Abstract
Bakgrunn
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn. Multiple bevis tyder på at en populasjon av tumor-initiering, eller kreft stamceller (cscs) er ansvarlig for kreftutvikling og eksepsjonell legemiddelresistens, som representerer en svært viktig terapeutisk mål. Denne studien evaluerte CSC-spesifikke endringer indusert av ny generasjon taksoid SBT-1214 og en roman polyenolic sinkbindende curcuminoid, CMC2.24, i prostata cscs.
hovedfunnene
CD133
høy /CD44
høy fenotype ble isolert fra spontant udødeligpasient avledet PPT2 celler og høyt metastatiske PC3MM2 celler. Ukentlig behandling av NOD /SCID mus med PPT2- og PC3MM3-indusert svulster med SBT-1214 førte til dramatiske undertrykkelse av tumorvekst. Fire av seks PPT2 og 3 av 6 PC3MM2 svulster har vist fravær av levedyktige celler i rest tumorer.
I
vitro
, SBT-1214 (100 nM-1 um, for 72 timer) induserte om lag 60% celledød i CD133
høy /CD44
+ /høye celler dyrket på kollagen i stamcelle-medium (i motsetning til de samme doser av paclitaxel øket proliferasjon av disse cellene). Den cytotoksiske effekten ble øket når SBT-1214 ble kombinert med det CMC2.24. En stamcelle-spesifikk PCR-matrise-analyse viste at dette stoff kombinasjon mediert massiv hemming av flere konstitutivt oppregulert stamcelle-relaterte gener, inkludert nøkkel pluripotency transkripsjonsfaktorer. Viktigere, denne legemiddelkombinasjonen indusert ekspresjon av p21 og p53, som var fraværende i CD133
høy /CD44
høye celler. Levedyktige celler som overlevde dette behandlingsregime ikke lenger var i stand til å indusere sekundære kuler, viste betydelige morfologiske avvik og døde i løpet av 2-5 dager.
Konklusjoner
Vi rapporterer her at SBT-1214 alene eller i kombinasjon med CMC2.24, besitter betydelig aktivitet mot prostata CD133
høy /CD44
+ /høy tumor initiere celler. Dette stoffet kombinasjonen hemmer effektivt uttrykk for flertallet av stamcellerelaterte gener og pluripotency transkripsjonsfaktorer. I tillegg induserer det en tidligere fraværende uttrykk for p21 og p53 ( «gen wake-up»), noe som potensielt kan reversere legemiddelresistens ved å øke følsomheten til anti-kreft narkotika
Citation. Botchkina GI, Zuniga ES , Rowehl RH, Park R, Bhalla R, Bialkowska AB, et al. (2013) Prostate Cancer Stem Cell-Målrettet Effekten av en ny generasjon taksoid, SBT-1214 og Novel Polyenolic Sink-Binding Curcuminoid, CMC2.24. PLoS ONE 8 (9): e69884. doi: 10,1371 /journal.pone.0069884
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: May 1, 2013, Akseptert: 13. juni 2013, Publisert: 24.09.2013
Copyright: © 2013 Zuniga et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH R21 CA150085, NYSTAR stipend 1.072.170, og delvis ved Stony Brook University Institute of Chemical Biology Drug Discovery (ICB DD); Stony Brook University Cancer Center, NY; ChemMaster International, NY og SBU VP for forskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Rollen ChemMaster International, Inc., som oppfinneren av CMC2.24 var å syntetisere og gir, i slag, materialet for den aktuelle studien. Dette selskapet er en semi-akademisk enhet (President, Francis Johnson, PhD, er professor ved Institutt for kjemi og Institutt for farmakologiske Sciences ved SBU) som spesialiserer seg på flertrinnssynteser for akademiske og industrielle grupper. Dette selskapet ikke gir noen støtte knyttet til sysselsetting, rådgivning, patenter eller produkter i utvikling eller markedsført seg. Forfatterne bekrefter at det å tilby aktuell forskning med CMC2.24 ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Forfatterne har ikke noen potensielle finansielle eller ikke-finansielle, profesjonelle eller personlige konkurrerende interesser.
Innledning
Prostatakreft (PRC) er den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i Vest- samfunn [1]. Det er innledningsvis følsom for androgen deprivasjon, men mer enn 70% av pasientene vil møte etterbehandling tilbakefall og overgang av sykdommen som en uhelbredelig tilstand [2]. For pasienter diagnostisert med androgen-uavhengig PRC mikrotubulidynamikk stabilisatorer som Paclitaxel (Ptx; Taxol) er et første-linje behandling strategi som er utgangspunktet effektive. Men tilnærminger til behandling kjemoresistent PRC er for tiden mangler [3]. Etter den første oppdagelse av kreft stamceller, cscs [4], ble det stadig tydeligere at svulster er ordnet hierarkisk, inneholdende en forholdsvis liten (men varierende) populasjon av tumor initiere celler og en heterogen flertall av bulk tumorceller på forskjellige stadier i modning. Til støtte for CSC begrepet kreftutvikling, en fersk studie viste at uttrykket av flere vanlige CSC markører, dvs. CD44, CD166 og ALDH-en, samt andelen av celler som uttrykker disse markørene, øker med aldring [5] . Det er et etablert fenomen at aldring korrelerer med en kraftig økning i forekomsten av prostatakreft og mange andre kreftformer [1]. Akkumulert kunnskap viser tydelig at cscs er ansvarlig for svulst utvikling, vedlikehold og motstand mot vanlige behandlingsmetoder. Således har det vist seg for mange krefttyper som de tumorigene celler som uttrykker vanlige CSC markører, spesielt CD133 og CD44, er meget motstandsdyktige for vanlige anti-kreft medikamenter (så som 5-FU, oksaliplatin, irinotekan, docetaxel og andre). Dessuten kan antallet av slike celler bli betydelig formeres etter behandling [6-13], som vanligvis manifesterer seg som mer resistent og mer aggressiv tilbakevendende og metastatisk sykdom. Derfor er det tenkelig at cscs representerer den mest avgjørende målet i utviklingen av en ny generasjon av anti-kreftlegemidler.
Preklinisk evaluering av kandidat anti-kreftmidler er tradisjonelt basert på bruk av monolagskulturer totalen, uselekterte kreftceller. Men ignorerer denne in vitro modellen sjeldne ennå funksjonelt viktige, svært resistente tumor initiere celler, og dermed har liten relevans til kompleksiteten og patofysiologien av
in vivo
tumorvev. I tillegg ble det nylig vist at de mest brukte etablerte kreftcellelinjer har ingen sammenheng med opprinnelige kliniske prøver, noe som kan føre til kritisk misevaluation av legemidlets effekt [14]. Dette kan delvis forklare den høye frekvensen av slitasje av kandidat anti-kreft agenter. Dermed er bare 5% av agenter som har kreft aktivitet i preklinisk utvikling lisensiert [15]. Derfor identifisering og karakterisering av pasient avledet cscs, utvikling av optimale
in vivo Hotell og
in vitro
prekliniske modeller, og CSC-målrettede analyser av narkotikainduserte endringer representerer kritiske trinn i vurderingen av nye kreftmedisiner. Det er imidlertid svært vanskelig å etablere primære cellelinjer fra prostata karsinomer, og dette feltet er fortsatt å være en av de mest kontroversielle temaer i kreftforskningen [16]. Først av alt, er PRC en malignitet med en høy grad av cellulære og molekylære heterogenitet, er det derfor objektive vanskeligheter i isolering av rene cellepopulasjoner fra prostatavevet. På molekylnivå er det i dag ingen definitive markører for å bevise ondartet eller nonmalignant natur prostataceller, og å skille mellom normale og kreftstamceller. Økende bevis antyder også at cscs kan representere en heterogen undergruppe av tumor initiere celler [17-23]. Likevel er en kombinasjon av flere celleoverflatemarkører for initial cellesortering, etterfulgt av grundig funksjonell karakterisering av de isolerte celle fenotypene kan føre til identifikasjon av de funksjonelt signifikant (dvs. tumor- og metastase-initiering, eller den mest medikament-resistente) celle populasjoner.
i våre tidligere studier, har vi funnet at en ny generasjon taksoid, SBT-1214, induserer effektiv langvarig undertrykkelse av colon tumor xenografter [24] og dramatisk nedregulerer ekspresjon av multiple stammen celle-relevant gener [25]. Søke etter trygge midler som potensielt kan redusere systemisk toksisitet og ytterligere forbedre CSC-målrettede aktiviteter i SBT-1214, ble vi motivert av en rekke anti-kreft egenskaper av naturlige fytokjemikalier curcumin (diferuloylmethane). I et stort antall studier har blitt rapportert curcumin for å forsterke den cytotoksiske effekter indusert av forskjellige kjemoterapeutiske midler, og enda viktigere, for å hemme klonogene kapasitet og indusere pro-apoptotiske effekter på medikamentresistente celler som uttrykker stamcellemarkører [26]. Spesielt curcumin avtar vesentlig den proliferative potensial og øker apoptose av både androgen-avhengige og androgen-uavhengig prostatacancer-cellelinjer [27,28]. Imidlertid har curcumin lav bioaktivitet og biotilgjengelighet, noe som stimulerte oss til å utvikle ca. 30 strukturelle analoger av curcumin (polyenolic sinkbindende midler, PEZBINs), inkludert strømlederen forbindelsen, CMC2.24, som har høyere biologisk aktivitet, bedre oppløselighet og ingen bevis av toksisitet selv ved høye doser [29]. Målet med denne studien var å teste effekten av SBT-1214 som monoterapi, og kombinasjonen med denne romanen curcuminoid mot primære og metastatiske prostata tumor initiere celler.
Resultater
etablering og karakterisering av spontant udødelig primære prostatakreft cellelinje, PPT2
Dissosierte celler av nålbiopsier fra 22 resected prostata karsinom av ulike histologiske karakterer ble testet for klonogene og karsinogent potensial
in vivo Hotell og
in vitro
som beskrevet i metodedelen. Tyve prøvene inneholdt en subpopulasjon av de raske-adherente celler (FA) til type I kollagen, som til å begynne proliferert i serumfritt medium stamcelle. Fjorten av de 22 prøvene induserte flytende flercellede aggregater, og bare tre eksemplarer var i stand til å indusere tett 3D kuler karakteristisk for cscs. Men de fleste av de primære cellene mistet sine klonogene og kule-dannende kapasitet etter flere passasjer, som er på linje med en rekke observasjoner om at primærprostatakreftceller har en begrenset levetid (5-6 passeringer) [16]. I kontrast, ble kreftceller isolert fra pasienten med scene pT2c PNX pMX PRC spontant udødeliggjort og fortsatt langsiktig
in vitro Hotell og
in vivo
vekst (28 passasjer, for tiden). Med serie runder av transplantasjon og aging i en stamcelle medium, ble tre forskjellige cellepopulasjoner tydelig: den store bestanden av langstrakte celler, mange runde holoclones inneholder små celler, og sjeldne, svært store flerkjernede celler (som vi ofte observerer i flere etablerte og primære prostata og tykktarm kreft cellelinjer). Subkloning av disse små-celleholdige holoclones ført til dramatiske anriking av celler som uttrykker høye nivåer av CD133, CD44, CD44v6, EpCAM, CD49f og CD166 (figur 1A). Denne cellelinje (kalt PPT2) ble serie spredd som NOD /SCID-mus tumorxenotransplantater, flytende 3D-kuler og type I kollagen-tilhenger kulturer. I henhold til ATCC rapport (ID-nummer 002 872), den PPT2 cellene er unike humane celler uten noen match til hvilken som helst profil i ATCC STR databasen, noe som betyr at de ikke er forurenset med hvilke som helst kjente etablerte cellelinjer. Selv fenotype av CSC-anrikede kulturer er dynamisk på grunn av den tosidige natur av de cscs (dvs. evnen til å fornye seg selv og for å generere forpliktede stamceller), den PPT2 cellene beholde relativt stabile fenotyper og med opp til 8 uker etter den siste MACS- CD133
+ celle sortering og dyrking av type i kollagen-belagte overflater i serumfritt Mesenchymale Stem Cell vekst medium, MSCGM (Lonza, tabell 1, figur 1). Dermed praktisk talt hele befolkningen i PPT2 celler var udifferensiert (bare 3-5% uttrykt markør for differensierte celler, pan-keratin), positive for EpCAM, CD49f, standard isoformen av CD44 (98-99%; klone MEM-85; Invitrogen), og opp til 72% express variant isoform, CD44v6 (klone 2F10, R D). Etter · 27 passasjer, ca 90% av PPT2 celler fortsatt uttrykker moderat til høy grad av CD133 og besitter meget høy sfære dannende kapasitet i 3D kultur inneholder 1: 4 kollagen type I /Stemline pluripotent Kultur Medium (SPCM, Sigma-Aldrich ). Tolv seksten prosent av PPT2 cellene var positive for androgen reseptor (AR
+), og 8-10% var positive for CXCR4 (figur 1A). I motsetning til den opprinnelige tumorvevet, ble renset CD133
+ celler ikke uttrykker PSA, som dukket opp igjen i NOD /SCID-mus-svulster etter transplantasjon av CD133
+ celler (figur 1B). De aller fleste av CD133
+ PPT2 celler uttrykte høye cytoplasmatiske nivåer av vimentin og nestin, karakteristisk for nevrale og embryonale stamceller. Uttrykket av disse to markørene var høyest i gigantiske multinucleated celler (MNCs, figur 1C). Begge atom og cytoplasmatiske fraksjoner av de PPT2 cellene uttrykte c-myc, mens andre pluripotency markører (okt-4 og Sox-2) ble påvist kun i kjernefysiske brøkdel (figur 1D). Viktigere, PPT2 celler var negative for pro-apoptotiske /tumorsupressorproteinene proteiner, p53 og p21, og ekstremt motstandsdyktig mot vanlige anti-kreft narkotika. Ved nåværende tidspunkt, etter ca 2,5 års vedlikehold, de aller fleste av de PPT2 cellene holder seg på en umoden tilstand, fortsetter å uttrykke høye prosenter og høye nivåer av brukte stemness og pluripotency markører nevnt ovenfor, og beholder svært høy tumor-initiering, klonogene og sfære dannende kapasitet i løpet av serielle transplantasjoner av de relativt lave celletall. Alle de ovennevnte motivert vårt team for å teste de to egenutviklede medikamenter, SBT-1214 og CMC2.24 mot denne svært resistent, CSC-beriket primære prostatakreft cellelinje og for sammenligning mot etablert et sterkt metastatisk derivat av PC-3 cellelinje, PC3MM2 celler, som ble preget i vår tidligere studie [30].
(A) representant FACS analyser av de ulike celleoverflatemarkører uttrykk i usorterte PPT2 celler dyrket i 4 uker av type i kollagen i melding_B medium. Hver stiplet firkant representerer populasjonen av celler som uttrykker moderate /høye nivåer av en spesiell markør konjugert med forskjellige fluorescerende koder. Merk en langsiktig oppbevaring av CD133-APC, standard (CD44-PE) og variant (CD44v6-FITC) CD44 og CD49f-APC. I kontrast, bare små fraksjoner av de PPT2 cellene uttrykte en markør for basal celler, p63, en markør for differensierte celler, pan-keratin, CK18, AR og CXCR4. (B) Immunhistokjemisk analyse viser at, i motsetning til foreldre svulstvev, renset CD133
+ PPT2 celler uttrykker ikke PSA
i
vitro
; Men PPT2-indusert NOD /SCID tumorxenotransplantater er svakt PSA-positive. (C) immunocytokjemisk analyse viser uniform ekspresjon av vimentin og nestin, med særlig høye nivåer av disse markører for neural stamceller i store MNCer. (D) Western blot-analyse viser ekspresjon av de pluripotency markører i nukleære og cytoplasmiske fraksjoner av CD133
+ PPT2 celler. Både de nukleære og cytoplasmiske fraksjoner uttrykt c-myc og var negative for p53 og p21; bare atom brøkdel uttrykt oktober-4 og Sox-2.
bilder PPT2 celler **
PC3MM2 celler ***
Marker
Kilde
Uttr. nivå
% av cellene
Uttr. nivå
% av cellene
CD133Miltenyi Bio +++ 75 ± 15 ++ /+++ 3 ± 1CD44Invitrogen MEM-85 +++ 99,5 ± 0,5 ++ /+++ 7,5 ± 2.5CD44v6R . D Clone 2F10 +++ 56 ± 16CD49fBioLegends +++ 99,5 ± 0,5 +++ 94 ± 2CD166BD Biosci. +++ 99,3 ± 0,5 ++ /+++ 86 ± 8EpCAMMiltenyi bio. +++ 98 ± 0,5 ++ /+++ 83 ± 5Pan-KeratCell Signal. ++ 4 ± 1CK5Santa Cruz + 7 ± 1 + 3 ± 1CK18Santa Cruz + 5,5 ± 2,5 + 3,5 ± 0.5CK5 /CK18Santa Cruz + 4,5 ± 0,5 + 2,5 ± 0.5p63Santa Cruz + 5 ± 2,5 + 7 ± 1ARSanta Cruz + 14 ± 2 ++ /+++ 5 ± 2CXCR4R . D ++ 10,5 ± 1 +++ 12 ± 2Table 1. Fenotypisk profilering av PPT2 og PC3MM2 celler med FACS analyse * product: * Gjennomsnittlig prosent av celler som uttrykker bestemt celleoverflaten markør ble beregnet basert på tre uavhengige FACS analyser. ** PPT2 celler (usorterte før analyse, men er etablert av tidligere gjentatte MACS-CD133
+ cellesortering) ble dyrket på type i kollagen-belagt retter i MSCB medium for 2, 4 og 8 uker. *** usorterte PC3MM2-celler ble dyrket på type i kollagen-belagte retter i MSCB medium i 1-2 uker. + ++ og +++ betegner lav, middels og høy ekspresjon. CSV Last ned CSV
cytotoksiske effektene av SBT-1214 mot CSC-beriket prostatakreftceller
in vitro
Behandling med SBT-1214 og, for sammenligning med brukte microtubule stabiliseringsmiddel paclitaxel (Ptx; Taxol) økte forhold av celler med høy ekspresjon av CD133 på en konsentrasjonsavhengig måte (fra 10 nM til 10 uM, i 24 timer) i begge PPT2 og PC3MM2 cellelinjer (representative FACS er vist på figur 2A, B) . Disse dataene tyder på at både narkotika fortrinnsvis påvirket celler med lav CD133 uttrykk, og i utgangspunktet ikke påvirke eller stimulere spredning av CD133
høye celler. Men en lengre behandling (i 48-72 timer) viste en betydelig forskjell mellom de cytotoksiske effektene av SBT-1214 og Ptx: mens Ptx-behandlede celler beholdes levedyktighet og antallet levedyktige celler ble fortsatt økes, opp til 60% av SBT-1214-behandlede CD133
+ celler ble drept med de samme konsentrasjoner av medikamentet (MTT analysedata er vist på figur 2C, D; Figur 3A). Overraskende, lavere konsentrasjoner av SBT-1214 (100 nM-1 uM) induserte høyere cytotoksisitet i PPT2 celler sammenlignet med 10 uM medikamentkonsentrasjon. Paclitaxel 10 pM var cytotoksisk og induserte ca. 40% celledød (figur 2C, D). På dette tidspunkt, et øket forhold av meget store MNCer (ofte ≥200 um) var tydelig i både PPT2 og PC3MM2-celler (figur 3A, B). For å teste hvorvidt behandling med SBT-1214 påvirker klonogene potensialet i CD133
+ celler, PPT2 og PC3MM2 flytende kuler ble behandlet med 1 um av stoffet i 24 timer for å indusere forandringer, men unngå dyp celledød. Vi har funnet at i motsetning til kontroll ubehandlede kuler, SBT-1214 behandlede cellene mistet sin evne til å indusere både sekundære 3D-kuler (figur 3C) eller kollagen-adherent kolonier (ikke vist). Begge PPT2 og PC3MM2 celler behandlings-overlevende utøves dyp celledød i 2-5 dager etter behandling med SBT-1214 (figur 3D).
Representative FACS analyse viser en doseavhengig økning i prosenter av CD133
høy PPT2 (A) og PC3MM2 (B) celler 24 timer etter behandling med SBT-1214 og Ptx. Lengre behandling (72 timer) med SBT-1214 (10 nM-10 uM) induserte opptil 65% celledød i PPT2-celler (C) og opp til 60% i PC3MM2 celler (D; nedre linje). I kontrast, gjorde behandling med samme dose av Ptx ikke undertrykke spredning av tumorigene prostatakreftceller (C, D, øvre linje). Celler ble inkubert med angitte medikamentkonsentrasjoner, og data ble oppnådd med standard MMT-analyse basert på tre uavhengige eksperimenter med fire repetisjoner i hver behandlingsgruppe. Verdier er gjennomsnitt ± SD.
(A, B) fasekontrastmikrofotografier viser at en enkelt behandling med 1 mM SBT-1214 i 48 timer indusert død av de PPT2 og PC3MM2 celler med anrikning av store multinucleated celler (piler). (C) Etterbehandling tap av kulen dannende kapasitet av overlevende-celler sammenlignet med ubehandlede seg. Verdier er gjennomsnitt ± SD basert på 3 uavhengige gjentas. (D) Profound død av behandlede PPT2 og PC3MM2 celler i løpet av de neste dagene i kultur.
In vivo
effekten av SBT-1214 mot prostata tumorxenotransplantater indusert av CD133
+ cellepopulasjoner
Etter transplantasjon av CD133
+ PPT2 og PC3MM2 celler, NOD /SCID-mus ble tilfeldig delt inn i 3 grupper for hver celletype: en som en ubehandlet kontroll (n = 4), en andre gruppe for SBT-1214 behandling med 40, 40, 40 mg /kg ukentlig behandling (n = 4), og en tredje gruppe for behandling med 40, 20, 20, 20 mg /kg ukentlig behandling (n = 6). Behandlingen ble startet 2-3 uker etter transplantering av tumorcellene, når tumorxenografter nådd 100 mm
3; svulst utvikling ble overvåket ukentlig. Selv om alle fire svulster behandlet med 40, 40, 40 mg /kg ukentlig regime hadde dramatisk krympet med den tredje behandling, alle mus uttrykt vanlige tegn på systemisk toksisitet og ble avlivet (data ikke vist). Behandlingen med 40, 20, 20, 20 mg /kg ukentlig regime induserte mer betydelig tumorregresjon (figur 4A-D), med mye lavere systemisk toksisitet. En uke etter siste behandling ble alle rester av tumorer høstet og analysert histopathologically og for
ex vivo
klonogene kapasitet. Ubehandlede kontroll svulster ble fjernet ved oppnådd ~ 2 cm i største diameter i henhold til IRB krav.
NOD /SCID mus ble ectopically implantert med 3000 av CD133
+ PPT2 og PC3MM2 celler på flankene. Tre uker etter injeksjon, ble musene behandlet med ukentlig intravenøs injeksjoner av SBT-1214 (x4: 40, 20, 20, 20 mg /kg). Denne behandlingsform indusert dramatisk reduksjon i tumorstørrelse i de fleste av de PPT2- og PC3MM2-induserte tumorer (A-D). Representative tilfeller er vist på B og D. Verdiene er middelverdi ± SD;
p
≤0.0009 for PPT2-induserte tumorer (SBT-behandlede versus ubehandlede kontroller, n = 6), og
p
≤0.0018 for PC3MM2-induserte tumorer (n = 6). Histopatologisk analyse av rest tumorer viste tilstedeværelse av levedyktige celler og akkumulering av store flerkjernede celler i 2 av 6 PPT2 tumorer og 3 av 6 PC3MM2 tumorer (representative H ikke vist), ofte som utøves bifasisk virkning på prostata CD133
+ -celler. Således behandling med lave konsentrasjoner av CMC (opp til 10 uM) i 72 timer stimulert celleproliferasjon, mens høyere doser (10-40μM) ble stadig mer cytotoksisk (figur 5A, B). FACS-analyse viste at i motsetning til SBT-1214 og Ptx, gjorde CMC2.24 ikke induserer en økning i prosenter av celler med høy ekspresjon av CD133 (figur 5C; svart stiplet område), men førte til en betydelig forskyvning av hele cellen befolkningen mot differensiering (C; område med rød stjerne) og en viss økning i celler med høyeste uttrykk for pan-keratin (C; rød stiplet område). Disse data indikerer at lave konsentrasjoner av CMC2.24 øke spredning av de ikke-stammen progenitorceller i stedet for cscs. Viktigere er kombinasjonen av 30 pm CMC2.24 (som ikke er giftig, selv ved mye høyere doser [29]), med lave konsentrasjoner av SBT-1214 eller Ptx (10 nM-1 uM) som utøves dypere død av CD133
+ celler enn hver forbindelse som monoterapi (figur 5D, E). Etter midlertidig etterbehandling opphopning av de store flerkjernede celler, de mistet evnen til å indusere flytende 3D sfæroidene og gjennomgikk dyp celledød på lignende måte som SBT-1214-behandlede celler er vist på figur 3.
(A, B ) den CMC2.24 som monoterapi indusert bifasisk effekt på prostatakreft celleproliferasjon: lavere konsentrasjoner av det fremmet spredning, mens høyere de var cytotoksiske. (C) I motsetning til SBT-1214, ble behandling med CMC2.24 ikke induserer en økning i forholdet mellom CD133
+ celler (sort stiplede områder), men i likhet med SBT-1214, økt ekspresjon av differensierings markør pan -keratin (rød prikkete områder) og flyttet hele cellen befolkningen mot differensiering (områder med stjerne). En kombinasjon av de to midlene induserte mer betydelig celledød av CD133
+ PPT2 (D) og PC3MM2 (E) celler i forhold til hver forbindelse som monoterapi. Data ble oppnådd med standard MMT-analyse (A, B, D, E). Verdier er gjennomsnitt ± SD av de tre uavhengige eksperimenter med 4 rapporter for hver legemiddelkonsentrasjon.
SBT-1214-induserte endringer i stemness relaterte genekspresjon profil
I vår tidligere studier, ved hjelp av genom-wide og sti spesifikke genuttrykk profilering, har vi funnet ut at de tumorigene cellepopulasjoner isolert fra de etablerte prostata og tykktarm kreft cellelinjer uttrykte oppregulert nivåer av anti-apoptotiske gener, ABC transportører og flertallet av stammen cellerelaterte gener [25,30,31]. Vår proteomikk studie utført i samarbeid med Harvard Proteomics Resource på CSC-beriket versus differensierte PC3MM2 celler avslørt 198 differensielt uttrykte proteiner ut av 600 analyserte de (upubliserte data). Blant dem var det mange proteiner involvert i stamcelle funksjon, cellemotilitet, invasjon, metastasering og dårlig prognose, inkludert vimentin, nestin, S100, varmesjokkproteiner HS90A og HS90B, moesin, galectin og mange andre. For å bestemme mulige narkotika-induserte endringer i stemness genekspresjon, analyserte vi CD133
+ PPT2 celler før og etter behandling med SBT-1214 /CMC 2.24 kombinasjon. Ved hjelp av PCR rekke assay (PAHS 501; SA
biovitenskap
) med filtreringskriterier for en 1,5 eller greater- ganger endring i uttrykket, har vi funnet at ca 50% av de analyserte 84 stamcellerelaterte transkripsjonsfaktorer ( TFS) ble oppregulert i CD133
+ versus differensierte PRC celler (Figur 6A). Blant dem var CDX2, DLX2, DNMT3B, EGR, foxp3, GLI2, HOX familie TFS, IRX4, juni, KLF2, NFATC1, NR2F2, PCNA, PITX3, POU4F1, SIX2, SOX2, SOX9, TERT, WT1 og andre. Enkelt behandling med SB-1214 (1 uM) og CMC2.24 (10 uM) i 24 timer induserte betydelig nedregulering av disse over-uttrykte gener (figur 6B). Western blot-analyse har vist at SBT-1214 og CMC2.24 som enkle midler indusert moderat nedregulering av c-myc og Sox2 i nukleære ekstrakter av både CD133
+ og bulk PPT2 celler, mens det kombinerte legemiddeladministrering førte til praktisk talt fullstendig hemming av deres uttrykk (figur 6C). Viktigere, kjernefysiske fraksjoner av både CD133
+ og bulk PPT2 cellene uttrykte ikke de to kreftdempere /regulatorer av apoptose, p53 og p21 (figur 7A), som delvis kan forklare deres ekstreme motstand mot anti-kreft narkotika. Både SBT-1214 og CMC2.24, og særlig deres kombinasjon indusert ekspresjon av p21 og p53. Slike «gen wake-up» indusert ved forbehandling med medikamentkombinasjonen (SB-1214, 1 uM og CMC2.24; 10 uM) i 24 timer dramatisk økt ytterligere følsomhet av disse høyt legemiddelresistente celler til den andre behandling, som fører til praktisk talt fullstendig død av CSC-beriket celler (figur 7B, C).
(A) Flere stamcelle-relevant transkripsjonsfaktorer er oppregulert i CD133 + cellepopulasjonen i forhold til sine differensierte kolleger. (B) Down-regulering av oppregulert transkripsjonsfaktorer etter behandling med en mikrometer SBT-1214 og 10 mm CMC2.24 for 24 timer (PCR rekke analyse, SABiosciences; PAHS 501). Western blot-analyse bekreftet betydelig nedregulering av nøkkel pluripotency transkripsjonsfaktorer, c-Myc og Sox-2 i CD133
+ celler (C). Histon H1 ble anvendt som en kontroll lasting.
(A) Tidligere fraværende pro-apoptotiske /tumor-suppressor-proteiner p21 og p53 ble indusert ved en enkel behandling med SBT-1214 /CMC2.24 kombinasjon for 24 hr både CD133
+ og bulk PPT2 celler. Slike «gen wake-up» førte til betydelig økning i følsomheten av CD133
+ -celler til denne medikamentkombinasjon (B, C). Forbehandling [SBT-1214 (1 mm) + CMC2.24 (10 uM)];
