Abstract
Bakgrunn
Angiogenese kan spille en rolle i patogenesen av Non-Small Cell lungekreft (NSCLC). CXC (ELR
+) chemokin familien er kraftige arrangører av angiogenic respons.
Metoder
uttrykk for CXC (ELR
+) familiemedlemmer (
CXCL1-3 /GROα-γ
,
CXCL8 /IL-8
,
CXCR1 /2
) ble undersøkt i en serie av resected Dypfryst NSCLC tumorer. I tillegg ble uttrykket og epigenetisk regulering av disse kjemokiner undersøkt i normal bronkial epiteliale og NSCLC cellelinjer.
Resultater
Totalt uttrykk for chemokine ligander (
CXCL1, 2
,
8
) og deres reseptorer (
CXCR1 /2
) ble nedregulert i tumorprøver sammenlignet med vanlig, med unntak av
CXCL3
.
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
ble funnet å være epigenetiske regulert av histon posttranslasjonelle modifikasjoner. Rekombinant CXCL8 ikke stimulere cellevekst i enten en normal bronkiale epitel eller en skvamøs karsinom cellelinje (SKMES-1). Men en økning ble observert ved 72 timer etter behandling i et adenokarsinom cellelinje.
Konklusjoner
CXC (ELR
+) kjemokiner er dysregulerte i NSCLC. Balansen mellom disse kjemokiner kan være kritisk i svulsten mikromiljøet og krever ytterligere forklaring. Det gjenstår å se om epigenetisk målretting av disse banene er en levedyktig terapeutisk alternativ i lungekreft behandling
Citation. Baird AM, Gray SG, O’Byrne KJ (2011) Epigenetikk underbygger Regulering av CXC ( ELR
+) Kjemokiner i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 6 (1): e14593. doi: 10,1371 /journal.pone.0014593
Redaktør: Kelvin Yuen Kwong Chan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 14 juni 2010; Godkjent: 02.01.2011; Publisert: 27 januar 2011
Copyright: © 2011 Baird et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en ubegrenset pedagogisk stipend fra Pfizer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Midler til dette prosjektet var å gi av Pfizer i form av lønn for Anne- Marie Baird. Ingen midler ble gitt for forbruksvarer. Midlene gitt var et stipend-i-aid, og som sådan, betyr det ikke endrer forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Angiogenese er viktig i vekst og spredning av kreft og påvirker også inflammatoriske endringer som kan predisponere til sykdommen [1]. CXC (ELR
+) kjemokiner indusere angiogenese og kan være viktig i kreftformer som har en angiogen fenotype, for eksempel NSCLC [2].
Begrepet chemokin refererer til en familie av lav molekylvekt (8- 10 kDa) kjemotaktiske cytokiner. Kjemokiner er små induserbare cytokiner, som er chemo-lokke for leukocytter. Kjemokiner er klassifisert etter deres aminosyresammensetning, funksjonell aktivitet og reseptor-bindingsegenskaper og består av fire underfamilier som er definert i henhold til de to av fire konserverte cysteinrester først (a) C, (b) CC, (c) CXC og (d) CXXXC [3]. CXC kjemokin-familien består av to undertyper, ELR
+ og ELR
-, i henhold til en bestemt Glu-Leu-Arg (ELR) motivet er forut for den første cysteinresten [3]. CXC (ELR
+) promotorer inneholder en antatt
cis
element som gjenkjenner NF-kB, og derfor kan føre til at transaktivering av CXC kjemokiner [4].
angiogene reseptor for CXCL8 og den andre CXC (ELR
+) kjemokiner er CXCR2 [5]. Blokkering av denne reseptoren fører til en nedgang i angiogenese i bukspyttkjertelkreft [6], og en signifikant inhibering av human melanom tumor vekst og eksperimentell lungemetastaser i CXCR2 – /- mus, så vel som en reduksjon i angiogenese [7]. Innenfor innstilling av lungen, kreft vekst og metastatisk potensiale er nedregulert i flere mus CXCR2 – /- modeller [7], [8]. Imidlertid kan CXCL8 binde til CXCR1 og CXCL1 /CXCL8 kan også binde DARC, selv om binding til DARC ikke transduce et signal. For tiden studier med DARC tyder på at det virker ved å «mopping» opp kjemokiner, og derfor reduserer deres signaleringskapasitet. Over-ekspresjon av DARC fører til økt tumorvekst, men dette var på grunn av induksjon av store nekrotiske områder innen tumoren [9], [10].
chemokin-reseptorer er oppregulert på tumorceller, slik at tumoren kan dra nytte av kjemokin rike miljøer, fremme tumorvekst og blodkar. I tillegg kan kjemokiner rekruttere makrofager, som detekterer hypoksisk miljø inne i svulsten og deretter utskiller pro-angiogene faktorer [11], [12]. Utgangspunktet kjemokiner ble antatt å bare spille en rolle i å tiltrekke bestemte leukocytter til en skadestedet; Ikke desto mindre har det nå blitt vist at de er involvert i neoplastisk transformasjon av en celle, fremming av angiogenese, tumor klonal ekspansjon og endringer i ECM, særlig medierer organspesifikke metastaser i kreft [13]. Spesifikke ligand reseptor parene diktere metastaser mønstre av brystkreft og lungekreft [14]. I brystkreft metastaser til lungene, CXCL1 var en del av et gen signatur som også inkluderte VCAM1 og MMP1 [15]. En fersk studie fant at svulsten avledet CXCL8 fungerte som et lokkemiddel for sirkulerende tumorceller for å gå tilbake til den opprinnelige svulsten, som fører til en mer aggressiv svulst fenotype [16].
En rekke CXC kjemokiner er påvist i neoplastiske vev som produkter av tumorceller eller stromale elementer [12]. For eksempel, tumor infiltrerende inflammatoriske celler løfter CXCL8-nivåer i bronchioalveolar celler, sammen med sine to reseptorer [17]. Sterke bevis tyder på at CXC (beltestrammere Forse
+) kjemokiner har en rolle i kreft kampanjen, som de kan fremme vekst og overlevelse av kreft celler [18].
vekst og progresjon av kreft er avhengig av angiogenese og CXCL8 har vist seg å spille en rolle i den angiogene og tumorigen potensial. I nyrecellecancer nivåene av CXCL1, CXCL3 og CXCL8 ble forhøyet sammenlignet med kontroller og i reseptor-negativ (CXCR2 – /-) mus var det en tilsvarende reduksjon i tumorvekst [19]. Studier med melanom tumormodeller støtter rollen CXCL1, CXCL2, og CXCL3 i formidling tumor angiogenese og nivåer av alle tre kjemokiner er høyt uttrykt i melanom svulster. Transfeksjon av CXCL1-3 inn i udødeliggjorte ikke-tumorigene celler ga dem evnen til å danne svulster [20], [21]. CXCL8 er en av de mest studerte medlemmene av CXC (ELR
+) familien, særlig i lunge cancer. CXCL8 ble identifisert i en genekspresjon signatur som var predicative av dårlig prognose hos pasienter med stadium I lungekreft [22], mens nivåene av CXCL8 er betydelig økt i både ondartede plevravæske [23] og NSCLC [24], hvor nivåene øker med stadium [25] og korrelerer med pasientens overlevelse /tilbakefall [26]
Kjemokiner funnet i svulsten mikromiljøet er tenkt å spille minst fem roller i utviklingen av svulster og metastatisk sykdom.; (A) kontroll leukocytt infiltrat, (b) modifisere tumor immunrespons, (c) regulerer angiogenese, (d) å operere som vekst og overlevelsesfaktorer, og (e) direkte bevegelse av tumorceller seg selv [27]. De CXC (ELR
+) ligander og reseptorer er særlig viktig ved formidling av NSCLC tumorassosiert angiogenese [28] og organspesifikke metastaser [13], [14]. CXCR2 ligander har også vært innblandet i NSCLC tumorprogresjon gjennom sneglen, høye nivåer av som korrelerer med redusert overlevelse [29].
Aberrant epigenetisk regulering av genekspresjon er en hyppig hendelse i NSCLC [30], [31] . Rettet mot disse epigenetiske reguleringsmekanismer i NSCLC er et aktivt område av farmasøytisk forskning. Vi har søkt å undersøke ekspresjonen av CXC (ELR
+) kjemokiner og deres reseptorer i en serie av primær NSCLC tumorprøver og i en ytterligere panel av NSCLC-cellelinjer, og for direkte å undersøke hvorvidt epigenetikk spiller en rolle i reguleringen av disse genene i denne sykdommen. Våre resultater tyder på at ekspresjon av disse kjemokiner og deres reseptorer er ofte deregulert i NSCLC, reguleres via direkte og i direkte ved epigenetiske mekanismer (histon posttranslasjonelle modifikasjoner og DNA CpG-metylering, henholdsvis) og kan være gode kandidat mål for epigenetisk terapi i behandling av denne kreftformen.
Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
A549 (adenokarsinom), SKMES-en (plateepitelkarsinom), H460, H647 og H1299 (stor karsinom) og BEAS-2B (transformert normal bronchoepithelial) cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (LGC Promochem, Teddington, UK). HBEC cellelinjer [32] var en gave fra professor John D Minna (Hamon Senter for Therapeutic Oncology Research, UTSoutwestern, Dallas, TX, USA). Alle cellekultur reagenser ble kjøpt fra Lonza (Walkers, MD, USA). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 i det følgende media; A549 – F-12 (Ham) medium supplementert med 10% (v /v) FBS, penicillin streptomycin (500 U /ml) og 2 mM L-glutamin. BEAS-2B ble også opprettholdt i F-12 (Ham) medium uten tilsetning av FBS. SKMES-1 – EMEM med tilsetning av 10% (v /v) FBS, penicillin streptomycin (500 U /ml), 2 mM L-glutamin og 0,1 M ikke-essensielle aminosyrer. Alle store cellekreft linjer ble holdt i RPMI med 10% FBS og penicillin streptomycin (500 U /ml). HBEC Linjene ble opprettholdt i keratinocytt serumfritt medium (SFM), med L-glutamin (GIBCO Invitrogen, Paisley, Skottland) og supplert med 2,5 ug human rekombinant epidermal vekstfaktor (rEGF), og 25 ug bovint hypofyseekstrakt (GIBCO Invitrogen) .
Primær tumorprøver
En serie med 37 vevsprøver (14 adenokarsinom og 23 plateepitelkarsinom) ble tatt fra pasienter med tidlig stadium NSCLC på St. James «Hospital, Dublin. Matchet normalt vev ble tatt i parallell for hver pasient og prøver ble evaluert av en patolog umiddelbart etter disseksjon.
Reagenser
Trichostatin A (TSA) ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, CA, USA ) og oppløst i DMSO til en konsentrasjon på 250 mg /ml. Cellekulturer ble behandlet i en periode på 16 timer, ved en endelig konsentrasjon på 250 ng /ml.
fenylbutyrat (PB) (Tributyrate ™) var en gave fra Triple Crown-Amerika, Perkasie, PA, USA. Cellekulturer ble behandlet ved en sluttkonsentrasjon på 10 mM i 16 timer.
5-aza-2′-Deoxycytidine (DAC) ble kjøpt fra Merck (Darmstadt, Tyskland) og oppløst i metanol. Cellekulturer ble behandlet med DAC (endelig konsentrasjon – en mikrometer). I 48 timer med DAC og media erstattes hver 24 h
Rekombinant human CXCL8 ble kjøpt fra PromoKine (PromoCell GmbH, Heidelberg, Tyskland) og rekonstituert i sterilt destillert vann.
SB 225002 ble kjøpt fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) og oppløst i DMSO til en konsentrasjon på 2,2 uM. Cellelinjer ble behandlet i en time før tilsetning av CXCL8, ved en konsentrasjon på 0,022 uM.
Total RNA isolasjon og RT-PCR-amplifikasjon
Total RNA ble ekstrahert ved bruk av TRI reagent® ( Molecular Research Center, Montgomery Road, OH, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Forut for førstetråds-cDNA-syntese, 10 ug av total-RNA ble forbehandlet ved spalting med RQ1 DNase (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble generert ved hjelp Hevet III (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) og Oligo dT (20) primere (Eurofins MWG operonet, Ebersberg, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.
Cellelinjer ble undersøkt for uttrykk for
CXCL1-3
,
CXCL8
,
CXCR1 /2
og
Beta-aktin
av RT-PCR, ved hjelp av primere og annealing temperaturer skissert i Tabell 1. PCR veksling besto av -95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 35 sykluser med 1 minutt ved 94 ° C, 1 min ved målgenet glødetemperaturen og 1 min ved 72 ° C med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 minutter.
Forsøk ble utført i triplikat og produktene underkastet elektroforese på en 1% agarosegel. Produkt kvantifisering ble utført ved hjelp av TINA 2.09c (Raytest, Isotopenmeßgeräte GmbH, Straubenhardt, Tyskland) densitometry programvare. MRNA uttrykk var normalisert til
Beta-aktin
kontroller, og ble uttrykt som forholdet mellom mål mRNA uttrykk.
Beta-aktin
uttrykk
Chromatin immunoprecipitation (X- chip)
Chromatin immunoutfelling ble utført som følger: Etter behandling ble cellene fiksert med formaldehyd (sluttkonsentrasjon 1%), suspendert i SDS-lyseringsbuffer (Millipore, Billerica, MA, USA) og sonikert inntil DNA ble fragmentert i lengder på mellom 200-1000 bp. Porsjoner av denne skåret DNA ble deretter immunopresipitert med OneDay ChIP Kit ™ (Diagenode, Liège, Belgia) i henhold til produsentens instruksjoner. Antistoffene som brukes for immunoprecipitation var som følger: pan acetyl-histon H3 (Millipore Cat # 06-599), pan acetyl histon H4 (Millipore Cat # 06-598), acetyl-histon H3 (K9 /14ac) (Diagenode Cat # pAb -ACHBHS-044), acetyl-histon H3 (K9ac) (Diagenode Cat # pAb-ACHAHS-044), acetyl fosfor – histon H3 (K9pS10) (Sigma Cat # H0788), di methyl-histon H3 (K9Me2) (Sigma Cat # D5567), di methyl histon H3 (K4Me2) (Sigma Cat # D5692) og metyl-histon H3 (K4Me) (Sigma Cat # M4819). En no antistoff kontroll ble tatt med for å teste for uspesifikk binding.
Primere som brukes til å studere promotorområdene av
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
av Chip ble utviklet fra kjent 5 «UTR som finnes i deres nukleotidsekvenser. RT-PCR sykkelBetingelsene var de samme som de som er beskrevet ovenfor. Grunning og annealing temperaturer for ChIP er presentert i Tabell 2.
ELISA
Konsentrasjonen av CXCL8 ble målt i kondisjonert medium ved hjelp av en DuoSet® ELISA Development Systems (R substratoppløsningen som ble benyttet ble gjort i fosfat-citrat-buffer (inneholdende sitronsyre og dinatrium hydrogen ortofosfat-dodekahydrat, pH 5,0), 10 mg 1, 2-fenylendiamin (OPD) og 18 ul av 1 MH
2o
2 .
CXCL2 ble kvantifisert ved hjelp av en ELISA development kit kjøpt fra Strathmann Biotec (Hamburg, Tyskland), i henhold til produsentens instruksjoner.
Cellular proliferasjonsanalyser
Celleproliferering ble målt ved hjelp av en Cell Proliferation ELISA, BrdU (Roche Diagnostics Ltd., Sussex, UK). I korthet ble cellene sådd ut i 5 x 10
3 /brønn i en 96-brønns plate og klebet over natten. Deretter ble den fullstendige media ble fjernet, og cellene ble vasket med 100 pl PBS. Serum utarmet medium (0,5% FBS) ble tilsatt til de eneste lungekreftceller, som dette etterligner tettere fysiologiske betingelser. Etter inkubering over natten, ble cellene behandlet i 24, 48 eller 72 timer med human rekombinant CXCL8 i forskjellige konsentrasjoner (0,1 til 100 ng /ml). Inhiberings-studiene ble utført ved forhåndsbehandling av celler med 0,022 uM SB225002 i 1 time før tilsetning av CXCL8. Absorbans ble målt på en plateavleser ved 450 nm med en referansebølgelengde satt til 690 nm og tomme og ubehandlede brønner ble anvendt for normaliseringsformål. De ubehandlede celler ble satt som 100%, og de CXCL8 behandlinger vurderes i forhold til dette.
Statistisk analyse
Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (standardfeil av middelverdien). Statistisk analyse ble utført med INSTAT (Graphpad programvare, La Jolla, CA, USA) ved hjelp av en sammenkoblet en tailed Student
t
-test. Forskjeller ble betraktet som signifikant når p 0,05
Resultater
Uttrykk for
CXCL1-3
,
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
i primær lungekreft vevsprøver
for å vurdere uttrykk for en rekke CXC (ELR
+) familiemedlemmer i et panel av normale /tumor matchet pasientprøver fra Stage i og II pasienter, RT- PCR ble utført (figur 1A), og oppsummert i figur 1B. Densitometrisk analyse av RT-PCR avslørte en betydelig reduksjon i ekspresjonen av
CXCL1
,
CXCL2
(p 0,01) og
CXCR1
reseptor (p 0,05) i NSCLC tumorprøver sammenlignet med normal (figur 1C)
A) Nivåer av
CXCL1 Anmeldelser -.
3
,
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
ble undersøkt ved RT-PCR på et panel av NSCLC linjer (adenokarsinom (n = 14), plateepitelkarsinom (n = 23)) pasientprøver. Representative bilder av opp og ned regulert prøvene er vist.
Beta aktin
nivåer ble brukt for normalisering formål. B) En oppsummering av endringer i ekspresjon av de forskjellige CXC (ELR
+) kjemokiner og deres reseptorer i et panel av tumor /normal passet pasientprøver NSCLC. C) Samlet densitometry analyser av kreft /normal matchet pasient NSCLC prøver. Data tegnes som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (n = 37). (N – Normal, T – Tumor)
Uttrykk for
CXCL1-3
,
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
i en. panel av normale og lungekreft cellelinjer
Ved hjelp av RT-PCR, ble kjemokiner undersøkt i et panel av normale og NSCLC-cellelinjer (figur 2). Alle cellelinjer testet uttrykte varierende grad av
CXCL1-3 Hotell og
CXCL8
, med høyere basal uttrykk observert i NSCLC linjer. Imidlertid robust ekspresjon av begge reseptorer (
CXCR1 /2
) ble påvist i normale cellelinjer (HBEC3-5).
Panelet inkluderte A549 (adenokarsinom), SKMES-1 (skvamøst karsinom), H460, H647 og H1299 (stor celle karsinom), BEAS-2B (SV40 transformert normal bronchoepithelial) og HBEC cellelinjer (normale bronkiale epitel-cellelinjer udødelig i fravær av virale oncoproteiner).
Beta aktin
er inkludert for å validere lasteeffektivitet. (M – DNA størrelse markør, ve – Negativ RT-PCR-kontroll).
Histone acetylering er involvert i reguleringen av
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
uttrykk
Bruke histondeacetylase inhibitor (HDACi), Trichostatin A (TSA), en induksjon av
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
i både normal (HBEC4) og lungekreft cellelinjer (A549 og SKMES-1), med en samtidig reduksjon i
CXCL1-3 plakater (SKMES-1, s 0,05) (figur 3A) ble observert. Induksjon av
CXCL8
var betydelig i HBEC4 og SKMES-1 (p 0,05), som var økningen i
CXCR1 Hotell og
CXCR2
i både lungekreft celle linjer (A549 – p 0,05, SKMES-1 – p 0,01) og
CXCR1
i HBEC4 (p 0,05) (figur 3B). Reaktivering av ekspresjonen av disse reseptorene i NSCLC-cellelinjer vil indikere at disse genene er epigenetiske regulerte på nivået av histon acetylering. Behandling av cellelinjer med en ekstra histone deacetylase inhibitor, fenylbutyrat (PB), også resulterte i en reaktivering av
CXCR1 /2 plakater (data ikke vist), noe som indikerer at resultatene er HDACi bestemt. To kjemokiner ble valgt, CXCL2 og CXCL8, for bestemmelse av protein ekspresjon ved hjelp av ELISA. Mønsteret observerte reflektert som sett på mRNA-nivå i SKMES-1, med en reduksjon i CXCL2 og en økning i CXCL8 med TSA behandling (p 0,05) (figur 3C). Det var imidlertid ingen signifikant endring i proteinnivåene i enten A549 eller HBEC4 mellom basal og TSA behandlede celler (data ikke vist).
A) Virkningen av TSA-behandling (250 ng /mL i 16 timer) på uttrykk for
CXCL1 Anmeldelser –
3
,
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
. B) Densitometry analyse av uttrykk i behandlede versus ubehandlede prøvene når normalisert til
beta aktin
. Data tegnes som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (n = 3). C) Behandling med TSA bevirker også fremstilling av CXCL2 og CXCL8 på proteinnivå i SKMES-1-celler. Kjemokiner ble kvantifisert i kondisjonert medium fjernet fra kulturen etter eksponering for TSA (250 ng /mL i 16 timer). Data tegnes som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (n = 3). (UT – ubehandlet, TSA – Trichostatin A).
Regulering av
CXCL8 Hotell og
oppstår CXCR1 /2
gjennom direkte kromatin remodelle
for å bekrefte at de observerte effektene for HDACi skyldtes økt histone hyperacetylation på arrangører av
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
gener, gjennomførte vi kromatin immunoprecipitation (chip) analyse av den enkelte partnere fra A549 celler behandlet med TSA. Som det kan ses i figur 4, behandling med TSA resulterer i en økning i mengden av PCR-produktet for
CXCL8
og
CXCR1 /2
indikerer forbedret histon hyperacetylation rundt promotere for disse genene. Vi viser at lysin 9 og lysin 14 er hyperacetylated i denne regionen etter behandling med TSA. Dette eksperimentet viser klart at kromatin remodeling er direkte involvert i aktivering av
CXCL8 plakater (figur 4A),
CXCR1 plakater (figur 4B) og
CXCR2 plakater (figur 4C) genet uttrykk. I tillegg har vi også observert en økning i histon H3 lysin 4 tri-metylering (H3K4me3) på
CXCR1
promoter (data ikke vist) og fosforylering av serin 10 (H3K9pS10) på
CXCL8
promoter. En økning i H3K4 diemethylation (H3K4Me2) ble oppdaget med en samtidig reduksjon i H3K9 dimetylering (H3K9Me2) ved promoter regionen. Disse endringene har vært forbundet med aktivering av transkripsjon og tidlig responsgener, henholdsvis, og legge til ytterligere styrke til det bevis for at disse genene er dynamisk regulert av histon POS-translasjonelle modifikasjoner.
chip-analysen viser at behandling TSA resulterer i en økning i den acetylering av histon H3 og H4. A549-celler ble dyrket i nærvær eller fravær av TSA (250 ng /ml) i et tidsrom på 16 timer. Deretter ble en chip-målingen ble utført ved anvendelse av følgende antistoffer; panorere acetylert histon H3 (Ac H3) og H4 (Ac H4), histon H3 acetylert på lysin 9 og 14 (H3K9 /K14Ac), histon H3 acetylert på lysin 9 (H3K9Ac), histon H3 acetylert på lysin 9 og fosforylert på serin 10 (H3K9pS10), Histone H3 dimetylation markør på lysin 9 (H3K9Me2), dimetylation markør på lysin 4 (H3K4Me2) og metylering markør på lysin 4 (H3K4Me). Kromatinet status på promoter regionen (A)
CXCL8
, (B)
CXCR1 Hotell og (C)
CXCR2
vises. Input DNA fungerer som en positiv kontroll anbefalt av produsenten (Diagenode). En no antistoff kontroll ble tatt med for å teste for uspesifikk transport av DNA med histoner. (M – DNA størrelse stige)
Metylering er ikke direkte involvert i reguleringen av CXC (ELR
+) familie
Etter behandling av celler med et DNA metyltransferase. inhibitor (DAC), ble effektene på CXC (ELR +) familieuttrykk undersøkt ved hjelp av RT-PCR (figur 5). En betydelig reduksjon av
CXCL3
(p 0,01) ble observert i HBEC4 cellelinje og ikke i noen NSCLC-cellelinjer (figur 5B).
CXCL8
ekspresjon ble betydelig indusert i to av de tre cellelinjene (HBEC4 /SKMES-1 – p 0,05, figur 5B). De to reseptorer
CXCR1 Hotell og
CXCR2
ble betydelig indusert av DAC i HBEC4 (p 0,01) (figur 5A, B). DAC vist evne til å aktivere
CXCR1
men ikke
CXCR2
uttrykk i SKMES-1 (p 0,01) (figur 5A, B). DAC kan indusere
CXCR2
men ikke
CXCR1
i A549 (p 0,05) (figur 5A, B). Selv om denne informasjonen ville foreslå at DNA CpG metylering er involvert i regulering av uttrykk av CXC reseptorer og CXCL8, et søk på UCSC genom bibliotek (https://genome.ucsc.edu/) avdekket en sparsom antall CpG rester på promotorområdene for disse tre genene. Derfor tror vi en endring i ekspresjonsnivåene av denne familien kanskje på grunn av en sekundær effekt forårsaket av DAC behandling, slik som opp-regulering av spesifikke transkripsjonsfaktorer.
A) Virkningen av 5-aza- 2’deoxycytidine (DAC) behandling på uttrykk for
CXCL1 Anmeldelser –
3
,
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
. Celler ble dyrket i 1 uM DAC i 48 timer med media og medikament erstattet hver 24 timer. Expression endringer ble målt ved hjelp av RT-PCR med Beta-Actin brukt som intern kontroll for kvantifisering formål. B) Densitometry analyse av uttrykk i behandlede versus ubehandlede prøvene når normalisert til
beta aktin
. Data tegnes som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet. (N = 3). (DAC – 5-aza-2’deoxycitidine)
Cellular spredning av SKMES-en er redusert i nærvær av rekombinant CXCL8, mens økt i A549
Når behandles med ulike. konsentrasjoner av rekombinant CXCL8 (0,1-100 ng /ml) i et tidsrom på 24-72 timer, var det en tendens til reduksjon i proliferasjon i HBEC cellelinjen i forhold til ubehandlet kontrollgruppe (data ikke vist). CXCL8-behandling (100 ng /ml og 10 ng /ml) forårsaket en økning i proliferasjon i A549-cellelinjen (p 0,01 til 100 ng /ml, p 0,05-10 ng /ml) ved 72 timer etter behandlingen bare (figur 6A). Imidlertid, var det en signifikant reduksjon i proliferasjon ved 24 timer etter behandling i SKMES-1 (figur 6B) ved alle konsentrasjoner som ble testet (p 0,01, 100 ng /ml og 10 ng /ml; p 0,05 1 ng /ml og 10 ng /ml), men ikke på noe annet tidspunkt (data ikke vist). For å bestemme om den proliferativ effekt i begge disse cellelinjene var spesielt på grunn av CXCL8 behandling, ble en CXCR2 nøytraliserende tilnærming foretatt. Cellelinjer ble behandlet med SB 225002 ved en tidligere publisert IC
50 verdi på 22 nM [33] i en time før tilsetning av CXCL8 ved 100 ng /ml i 72 timer (A549) og 24 timer (SKMES-1 ) (figur 6C). Blokade av CXCR2 reseptoren negated proliferativ effekt i både A549 og SKMES-1 cellelinjer i forhold til CXCL8 behandling alene.
A) Celleproliferering ble undersøkt av BrdU analysen etter 24-72 timers behandling med CXCL8 i A549 ( 72 timer etter behandlingen) og SKMES-1 (24 timer etter behandlingen) cellelinjer. Bare tidspunkter med signifikante data vises. Data blir representert som en prosent av den ubehandlede kontroll (UT), som ble satt til 100%, og er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (N = 3) (ε p 0,01 – CXCL8 behandling
vs
UT, ψ p .. 0.05 – CXCL8 behandling
vs
UT) B) Cellelinjer ble behandlet med en selektiv CXCR2 antagonist (0.022μM) i 1 time før tilsetning av CXCL8 og dyrket i en periode på 24 (SKMES-1) eller 72 timer (A549). Data blir representert som en prosent av den ubehandlede kontroll (UT), som ble satt til 100%, og er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (N = 3).
Diskusjoner
CXC (ELR
+) chemokin familien, en potent pro-angiogene familie, ble funnet å være regulert epigenetiske både NSCLC og normale bronkial epiteliale cellelinjer på nivå med både histone posttranslasjonelle modifikasjoner.
i et panel av normale /svulst matchet prøvene, de chemokiner og reseptorer vises ikke endret uttrykk mønster mellom adenokarsinom og plateepitelkarsinom prøver, med unntak av
CXCL3 plakater (gjennomsnittsverdien opphøyd i squamous cell carcinoma og redusert i adenokarsinom). Høyere nivåer av CXCL8 har blitt oppdaget av IHC i lungekreft vevsprøver sammenlignet med normal [34], og i våre prøver nivåer av
CXCL8
mRNA ble forhøyet i 37,8% (14/37) prøver. Selv om de totale gjennomsnitts densitometry verdier (adenokarsinom n = 14 og plateepitelkarsinom n = 23) indikerer en reduksjon av kjemokiner i tumorprøver (figur 1C), dette var ikke sant for hver enkelt prøve (figur 1 A). På grunn av den heterogenisitet av prøvene, er det vanskelig å foreta en definitiv konklusjon er basert på disse resultater. Det må bemerkes imidlertid at uttrykk for mange av kjemokiner ble oftest funnet å være nedregulert i NSCLC tumorer som følger
CXCL1 plakater (64,9%, p 0,01),
CXCL2 product: ( 81,1%, p 0,01),
CXCL3 plakater (59,5%) (figur 1B). I tillegg nivåer av
CXCR1
ble også funnet å være betydelig redusert hos NSCLC tumorer (35,2%, p 0,05).
I et panel av NSCLC cellelinjer som ble behandlet med HDACi det var en reduksjon i
CXCL1-3
med en samtidig økning i
CXCL8 Hotell og reseptorene
CXCR1 Hotell og
to plakater (Figur 3B). TSA har tidligere vært vist til oppregulerer CXCL8 i lunge [35] og brystcancercellelinjer [36]. Reaktivering av disse reseptorene i lungecancercellelinjer skulle tilsi at de er under regulering epigenetisk på nivå med histone modifikasjon. Den generelle dogme forbundet med HDACi er at de fungerer for å indusere genekspresjon. Men i denne studien, TSA forårsaket både en opp- og ned-regulering av kjemokiner, en effekt ses av andre i andre studier. For eksempel har HDACi vist seg å ned-regulere Wilms tumor gen 1 (WT1) [37] og EGFR [38]. Begrensede tilgjengeligheten av spesifikke transkripsjonsfaktorer kan resultere i kun et visst antall av opp-regulerte gener. Som sådan aktivering av
CXCL8
kan føre til nedregulering til
CXCL1-3
, enten via en molekyl bryter eller ved titrering av transkripsjonsfaktorer bort fra promotorområdene for disse gener. Chip Resultatene indikerer at TSA virker ved direkte ombygging arrangøren regionen i
CXCL8 Hotell og
CXCR1 /2
gener (figur 4). Våre resultater viser at chip histoner H3 og H4 bli hyperacetylated på følgende gen-promotorer, som involverer lysiner 9 og 14 av histon H3, og lysiner 5, 8, 12 og 16 av histon H4. Vi observerer en sterk økning i nivåene av histon H3 lysin 4 dimetylering (H3K4me2) etter aktivering av transkripsjon via HDACi, og også observere et tap av histon lysin 4 monomethylation (H3K4me), etter aktivering av CXCL8 /CXCR1 /CXCR2. Etter avtale med dagens litteratur, observerer vi tilstedeværelsen av et undertrykkende mark H3K9Me2 på PGIS arrangøren før aktivering via HDACi, og nivåene av dette histone modifikasjon nedgang etter aktivering [39], [40]. Disse resultatene bekrefter at HDACi fører fører kromatin remodeling via histone posttranslasjonelle modifikasjoner rundt promoter-regionen i genene undersøkt noe som indikerer at det er aktivt element i reguleringen av disse kjemokiner og deres reseptorer.
DNA CpG metylering er også en viktig komponent i epigenetisk regulering av genekspresjon. Hypermethylated DNA blir ofte funnet i promotorområdene av tumorsuppressorgener i kreftformer, særlig i lungekreft [30]. Behandlinger med DNMTi DAC reaktivert uttrykk for
CXCR1
i A549 (figur 5B) cellelinje og
CXCR2
i SKMES-en (figur 5B).
