Abstract
PIK3CA plakater (phosphoinositide -3-kinase, kan katalytiske, alpha polypeptid) mutasjoner bidra til å forutsi den antitumor aktivitet av phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) /mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway hemmere i både prekliniske og kliniske settinger. I lys av den nylige oppdagelsen av tumor initiere kreft stamceller (cscs) i ulike krefttyper, har vi utviklet en
in vitro
CSC modell fra xenografttumorer etablert i mus fra en kolorektal kreft pasient svulst der CD133 + /EpCAM + befolkningen representert tumor initiere celler. CD133 + /EpCAM + cscs ble beriket etter stamcelledyrkningsforhold og dannet tre-dimensjonale kreftklumper. Tumor sfæroide celler utstilt CSC eiendommer, herunder mulighet for differensiering og selvfornyelse, høyere karsinogent potensial og cellegift-motstand. Genetiske analyser ved hjelp av en OncoCarta ™ panel avdekket en
PIK3CA (H1047R)
mutasjon i disse cellene. Ved hjelp av en dual PI3K /mTOR-hemmer, PF-04691502, så viste vi at blokkering av PI3K /mTOR sti hemmet
in vitro
spredning av cscs og
in vivo
xenograft tumor vekst med håndterbare toksisitet. Tumorvekstinhibitering i mus ble ledsaget av en signifikant reduksjon av fosforylert Akt (pakt) (S473), et veletablert surrogat biomarkør av PI3K /mTOR signalveien inhibering. Samlet våre data tyder på at PF-04691502 utstillinger potent anticancer aktivitet i tykktarmskreft ved å målrette både
PIK3CA (H1047R)
mutante cscs og deres derivater. Disse resultatene kan bistå i den kliniske utviklingen av PF-04691502 for behandling av en undergruppe av pasienter med kolorektal kreft med dårlige resultater
Citation. Fang DD, Zhang CC, Gu Y, Jani JP, Cao J, Tsaparikos K, et al. (2013) Antitumor effekt av Dual PI3K /mTOR Inhibitor PF-04691502 i et menneske Xenotransplantat Tumor Model Avledet fra Colorectal Cancer Stem Cells huse en
PIK3CA
Mutation. PLoS ONE 8 (6): e67258. doi: 10,1371 /journal.pone.0067258
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 23 desember 2012; Godkjent: 13 mai 2013; Publisert: 27 juni 2013
Copyright: © 2013 Fang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. forfatterne har følgende interesser. Alle forfatterne er enten nåværende eller tidligere ansatte i Pfizer, Funder av denne studien. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Tykktarmskreft er den tredje vanligste diagnosen kreft for både menn og kvinner i USA. Omtrent 103 170 nye tilfeller av kolorektal kreft er diagnostisert årlig, med ca 51 690 årlige dødsfall [1]. I tykktarmskreft, er PI3K /mTOR sti ofte dysregulerte grunn av mutasjoner i p110α subenheten av
PI3K
. Den PI3K /mTOR-signalveien er en viktig regulator av forskjellige celleprosesser, som proliferasjon, differensiering, apoptose, motilitet, metabolisme, og autophagy. Således har onkogen pathway aktivering blitt et attraktivt terapeutisk mål for legemiddelutvikling [2]. Prekliniske og kliniske studier indikerer at
PIK3CA
mutasjon i fravær av en
KRAS
mutasjon er en prediktiv markør for responsen på PI3K og mTOR-hemmere [3] – [6].
i tillegg til den nylig lansert mTOR-inhibitor everolimus, som brukes til behandling av et bredt spekter av krefttyper, en rekke av lavmolekylære inhibitorer av PI3K /mTOR-signaleringsreaksjonsveien er for tiden i klinisk utvikling [7] – [10]. Disse midler omfatter PI3K-selektive inhibitorer, AKT-inhibitorer, mTOR inhibitorer katalytiske sete, og dobbel PI3K /mTOR-inhibitorer. PF-04691502, 2-amino-8-[trans-4-(2-hydroxyethoxy)cyclohexyl]-6-(6-methoxypyridin-3-yl)-4-methylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7(8H)-one, er en potent dual hemmer av alle PI3K isoformer og mTOR (TORC1 og TORC2). De farmakologiske egenskapene til denne oralt virksomt middel ble nylig rapportert [11]. PF-04691502 potent hemmet rekombinant klasse I PI3K og mTOR i biokjemiske analyser og undertrykte transformasjon av aviær fibroblaster mediert av villtype PI3Kγ, δ eller mutant PI3Kα. PF-04691502 hemmet også mTORC1 aktivitet i cellene. I
PIK3CA
-mutant cancercellelinjer, PF-04691502 trykkes fosforyleringen av AKT (S473) og inhiberte celleproliferasjon [11]. PF-04691502 demonstrerte antitumor aktivitet i eggstokkene og glioblastom tumor xenograft modeller avledet fra kreftcellelinjer som bærer enten en
PTEN
sletting eller
PIK3CA
mutasjon [11] og i en genmodifisert mus modell av eggstokkreft kreft drevet av en
Kras
mutasjon og
PTEN
sletting [12]. Antitumor aktiviteter PI3K /mTOR-hemmere, inkludert PF-04691502, ved kolorektalkreft gjenstår å bli utforsket.
Nyere studier har vist at hierarkisk organiserte kolorektal tumorer komponere en liten undergruppe av CD133 + /EpCAM + uttrykker cscs [13 ], [14]. Cscs er avgjørende for tumorutvikling og progresjon, så vel som medikamentresistens og tumormetastase [15], [16]. Rømming av cscs fra dagens kjemo- og radiotherapies kunne forklare motstand og tumor tilbakefall [15], [16]. Betydningen av PI3K /mTOR-signaleringsnett i CSC biologi har blitt bemerket nylig [17]. Korrelasjonen av AKT-aktivering og økt tumorigenicity, stemness, og invasivitet ble identifisert i en glioblastom modell [18]. Aktivert PI3K signale ble funnet å spille en avgjørende rolle i den tumorigenesis av prostata basal /stamceller [19], [20]. I kombinasjon med andre midler, er blokkeringen av PI3K /mTOR bane i kreft i bukspyttkjertelen var i stand til å eliminere pancreatic cscs og leukemi stamceller, som viser den anti-CSC effekten av inhibering av PI3K /mTOR-reaksjonsveien [21], [22]. Tatt i betraktning de viktige funksjonene cscs, er det interessant å undersøke om terapeutiske midler rettet mot PI3K /mTOR signalveien er effektive i tykktarmskreft drevet av cscs skjuler en somatisk
PIK3CA
mutasjon.
Vi rapporterer her den orale effektiviteten av en dobbel PI3K /mTOR inhibitor, PF-04.691.502, i en human kolonkreft xenograft modell drevet av meget tumorigen CD133 + /+ EpCAM cscs. I pasientens tumor, CD133 + /EpCAM + celler representert av tumor-celler ved å initiere xenotransplantasjon. CD133 + /EpCAM + celler ble så spredd og beriket som tumor sfæroide celler under stamcelle forhold. Tumor sfæroide celler besatt de ekstra egenskapene til cscs, inkludert selvfornyelse, cellegift-motstand, høyere karsinogent potensial
in vivo
, og evnen til å rekapitulere de histopatologiske funksjonene i den opprinnelige pasienten svulst
in vivo
. Genetisk analyse av 19 vanlige onkogener avslørte at CSC befolkningen blir testet næret en
PIK3CA (H1047R)
mutasjon. Videre, en dobbel PI3K /mTOR inhibitor, PF-04691502, markert hemmet proliferasjonen av cscs
in vitro, etter samt veksten av xenografttumorer oppebåret av CSC-populasjonen i mus. Western blot analyse viste at pakt (S473) ble nedregulert i xenograft tumorer som ble behandlet med PF-04691502. Totalt sett, våre resultater tyder på at PI3K /mTOR pathway inhibitor PF-04691502 har potent anti-proliferativ aktivitet i
PIK3CA
mutant cscs som berettiger videre evaluering av hemmere i kolorektal kreftpasienter bærer PIK3CA mutasjoner.
Materialer og metoder
Dyr, pasientprøve, og etablering av pasient-avledet Xenotransplantat (PDX) Tumor Model
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra studien deltaker, en 39-år- gammel mann med kolorektal kreft, før operasjonen, og samlingen av vevsprøve. Prosedyrene ble godkjent av University of California i San Diego Menneskelig Forskning Protections Program Institutional Review Board (IRB). Alle eksperimentelle dyre prosedyrer følges Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (Institutt for Forsøksdyr Research, 1996), og ble godkjent av Pfizer Global Research and Development Institutional Animal Care og bruk komité. Kort, reseksjon avdekket en scene T3N2 dårlig differensiert kolorektal mucinous kreft med signet-ring cellefunksjoner. Kirurgisk reseksjon svulstvev ble kuttet i 2 til 4 mm
3 fragmenter og subkutant implantert i flanken av NOD /SCID-mus (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Håndgripelig P
0 xenografttumorer (den første generasjon i mus) dannet i mus ved seks uker etter implantasjon. Når størrelsen på tumorene nådde ca 500 mm
3, P
0 tumorer ble deretter ekspandert i ti NOD /SCID-mus ved subkutan re-implantasjon av tumorfragmenter for å generere P
1 xenograft tumorer. Den histopatologi av xenografttumorer ble anmeldt i sammenligning med pasienten svulst av et styre sertifisert patolog (PBL).
Tissue Bearbeiding og Tumor spheroid Kulturer av cscs
kirurgisk fjernet xenograft tumor vev fra mus ble enzymatisk dissosiert ved hjelp Accumax oppløsning (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) i enkle celler og dyrket i serumfritt stamcelle-medium ved 37 ° C i en 5% CO
2, fuktig atmosfære. Stamcelle medium ble generert ved kondisjonering serumfritt kulturmedium, som ble rutinemessig anvendt for humane embryonale stamceller (hESC), i mus embryoniske fibroblast kulturer i 24 timer og deretter blande det kondisjonerte mediet med friskt medium hESC (ved en 1:01 ratio) supplert med 4 ng /ml bFGF, 10 ng /ml EGF, 10 mg /ml bovint insulin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 5.5 mg /ml humant transferrin (Sigma-Aldrich), og 5 ng /ml natriumselenitt (Sigma-Aldrich, 23). Primære tumorceller dyrket i Ultra-lave vedlegg overflate kolber (Corning, Lowell, MA) for de første 3 månedene for å danne ikke-festede kreft kuler. Etter sfæroide cellekulturer ble stabil, ble CSC kulturer overført til Nunc ™ ikke-behandlede polystyren cellekulturflasker (Thermo Fisher Scientific, Rochester, New York).
flowcytometrisystemer og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)
Standard celleoverflateantigen merking og flowcytometri evalueringer ble utført. Dissosierte svulstceller ble analysert ved hjelp av fykoerytrin-konjugert CD133 (Miltenyi Biotech) og APC-konjugert epitel-spesifikt antigen EpCAM (CD326, epitelial celleoverflateantigenet, BD Biosciences) antistoffer. Cellesortering ble utført på en FACSAria Jeg celle sorter (BD). Ufargede celler og celler farget med isotype-matchet kontroll-antistoffer ble anvendt som negative kontroller. I primære celler isolert fra xenografttumorer, døde celler og murine celler ble utelukket ved hjelp av propidiumjodid (PI) og et anti-mus spesifikt monoklonalt antistoff konjugert til fluoresceinisotiocyanat (H-2k [d] -FITC; BD)., Henholdsvis
celleviabilitet Assay etter behandling med forbindelse
dissosiert levedyktig, enkelt sfæroide cscs og differensierte celler ble sådd ut på 10 000 og 5 000 celle /brønn, henholdsvis, i klare bunn 96-brønners plater (Corning) og behandles med de angitte forbindelser i 5 dager. Celleviabilitet ble bestemt ved hjelp av en CellTiter Glo® lysende celle levedyktighet analysen kit (Promega).
celleproliferasjon og differensiering Induksjon
Celleproliferering og cytokeratin uttrykk ble målt samtidig bruker en fluoresceinisotiocyanat 5- bromdeoksyuridin (BrdU) flyt kit (BD Biosciences) og anti-cytokeratin antistoffer (fysoerytrin-konjugert cytokeratin 7/8 CAM 5.2, BD Biosciences). CSC differensieringen ble indusert ved dyrking av sfæroide cscs i DMEM-medium supplert med 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) i regelmessige cellekulturflasker.
mutasjonsanalyse av onkogene mutasjoner
mutasjonssekvensering ble gitt av Sequenom (www.sequenom.com) ved hjelp av en OncoCarta ™ panel v1.0, som inneholder 238 hotspot mutasjoner i 19 onkogener innen 24 signalpakker. Resultatene ble analysert ved hjelp av funksjonen Oncomutations Rapporter i Typer 4,0 (Sequenom Inc, San Diego, USA) ved hjelp av funksjonen «OncoMutation Reports». Denne algoritmen reprocesses rå spektrale data og automatisk kompenserer toppområder basert på tidligere etablerte salt og matrise adduktpartiklene formasjoner som kan skjule C til A og G til T mutasjoner. De resulterende justerte data ble deretter screenet for mutasjon topper som overstiger 7% sammenlignet med villtype topp, og de rapporterte analysen ble hver for seg analysert og bedømt for gyldighets med kriterier som forlengelseshastighet, form på toppareal og plassering av topparealet over forventet topp plassering.
In vivo
tumorigenesis analysen
FACS-sortert CD133 + /EpCAM + og CD133- /EpCAM + celler isolert fra P
1 (nemlig 2
nd generasjon i mus) xenografttumorer ble blandet med Matrigel (BD, 01:01 volum ratio) og implantert subkutant i NOD /SCID-mus (The Jackson Laboratory) for å analysere deres evne til å initiere svulster. Tumorvolumer, som ble regnet som lengde × bredde × høyde × 0,5, ble målt på dag 84 etter implantasjon og er vist som gjennomsnitt ± SEM (n = 5).
In vivo
begrenset fortynningsassay
differensial tumorigene potensialer av de dyrkede cscs og deres differensiert avkom ble bestemt i SCID-bg mus (The Jackson Laboratory) ved å injisere titrerte antall celler blandet med Matrigel på en 1:01 ratio. Tumor volum ble målt med jevne mellomrom i en periode på 63 dager, og plottet som gjennomsnitt ± SEM (n = 5).
In vivo
Antitumor effektevalueringen
Tumor veksthemming studiene ble utført i SCID-bg mus. I korthet, 2 x 10
6 levedyktig dissosiert cscs ble inokulert subkutant, og mus med rundt 200 mm
3-tumorer ble tilfeldig delt i tre grupper som ble behandlet med 10 mg /kg PF-04691502 (PO, QD × 14 ; n = 8) eller vehikkel (0,5% metylcellulose i vann, PO, QD × 14; n = 8). Tumorvolumer er vist som gjennomsnitt ± SEM. Relativ endring av kroppsvekt (RCBW;%) ble beregnet som produktet av (BWI-BW0) /BW0 x 100%. Bwi var kroppsvekten på dag av doseringen, og BW0 var kroppsvekten på den første dag av behandlingen.
Western Blot analyse
kjøretøy- eller PF-04691502-behandlede tumorer var flash-frosset med flytende nitrogen. Frosne svulster ble homogenisert og lysert med 1 × cellelyse buffer (cellesignalisering Technologies). Lysater ble tømt av cellerester ved sentrifugering ved 14 000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C, ble supernatantene oppsamlet, og proteinnivåer ble kvantifisert ved BCA-proteinanalyse (Pierce). Like mengder protein ble løst ved polyakrylamidgeler. Etter overføring av proteinet til nitrocellulosemembraner, ble membranene blottet med det primære antistoff pakt (Ser473, cellesignalisering Technologies) eller α-tubulin (Sigma). Sekundære antistoffer ble kjøpt fra Amersham Biosciences. Bands ble oppdaget av chemiluminescence med SuperSignal West Dura substrat (Pierce), og bildene ble tatt med en AlphaImager system.
Statistical Analysis
Alle analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism (V.5.00 for Vinduer). Verdier av p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Etablering av PDX tumormodeller og Bekreftelse på CD133 + /EpCAM + Svulst CSC Befolkning
Fragmenter av fersk resected tumorprøve fra. en kolorektal kreftpasient ble subkutant implantert i to NOD /SCID-mus for å etablere en kolorektal kreft PDX-modell, som deretter ble brukt til å generere sfæroide cscs i kultur (arbeidsflyt for generering av sfæroide cscs vist i fig. 1A). Samtidig ble ferskt dissosierte primærceller fra pasientprøver testet for ekspresjon av tykktarmen CSC markører CD133 /EpCAM ved strømningscytometri (Fig. 1B). Etter eksklusiv ikke-levedyktige celler ved propidiumjodidfarging (Fig. 1B-a), omtrent 4-6% CD133 + /EpCAM + celler ble detektert i tumorvevet (fig. 1B-C), noe som tyder på tilstedeværelsen av mulige cscs.
en
, Schema illustrerer arbeidsflyten av spheroid CSC generasjon og differensierte cellepopulasjoner som en eksperimentell systemet, inkludert transplantasjon av en pasient svulst i NOD /SCID-mus, spredning av cscs fra P
1 xenografttumorer (sfæroide, 10 × objektiv forstørrelse) og differensiering av cscs inn heftende celler med epitelial morfologi (differensiert, 20 ×).
B
. Strømningscytometrisk analyse av de primære celler isolert fra den opprinnelige pasientens tumor. PI farging utelukker de døde cellene (a). APC- og PE-konjugert isotype kontroller er vist i (b). En befolkning på CD133 + /EpCAM + celler ble påvist (c).
C
. FACS av CD133 + /EpCAM + kolon cscs fra den primære cellepopulasjon avledet fra P
1 xenografttumorer. Døde celler og muse-celler ble først ekskludert av PI-farging og ved hjelp av et anti-mus spesifikt monoklonalt antistoff H-2k [d], henholdsvis (A og B). CD133 + /EpCAM + og CD133- /EpCAM + populasjoner ble inngjerdet i henhold til grunnlinjene av isotype kontroller og sortert (c). Til slutt, anrikning av begge populasjoner i de sorterte prøvene ble bekreftet ved flowcytometri (D . P 0,01). Disse resultatene bekrefter at tykktarmskreft består av en liten bestand av tumor initiere cscs, som er positivt for CD133 og EpCAM uttrykk.
A
. Gjennomsnittlige tumorvolumer i NOD /SCID-mus inokulert med CD133 + /EpCAM + (3400 celle /dyr; antatte cscs) eller CD133- /EpCAM + (25.000 celle /dyr; putative differensierte celler) etter 12 ukers implantering (gjennomsnitt ± SEM; n = 5 ).
B
. Andel CD133 + /EpCAM + uttrykker celler i CSC og differensierte cellepopulasjoner (gjennomsnitt ± SEM, n = 3; uparet, tosidige student t-test, p 0,05).
C
. Representative resultater av celleproliferasjon priser og uttrykk nivåer av cytokeratin i cscs og differensierte celler. Celle tall på Y aksene er justert i prosent av maksimal celle tall analysert.
D
. Representative data som viser
in vitro
narkotika følsomheten cscs og deres differensiert avkom i respons til oksaliplatin som vurderes av CellTiter Glo® analysen.
Generering av Stabile spheroid Kulturer av cscs
Etter dyrking primære celler isolert fra p
1 xenograft tumorer i serumfritt medium stamcelle, ikke-klebende tre-dimensjonale sfæroider ble observert i løpet av 2-3 uker (fig. 1A), og ytterligere utvidelse av kultur genereres en stor mengde kuler innen 2 måneder. Flowcytometrisk analyse av dyrkede sfæroide celler viser at CD133 + /EpCAM + celler består 33,2% av de totale celler (figur 1D;. Panelet til høyre), noe som tyder på at CD133 + /EpCAM + celler ble beriket ca. 5 ganger i tumor spheroid kultur i forhold til 4-6 % av CD133 + /EpCAM + celler i både den opprinnelige pasientprøven og de xenograft tumorer (fig. 1B og data ikke vist, henholdsvis). Tumor sfæroide celler ble stadig dyrkes
in vitro
løpet av de siste 2,5 år uten å vise en betydelig endring i CD133 /EpCAM uttrykk nivåer eller tegn på alderdom. CSC egenskapene til tumor sfæroide celler ble demonstrert i eksperimentene som er beskrevet nedenfor. Tumor sfæroide cellene blir dermed henvist til i teksten som cscs.
relativt stille, Undifferentiated State of cscs
Å indusere differensiering av cscs, ble kreft sfæroide cellene dissosiert til enkeltceller og dyrket i serum-inneholdende medium, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Heftende celler med epitelial morfologi dukket opp innen 1-2 dager (Fig. 1a) og fortsatte å forplante seg raskt i 2-3 måneder før spredning stoppet. I overensstemmelse med våre tidligere funn i CSC-populasjonen direkte avledet fra en pasientprøve [23], en reduksjon av CD133 + /EpCAM + cellefraksjon ble observert i den fastsittende, differensierte celler (11,2%, fig. 2B).
Det har vært innblandet som cscs beholde en hviletilstand. Vi vurderte celleproliferasjonsprosesser priser ved å bruke en BrdU flowcytometri kit. Resultatene viste at den anrikede CSC populasjon inneholdt ~38.5% BrdU-positive celler sammenlignet med ~51.6% i differensierte celler. Redusert BrdU-inkorporering i CSC-populasjonen indikerer at disse cellene var relativt stille i forhold til differensierte celler (Fig. 2C). Tilsvarende brøkdel av cytokeratin-uttrykkende celler i cscs var mindre (~17.8%) sammenlignet med den i den differensierte cellepopulasjonen (~44.7%, Fig. 2C). Som cytokeratin er en generell markør for epitelial differensiering, lavere nivåer av cytokeratin uttrykk i cscs er veiledende av sin relativt udifferensiert tilstand.
Drug Resistance of cscs
In vitro
celle levedyktighet analyser viste at sammenlignet med differensierte celler, cscs utstilt betydelig motstand mot oksaliplatin (figur 2D,. forskjell i lineær regresjon skråningen; P 0,01). Våre funn er i samsvar med tidligere rapporter som viser resistent natur cscs [24] -. [26], noe som tyder på at disse cellene kan være ansvarlig for klinisk tilbakefall hos kreftpasienter etter kjemoterapi
tumorigenitet og Tumor Utvikling av cscs
in vivo
Varierende mengder (dvs. 10
3, 10
4, 10
5 og 10
6 celler /dyr) av dissosierte cscs og differensierte celler ble inokulert subkutant på fem SCID-mus bg. Svulsten ta frekvenser mellom de to gruppene viste seg å være lik (figur 3B.); Men de gjennomsnittlige tumorvolumer ble dramatisk større i mus implantert med 1 x 10
5 eller 1 x 10
6 cscs enn i gruppene injisert med det samme antall differensierte celler (fig 3a;. forskjell i lineær regresjon skråning, P 0,01). Disse resultatene tyder på at cscs er mer tumorigent forhold til deres differensiert celle avkom.
A
. Tumorvolumer i
in vivo
begrensende fortynning analysen for cscs og deres differensiert avkom i SCID-bg mus som beskrevet i Materialer og metoder (gjennomsnitt ± SEM, n = 5). Forskjeller i vekstratene ble funnet mellom CSC og differensierte cellegrupper inokulert med høyere celletall (1 × 10
6 og 1 x 10
5; skråningen forskjell i avstamning regresjon; P 0,01).
B
. Tumor ta priser etter 63 dager etter implantasjon for cscs og differensiert avkom.
C
. H E farget deler av primær pasienten tumor (
en
) og xenografttumorer avledet fra cscs (
b
) og differensierte celler (
c
, øvre panel, 40 ×, nedre panel, 4 ×). Signet-ring celler ble ofte identifisert i både pasient og CSC-drevne svulster og er indikert med piler (a og b ved 40 ×). En prikkplott viser frekvensen av signet-ring celler identifisert i pasientens svulst, CSC-avledet xenograft og differensierte celler-avledet xenograft (d).
gjentagelse av Pasient Histopatologi og frekvens av CD133 + /EpCAM + celler i xenografttumorer
xenografttumorer avledet fra cscs og differensierte celler ble behandlet for histologisk undersøkelse for å sammenligne med morfologi av primær pasienten svulst. Signet-ring-celler ble ofte identifisert i både pasientens tumor (fig. 3C-a) og de CSC-avledede xenografter (fig. 3C-b). Signet-ring-celler inneholder et enkelt cytoplasmatisk vakuole, som eksentrisk forskyver kjernen (merket med piler). I motsetning til dette, signet-ring-celler var nesten fraværende i de differensierte celle-stammer xenotransplantater (fig. 3C-c). Basert på vurdering av en bord-sertifisert patolog, prosentandelen av de signet-ring cellene var omtrent 45%, 38% og 1% for pasienten svulst, CSC-avledet xenograft og differensiert celle-avledet xenograft henholdsvis (figur 3C -d). Disse resultatene indikerer at xenografttumorer stammer fra CSC befolkningen bedre rekapitulere de histologiske funksjonene i den opprinnelige pasienten svulsten.
Før implantasjon hos mus, prosentandelen av celler som uttrykker CD133 + /EpCAM + markører var høyere i CSC-beriket befolkningen (33,2%) enn i differensierte celler (11,2%, fig. 2B). Til tross for de høyere prosentandeler av CD133 + /EpCAM + celler i den dyrkede CSC befolkning, prosentandelen av CD133 + /EpCAM + -celler i de xenograft tumorer ble redusert til 4-6%, noe som er konsistent med prosentandelen av CD133 + /EpCAM + celler observert i det opprinnelige pasientens tumor (fig. 1BC og fig. 4A). I motsetning til dette ble det observert ~ 2% CD133 + /+ EpCAM celler i differensiert celle xenograft tumor (Fig. 4A). Disse resultatene tyder på at kultur cscs skille ved implantasjon.
A
. Flowcytometrisk analyse av CD133 + /EpCAM + fraksjonen i xenografttumorer generert av cscs og differensiert avkom. Data er vist som CSC-frekvens som representerer prosenten av CD133 + /EpCAM + celler i svulster i to forskjellige opprinnelse (gjennomsnitt ± SEM, n = 3; uparet, to-halet student t-test, P 0,05).
B
. Re-implantasjon av tumorfragmenter hentet fra cscs eller differensierte celle-avledet xenografttumorer i videregående SCID-bg mus. Tumorvolumer er vist som gjennomsnitt ± SEM (n = 5). Forskjellen i vekstkurver mellom de to gruppene er statistisk signifikant (forskjell i helling ved lineær regresjon; P 0,05).
C
. Celleproliferasjon av de primære celler isolert fra enten cscs eller differensierte celle-stammer xenograft tumorer i stilk-cellekultur tilstand. Levedyktige celler ble sådd ut i 20.000 celler per brønn og dyrket i 17 dager. Celleantallet ble tellet manuelt, og de totale celletall er vist som gjennomsnitt ± SEM (n = 6; uparet, to-halet student t-test, P 0,01).
D
. Spheroid CSC kulturer reetablert under stamcelle forhold fra xenografttumorer generert av serie implantasjon av CSC-avledet xenografttumorer. P
2, cscs dyrkede fra xenografttumorer stammer fra de opprinnelige cscs. P
3, cscs dyrkede fra xenografttumorer avledet fra P
2 cscs.
E
. Delvis MALDI-TOF massespektrum viser H1047R mutasjon i
PIK3CA
. De røde stiplede linjene indikerer, fra venstre til høyre, den unextended primer topp, de 3 mulige topper for mutant G eller T-alleler og villtype A-allelet. Den høye toppen i midten av figuren er en T-allelet av
PDGFRA
i samme MALDI-TOF massespekteret.
selvfornyelse kapasitet cscs
evnen til å fornye seg selv, en viktig egenskap ved cscs, ble vurdert av serie transplantasjon av xenografttumorer, som beskrevet i Materialer og metoder. Kort sagt ble xenograft tumorer avledet fra cscs eller differensierte celler fjernet fra tumor-bærende mus. Tumorfragmenter (2-4 mm
3) ble implantert subkutant i sekundær SCID-mus bg. Xenografttumorer (utpekt som P
2 xenografttumorer) stammer fra differensierte celletumorfragmenter vokste sakte i forhold til svulster avledet fra CSC tumorfragmenter (Fig. 4B). Resultatene av de ovennevnte serie implantering eksperiment antyder at CSC opprinnelse svulster vokse mer aggressivt i forbindelse med en større prosentandel av cscs inne i cellen /fragment implantatet. Følgelig
in vitro
dyrking av primære tumorceller avledet fra tumor xenograft stammer fra cscs utviste en høyere proliferativ evne i henhold til stamcelle betingelser sammenlignet med de som er isolert fra svulster som stammer fra differensierte celler (Fig. 4C). Disse resultatene tyder på at primære celler fra CSC-deriverte svulster kan ha en vekstfordel
in vitro
mest sannsynlig på grunn av sin høyere innhold av cscs.
spheroid cscs (betegnet som S
2 ) ble sekvensielt etablert fra P
2 xenografttumorer (fig. 4D). Når implantert i mus, S
2 cscs konsekvent dannet raskt voksende P
3 xenografttumorer (data ikke vist). S
3 cscs ble også gjenopprettet fra primære celler generert fra P
3 svulster (fig. 4D). Både S
2 og S
3 cscs inneholdt CD133 + /+ EpCAM-celler ved nivåer som er sammenlignbare med foreldre cscs (30-40%; data ikke vist). Ovennevnte Resultatene tyder på at
in vitro
dyrkede kolorektal cscs er i stand til selvfornyelse.
Analyse av Common onkogene mutasjoner i cscs og biomarkører
For å identifisere prediktive biomarkører som kan potensielt lede målrettet terapi, gjennomførte vi genetisk analyse med panel bruker DNA OncoCarta ™ isolert fra dyrkede cscs og differensierte celler. Mutasjonsanalyse av 19 vanlige onkogener, inkludert
ABL1, akt1, akt2, BRAF, CDK, EGFR, erbB2, FGFR1, FGFR3, FLT3, JAK2, KIT, MET, HRAS, KRAS, NRAS, PDGFRα, PIK3CA, etter og
RET
, ble gjennomført. Interessant nok var bare
PIK3CA (H1047R)
mutasjon identifisert i begge celletyper (Fig. 4E).
Dyp antiproliferative aktivitet av PF-04691502 i Mutant cscs
da bestemt
in vitro
antiproliferative aktivitet av PF-04691502, en potent dual hemmer av alle PI3K isoformer og mTOR (TORC1 og TORC2). Faktisk, PF-04691502, viste en betydelig inhiberende virkning på celleformering av cscs (Fig. 5A). Interessant, i motsetning til oxaliplatin (se fig. 2D), PF-04691502 viser en tilsvarende inhiberende effekt på både muterte cscs og deres differensiert avkom (IC
50 = 202 nM og 195 nM, respektivt), noe som tyder på at den antiproliferative aktivitet av PF
B
. Som vist på fig.
