgruppene
Hvis du vil kontrollere hvilken rolle UA i regulering av p300 signalisering i tykktarm kreft celler, vi forbehandlet med roscovitine, en inhibitor av P300 (fig. 6C), eller transfektert med en p300-uttrykkende vektor i SW480-celler (fig. 6D), og effekten av UA på roscovitine eller p300-mediert celle proliferasjon ble analysert. Behandling av celler med roscovitine (ROSC, 20 mm) betydelig hemmet celle levedyktighet, mens UA 20 mikrometer ikke signifikant endre roscovitine hemming (Fig. 6C). I motsetning til dette, p300 overekspresjon vesentlig tilbake UA-mediert inhibering i SW480-celler sammenlignet med transfeksjon med en tom vektor (EV) (fig. 6D). Disse resultater viser at p300 er et viktig mål for UA og at UA-indusert hemming av celleproliferasjon er mediert i det minste delvis inn i p300 signalveien i tykktarmskreftceller.
UA Målrettet Cytokrom c /caspase signale for å indusere celle apoptose
Vi undersøkte også effekten av UA på celle apoptose i tykktarmskreftceller ved en Annexin V-farging baserte FACS-analyse etter 48 timer etter behandling. Behandling av celler med UA ved 20 uM og 40 uM førte til en doseavhengig induksjon av de positive apoptotiske celler (fig. 7A), som fører til en 6,3% til 14,2% induksjon i SW480 celler, og 2,8% til 53,4% induksjon i LoVo -celler (fig. 7B). Aktivering av kaspaser er en viktig hendelse i nedstrøms apoptotisk reaksjonsvei. Vi neste fastslått hvorvidt apoptose indusert ved UA er knyttet til den økte aktiveringen av caspase reaksjonsveien i SW480 celler. Effektene av UA ved ekspresjon av de spaltede proteiner av tre viktige apoptose-relaterte proteiner: PARP, caspase-3 og kaspase-9, ble påvist etter 48 timer etter behandling ved Western blot-analyse. Som vist på fig. 7C, behandling med UA ved 20 uM og 40 uM resultert i en markert økning av det spaltede PARP, kaspase-3 og kaspase-9-proteiner, noe som tyder på at UA kunne fungere som en viktig og spesifikk mediator for å lette aktivering av kaspase kaskader.
SW480 og LoVo celler ble behandlet med UA (20 mikrometer og 40 mikrometer). Ved 48 timer etter behandling, ble apoptotsis bestemt ved en AnnexinV-FITC fargings-baserte FACS-analyse (A, B). Nivåene av de spaltede caspase-3, caspase-9 og PARP-proteiner i SW480 celler ble analysert ved hjelp av Western blot (C). Frigjøringen av cytokrom c (Cyto-c) fra inter-mitokondrie plass i cytosol ble bestemt ved immunofluorescens bildeanalyse (D). SW480-celler ble transfektert med p300 siRNA i 24 timer, og etterfulgt av behandling med UA (20 uM). Ved 48 timer etter behandling, ble apoptotsis bestemt ved FACS-analyse (E). Den apoptose er representert ved relative prosentandeler av apoptotiske celler versus at i DMSO-behandlede celler. *,
P
. 0,05, signifikante forskjeller mellom UA-behandlede grupper og kontrollgruppene
cytokrom c (Cyto-c) er oppstrøms molekyl av caspase- avhengig apoptose veien. Vi utførte neste immunfluorescens imaging (IFI) analyse for å overvåke endringer i den subcellulære lokalisering av Cyto-c i UA-behandlede SW480 og LoVo-celler for å bestemme om UA kan utløse Cyto-c frigivelse. Behandling med UA (20 mm) effektivt fremmet utgivelsen av Cyto-c fra inter-mitokondrie plass i cytosol (fig. 7D). Disse resultatene indikerer at UA koordinert Cyto-c frigjøring fra det intermitokondriemembranen plass og mulig nedstrøms caspaseaktivering i cytosol.
Vi undersøkte også effekten av inhibering av p300 på apoptose indusert ved UA. De SW480-celler ble transfektert med en spesifikk p300 siRNA (Si-P300), og deretter behandlet med UA (20 uM), og effekten av inhibering av p300 på UA-mediert apoptose ble analysert. Resultatene viste at knockdown av P300-ekspresjon ved si-P300 markert forbedret apoptoseinduksjon mediert av UA (fig. 7E), noe som bekrefter rollen til P300 signalering i regulering UA-indusert apoptose i kolon kreftceller.
diskusjon
i denne studien, analyserte vi responsen til humane kolon kreftceller til UA behandling. UA signifikant hemmet celleproliferasjon, migrasjon og apoptose i en doseavhengig måte. Vi viste at UA indusert cytokrom c release, og dermed forårsaket caspaseaktivering og apoptose. UA også regulert ekspresjon av MMP9 og CDH1 gener og inhiberte fosforylering av Akt og ERK-proteiner, noe som fører til en inaktivering av cellemigrering og spredningsrelaterte signalveier. Vår studie viste også at UA trykt COX-2 uttrykk og PGE2 produksjon. Videre viste vi at UA-formidlet hemming av COX-2 ekspresjon og celleproliferasjon er mediert ved samtidig modulasjon av P300, NF-kB, og CREB2 signalering. UA hemmet P300-mediert acetylering av NF-kB og CREB2, og også fremmet translokasjon av NF-kB p65 og p300 fra cellekjerner til cytoplasma. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som viste at UA samtidig rettet mot flere signalveier for å hindre tykktarmskreft celleproliferasjon og indusere apoptose
UA har blitt nøye studert i det siste.; hovedsakelig som en anti-kreft-forbindelse og for dens hjerte-beskyttende egenskaper. Den kontrovers av rapporter tyder på anti-angiogene og cytotoksiske effekter av UA på den ene siden og kardiovaskulære og endotel-beskyttende effekt på den andre siden. Foreløpig er det ikke tilstrekkelig bevis for å anbefale en ideell menneskelig dose. Dyrestudier tyder fordel bruk mellom 0,05-0,2% av rotte diett som UA. Forutsatt en rekke 10-40 mg /kg kroppsvekt, fordelene i rottestudier i forbindelse med UA er omtrent lik en human dose på 1.6 til 6.4 mg /kg kroppsvekt (110-440 mg for en 150 lb person).
bivirkningene av UA fra hovedsakelig omfatter to aspekter: mannlig fruktbarhet og DNA-skader. Tidligere studie har vist at UA har potensial til sperm motilitet inhibering og kan tjene som en lokal vaginal befruktnings [24], [25]. Nærmere bestemt, fører det bryte av broer i mellom celler som er snart å være sperm, og de skadede cellene deretter samle å danne symplasts i sædkanaler som er forbundet med mannlig infertilitet. UA som en anti-angiogenese, anti-kreft og lokalt anvendt hjerte stoffet kan være nyttig. Imidlertid kan den DNA-skade aktiviteten til UA også utgjøre et alvorlig problem. UA var i stand til å indusere celledød i endotelceller når konsentrasjonen oversteg 12,5 mikrometer [26].
uttrykk for COX-2 spiller en nøkkelrolle i kreft hos mennesker. COX-2 ekspresjon og PGE2 produksjon har vist seg å oppregulere PI3K /Akt og ERK signalering, for derved å indusert angiogenese, celleformering, migrering og invasjon [27], [28]. COX-2-inhibering kan resultere i celleveksthemming og apoptose og indusere epitelial-mesenkymale overgang [29] – [32]. Imidlertid er mekanismen ved hvilken COX-2 uttrykkes sterkt i tumorgenese ikke helt forstått. COX-2-transkripsjonsregulering har blitt grundig karakterisert v [33] – [35]. P300 har vist seg å være avgjørende for COX-2 ekspresjon og utøver en global virkning på COX-2-promoteren kromatinstruktur for å forbedre bindingen av transactivators [20], [21]. P300 er uttrykt i overflod i kreftceller og p300 overekspresjon forsterker COX-2 transkripsjonen aktivering [36], [37]. Det fungerer som en transkripsjon coactivator å bygge bro over promoter-bundet transactivators med transkripsjonsfaktorer i transkripsjon maskiner [20], [21]. P300 HAT acetylates histoner og dermed åpner det kromatinstruktur og økende tilgang av forsterkerelementer til transactivators. P300 HAT er også i stand til acetylering transactivators så som NF-kB, for derved å forbedre transaktivator binding [21]. I samsvar med tidligere rapporter, vår nåværende Studien viste også at p300 spiller en avgjørende rolle i å regulere NF-kB og CREB2 acetylering og celleproliferasjon i humane tykktarmskreftceller. UA målene P300 signalering for å inhibere acetylering av NF-kB og CREB2, for derved å hemme celleproliferasjon. Det har vist seg at p300 HAT er regulert av p300 fosforylering eller acetylering [38]. Det er mulig at UA undertrykker p300 fosforylering, endrer p300 HAT-konformasjon og katalytisk aktivitet, og inhiberer posttranslasjonell modifikasjon av p300 HAT, og blokkerer dermed HAT-aktivitet i kolon kreftceller. Videre studier er nødvendig for å belyse den mekanismen som UA hemmer P300 signalering.
Tidligere studier har vist at UA induserer apoptose i kreft hos mennesker [39]. Men de nøyaktige molekylære mekanismer og signalveier der UA induserer apoptose fortsatt uklare. Interessant, våre data viser at induksjonen av apoptose ved UA er i hovedsak gjennom UA-mediert aktivering av kaspase-avhengige apoptotiske reaksjonsvei. Behandling av celler med UA utløste utgivelsen av cytokrom c (Cyto-c) til cytosol, og deretter stimulert aktivering av caspases, og dermed indusert apoptose.
Vi fant også at UA rettet mot Akt og ERK-avhengige signalveier for å hindre tykktarmskreft celleproliferasjon. Den fosforylert Akt og ERK er mediatorer av celleproliferasjon og overlevelse og klinisk respons på tyrosinkinasehemmere (TKI), og en reduksjon i fosforylert Akt og ERK uttrykk er en viktig begivenhet i sensibiliserende kreftceller til TKI behandling. UA hemmet fosforylering av Akt og ERK-proteiner, noe som resulterer i en inaktivering av cellevekst og overlevelse relaterte Akt /ERK-signalveien. Våre funn har viktige implikasjoner i å utforske nye terapeutiske strategier for tykktarmskreft.
I sammendraget, viste vi at UA hemmet celleproliferasjon og migrasjon og indusert apoptose i tykktarmskreftceller ved samtidig å modulere MMP9 /CDH1, Akt /ERK COX-2 /PGE2, p300 /NF-kB /CREB2, og cytokrom c /kaspase-avhengig signalveier (fig. 8). Våre funn gir ny innsikt i de molekylære mekanismer for UA-mediert proliferasjon inhibering og induksjon av apoptose, og tyder på at UA kan være et lovende middel for forebygging og behandling av human kreft i tykktarmen.
UA hemmet celleproliferasjon og migrasjon og indusert apoptose i tykktarmskreftceller ved samtidig å modulere MMP9 /CDH1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /NF-kB /CREB2, og cytokrom c /caspase-avhengige signalveier.
Materialer og metoder
Cell Culture and Chemicals
Menneskelig tykktarmskreft cellelinjer (SW480, LoVo) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia) og dyrket i RPMI 1640 media supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 100 ig /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin, og holdt i en inkubator med en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C . I alle forsøk ble celler med 60% konfluens testet. Ursolic syre (UA), ble celecoxib og roscovitine innkjøpt fra (Sigma (St. Louis, MO). En 100 mM løsning av medikament ble fremstilt i dimetylsulfoksyd (DMSO), lagret som små alikvoter ved -20 ° C og deretter fortynnet etter nødvendig i cellekulturmedium.
celleviabilitet assay
celle~~POS=TRUNC ble bestemt ved MTT-analyse (Roche diagnose, Indianapolis, iN). i korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater (3000 celler /brønn) ble behandlet med UA på ulike doser. på 48 timer etter behandling, celle levedyktighet ble bestemt.
Colonogenic analysen
Celler belagt i seks-brønns plater ble behandlet med UA. etter 24 timer ble cellene vasket med PBS og trypsinisert. Da celler ble sådd på 100 celler /brønn på 6-brønners plater, og dispergeres jevnt ved lett risting av skålene og inkubert ved 37 ° C med 5% CO2 i 21 dager. mediet ble
