Abstract
Planter i mahognifamilien familien er kjent for å ha interessante biologiske aktiviteter, for eksempel antimalaral, antihypertensive og antitumoraktiviteter. Tidligere vår gruppe rapporterte plante-avledet forbindelsen cycloart-24-en-26-ol-3-on isolert fra heksan-ekstrakter av
Aglaia exima
blader, som viser cytotoksisitet mot forskjellige kreftcellelinjer, særlig , tykktarmskreft cellelinjer. I denne rapporten har vi videre vise at cycloart-24-en-26-ol-3-en, herfra videre kjent som cycloartane, reduserer levedyktigheten av tykktarmskreft cellelinjer HT-29 og CaCO-2 i en dose og tidsavhengig måte. Ytterligere belysning av forbindelsens mekanisme viste at det binder seg til tumor nekrose faktor-reseptor 1 (TNF-R1) som fører til initiering av caspase-8 og, gjennom aktivering av bud, i aktiveringen av caspase-9. Denne aktiviteten fører til en reduksjon i mitokondriemembranpotensialet (MMP) og av frigjøring av cytokrom-C. Aktiveringen av caspase-8 og -9 begge virker til å begå kreftcellene til apoptose gjennom nedstrøms caspase-3/7 Aktivering, PARP spalting og mangel på NFkB translokasjon inn i kjernen. En molekylær docking studie viste at cycloartane binder seg til reseptoren gjennom en hydrofob interaksjon med cystein-96 og hydrogenbindinger med lysin-75 og -132. Resultatene viser at videreutvikling av cycloartane som en anti-kreft narkotika er verdt
Citation. Leong KH, Looi CY, Loong X-M, Cheah FK, Supratman U, Litaudon M, et al. (2016) Cycloart-24-en-26-ol-3-en, en New Cycloartane Isolert fra Blader av
Aglaia exima
Triggere Tumor nekrose faktor-reseptor 1-mediert caspase-Dependent apoptose i tykktarmskreft cellelinje . PLoS ONE 11 (4): e0152652. doi: 10,1371 /journal.pone.0152652
Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Senter for Bioteknologi, INDIA
mottatt: 26 april 2015; Godkjent: 17 mars 2016; Publisert: 12. april 2016
Copyright: © 2016 Leong et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Universitetet i Malaya [tilskudd RP001 /2012A, RP001A-13BIO]; Universitetet Malaya High Impact Forskning [tilskudd H-20001-E00002]; og departementet for høyere utdanning i Malaysia [innvilge FP006-2011A]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en ødeleggende sykdom som rammer en betydelig del av verdens befolkning, og det er faktisk et globalt helseproblem. Tykktarmskreft er fortsatt en av de mest utbredte kreftformer blant pasienter i USA, som utgjør 8% og 9% av alle krefttilfeller for menn og kvinner, henholdsvis [1]. Til tross for de siste fremskritt i kreft behandlinger, som for eksempel utvikling av målrettet terapi [2], de relative overlevelse for pasienter som lider av kolorektal kreft har ikke bedret seg vesentlig [3]. Videre kjemoterapi ved hjelp av syntetiske stoffer fører ofte bivirkninger, for eksempel hår tap, blødning, diaré og myelotoksisiteten [4]. Forskere fortsette å søke etter nye terapeutiske midler som er mer selektiv mot kreftceller og som genererer færre bivirkninger.
Planter er fortsatt en av de største kildene til naturlige produkter som brukes til å oppdage nye kjemoterapeutika [5-6 ]. Spesielt ble noen nye forbindelser oppdaget fra planter som hadde unike virkningsmekanismer, økt potens eller lavere skadevirkninger enn i dag brukt narkotika [7]. I samarbeid med franske institusjonene for å søke etter nye legemidler, utførte vi foreløpig fytokjemisk profilering av anlegget
Aglaia exima
. Aglaia er den største slekten av mahognifamilien familien, og Aglaia trær ofte vokser i tropiske og subtropiske skoger i fastlands-Kina, Indo-malaysiske og Stillehavsøyene. Aglaia tre deler (blader, blomster og spiselige frukter) har flere medisinske egenskaper, slik som anti-inflammatorisk, anti-kreft, anti-diabetic egenskaper. Seks triterpenoids og to steroider tidligere isolert fra bladene av
Aglaia exima
av vår gruppe. Tidligere viste vi at den nye cycloartane utstilt høyeste cytotoksiske effekt på tykktarmskreft cellelinjen HT-29 av alle forbindelser isolert fra
Aglaia exima
av vår gruppe, med en IC
50 på 11,5 mikrometer [8]. Interessant, tidligere studie rapporterte cycloartane fra
Aglaia
arter vises 10 ganger høyere selektivitet mot tykktarmskreft cellelinje HT-29 i forhold til vanlig kolon cellelinje CCD-112CoN [9].
De fleste av dagens kjemoterapi narkotika utløser apoptose å forårsake kreft celledød. Apoptose er en aktiv prosess med programmert celledød som oppstår med bestemte morfologiske og biokjemiske endringer i cellene [10]. Disse morfologiske endringer omfatter eksternalisering av fosfatidylserin på celleoverflaten, membran blebbing, kromatin kondensering og dannelse av apoptotiske legemer [11]. Fremgang i å forstå signalisering av apoptose har ført til to store veier start blir allment akseptert, nemlig ytre og indre apoptose veier. Den ytre vei blir utløst gjennom død reseptorer på celleoverflaten, mens den indre reaksjonsveien er utløst av frigjøring av proapototic faktorer, så som cytokrom c, fra cellens mitokondrier [12]. Tumornekrosefaktor reseptorer, trans proteiner, er blant de kjente eksterne dødsreseptorer. Disse reseptorene består av to typer: tumor nekrose faktor reseptor-1 (TNF-R1) og -2 (TNF-R2). TNFR-1 er ubikvitært uttrykt i de fleste celler, mens TNFR-2 er hovedsakelig funnet i oligodendrocytter, astrocytter, T-celler, myocytes, thymocytter, endoteliale celler og stamceller [13]. Overlevelse og død fremgangsmåte er i hovedsak regulert av TNF-R1, da denne reseptoren inneholder et intracellulært død domene som ikke er til stede i TNF-R2. Når aktivert, død domene rekrutterer andre dødssignaler, for eksempel Tradd, FADD og pro-kaspase-8, for å danne en dødsinduserende signale-kompleks (DISC). Utgivelsen av caspase 8 signaler Bud for å aktivere Bax, Bad, og cytokrom C i cellens mitokondrier. Aktivering av TNR-R1 er antatt å forårsake at metallprotease TACE å frigjøre ekstracellulære komponent av reseptoren som oppløselige TNF-R1 (sTNF-R1), som er et cytokin som er i stand til å aktivere andre TNF-R1s å forsterke den dødssignaler [ ,,,0],14].
Men hoved bødler av apoptotiske trasé er proteaser av caspase familien som proteolytisk desintegrerer cellene i form av apoptotiske legemer. Denne familien av proteaser er delt inn i bøddelknektene kaspaser, som kaspase-3 og 7, og initiator kaspaser, som kaspase 8 og 9. Initiator caspase-8 er kjent for å bli aktivert gjennom døds reseptorer, mens caspase-9 aktiveres av cytokrom c lekkasje fra mitokondriene. Disse initiator caspases føre til nedstrøms aktivering av caspase 3 og 7, forplikter cellen til apoptotiske død. I motsetning til nekrose, apoptose er en ikke-inflammatorisk celledød vei, som har fordelen av å minimalisere uønskede effekter på naboceller [15]. Derfor forskere er stadig på jakt etter små molekyler som kan utløse apoptose i behandling av kreft. I denne studien, vurderte vi anti-kreft potensialet i cycloartane i menneskets tykktarm kreft cellelinje HT-29, med fokus på den apoptotiske mekanismen bak denne aktiviteten.
Materialer og metoder
Cellekultur og cytotoksisitet analysen
menneske~~POS=TRUNC cellelinjer (HT-29 og CaCO-2) ble hentet fra den amerikanske Tissue Culture Collection (Rockville, MD). Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 50 ug /ml gentamycin og 2,5 ug /ml amfotericin B (Gibco, Carlsbad, CA) i en fuktet inkubator ved 37 ° C med en atmosfære av 5% CO
2.
cytotoksisitet av cycloartane ble vurdert opp mot 2 tykktarmskreft cellelinjer (HT-29 og CaCO-2). Cellene ble sådd ut i en tetthet på 5 x 10
3-celler per brønn i 96-brønners plater og behandlet fortløpende med forbindelsen (0,39 til 200 uM), eller cisplatin (3,9 til 2000 pM) eller 5-fluorouracil (200- 8 x 10
-6 mM) i 24, 48 og 72 timer. Cisplatin og 5-fluoruracil med mer enn 99,9% renhet ble oppnådd fra Sigma-Aldrich. Kontrollbrønner ble behandlet med 0,05% volum /volum DMSO i kulturmediet. Ved slutten av behandlingen, mediet ble forsiktig oppdateres, og 20 ul av MTS-reagens (CellTiter 96 AQ
ueous® One Solution, Promega, Madison, WI) ble tilsatt. Platene ble inkubert i 2 timer, og absorbansen ble avlest ved anvendelse av en mikroplateleser (uendelig 200, Tecan, Männedorf, Sveits) ved 490 nm med 690 nm som bakgrunn bølgelengde. De levedyktige celler ble beregnet i prosent i forhold til kontrollbrønner, og IC
50 ble bestemt ved hjelp av dose-responskurve montert ved bruk av Prism software 5,02 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer, og resultatene er rapportert som aritmetisk gjennomsnitt ± SD
apoptose og cellesyklusanalyser
apoptose og cellesyklus analyser ble utført separat med kommersiell Annexin V:. FITC apoptose Detection Kit jeg og CycleTest ™ Plus DNA Reagens kit, henholdsvis (BD Biovitenskap, San Jose, California). Celler ble sådd ut i 5 x 10
5 celler per brønn i tolv-brønners plater. Etter over natten vedlegg, ble cellene behandlet med forbindelsen på 12,5, 25 og 50 uM i 24 timer for apoptose analyse og ved 2,5 uM til 12, 24 og 48 timer for cellesyklusanalyse. Etter behandling ble cellene høstet ved mild trypsinisering og sentrifugert ved 1500 x g i 5 minutter. Cell farging ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. En DNA QC Partikler kit ble brukt til å kalibrere FACSCanto II flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, California). Cellepopulasjoner ble utsatt for cytometrisk analyse, og kvadrantene ble satt i henhold til populasjonen av levedyktige celler i ubehandlede prøver. FacsDiva 5.0.3 programvare (BD Biosciences, San Jose, CA) ble brukt til å beregne prosent av cellene i de respektive kvadranter for apoptose analyse, og Mod Fit LT programvare (Verity Software House Inc., Topsham, ME) ble brukt for cellesyklusanalyse.
Mitokondriell membranpotensialet Δѱm (MMP), cytokrom c utgivelsen analyse og NFkB trans
En Cellomics Multiparameter Cytotoksisitet 3 Kit for MMP og cytokrom frigjøring og Nucleus Factor kappa B Activation Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ble anvendt som tidligere beskrevet [16]. Celler ble sådd ut i 1 x 10
4 celler per brønn i 96-brønners plater over natten. Cellene ble vasket og inkubert med forbindelse i 24 timer ved forskjellige konsentrasjoner (3,125 til 50 uM). Når det gjelder trans NFkB-aktivitet, ble cellene behandlet ved 12,5 pM av cycloartane alene eller 10 ng /ml TNF-α alene eller 12,5 uM cycloartane og 10 ng /ml TNF-α i kombinasjonsbehandling. Deretter ble cellene fiksert med 4% formaldehyd i 15 minutter og deretter permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i fosfatbuffer saltvann (PBS). Etter fiksering ble cellene inkubert med MMP fargestoff eller blokkert med 3% bovint serumalbumin, etterfulgt av NFkB primært kanin-antistoff eller cytokrom c primærmuseantistoff og deretter geite-anti-kanin-sekundært antistoff konjugert med DyLight
TM 488 eller geit anti- mus sekundære antistoff konjugert med DyLight
TM 649 for en time hver. Cellene ble skylt tre ganger med vaskebuffer II (1 x PBS med 1% Tween-20). Kjernene ble farget med Hoechst 33258. Deretter ble de fargede celler visualisert, og bildene ble tatt med Cellomics ArrayScan HCS leser ((ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Cellen helse profilering bioapplication modulen ble brukt til å kvantifisere fluorescens intensitet hver farge.
caspase aktivitet og inhibitor analyser
celler ble sådd ut i hvite 96-brønners plater på 1 x 10
4 celler per brønn og fikk lov til å feste. Deretter cellene ble behandlet med forbindelsen (50 uM) for forskjellige tidsperioder (1, 3, 6, 12, 18, 24 og 30 timer). Caspase-aktivitet ble målt ved å tilsette 50 ul av Caspase-Glo® 3/7 (Z- DEVD-aminoluciferin), caspase-Glo® 8 (Z-LETD-aminoluciferin) eller caspase-Glo® 9 (Z-LEHD-aminoluciferin) (Promega, Madison, WI) og deretter lese luminescens ved hjelp av en mikroplateleser (Infinite 200, Tecan, Männedorf, Sveits). virksomheten til de enkelte kaspasene ble uttrykt som gangers økninger med hensyn til ubehandlet kontroll. for at inhibitoren analysen ble cellene forbehandlet med 10 uM caspase 3-inhibitor (Z-DEVD-FMK), caspase 8 inhibitor (Z-IETD-FMK), caspase 9 inhibitor (Z-LEHD-FMK) eller generell kaspaseinhibitor (Z-VAD-FMK) i 30 minutter. Deretter ble cellene inkubert med forbindelsen (50 uM) i 18 timer, og kaspase-analyser ble utført som beskrevet ovenfor. Etter ytterligere 6 timers inkubering med forbindelsen, ble cellenes levedyktighet målt ved bruk av MTS-reagens, som beskrevet i cellekultur og cytotoksisitet analyseseksjonen.
Protein ekstraksjon, protein matrise og western-blotting analyser
En total på 1 x 10
6-celler ble behandlet med forbindelsen (50 uM) eller TNFa (10 ng /ml) som positiv kontroll for NFkB translokasjon, og forandringer i protein ekspresjon ble målt over tidsintervaller på 6, 12, 18 og 24 timer. Cellene ble høstet, vasket med iskald PBS og lysert i M-PER-buffer innehold Pierce 1x Halt protease inhibitor cocktail for de totale cellulære ekstrakter eller NE-PER-buffer for cellulære nukleære ekstrakter i NKkB eksperimenter eller Mem-PER Plus buffer for cellemembranprotein ekstrakter i TNF-R1 eksperimenter (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). For proteinet matrisen, ble uttrykket nivåer av 43 apoptose-relaterte proteiner i cellelysatet bestemt ved bruk av Menneskelig RayBio Apoptose Array G1 kit, i henhold til leverandørens protokoll. Brett endringer mellom behandlede og ubehandlede prøvene ble analysert ved hjelp av RayBio Antistoff Array Analysis Tool (RayBiotech, Norcross, GA). For western blot, cellelysater (20 ug protein /brønn) ble kokt i 5 minutter og deretter løst i 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og elektroforetisk overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,5% Tween 20 (TBST) i 1 time og inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C. Pakkene som ble benyttet var den apoptose-antistoff sampler kit (# 9915), pro-apoptose Bcl-2-familien antistoff sampler kit (# 9942), og død reseptor sampler kit (# 8356), og antistoffene som ble anvendt var den nukleære faktor-kappa B p65 (# 8242), beta-aktin (# 8457) og Lamin B2 (# 13823) antistoffer (Cell Signaling, dansere, DA). Deretter ble membranene vasket med TBST-buffer og inkubert med det passende pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (geite-anti-kanin-IgG) (# 7074). Membraner ble utviklet ved hjelp av en forbedret chemiluminescence kit (Super Signal West Dura, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).
Computational molekylær docking og statistiske analyser
The X-ray krystallstrukturen av tumor nekrose faktor reseptor 1 (TNF-R1) ble hentet fra Protein data Bank (PDB oppføring 1NCF) og utarbeidet etter den CHARMM kraftfelt. Docking ble utført ved hjelp av c-Docker modul av Discovery Studio 4.1 programvare (Acceryls, San Diego, California) for å simulere samspillet mellom sammensatt og TNF-R1. Bindingen samspillet energi ble beregnet ved hjelp av
in-situ
minimering verktøy for å innlemme fleksibel docking på dokket stedet, etter en tidligere beskrevet protokoll [17]. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av t-test eller ANOVA med Bonferroni post-test i Prism 5.02 programvaren for å fastslå betydelige forskjeller mellom de eksperimentelle og kontrollgrupper (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA), og statistisk signifikans ble definert som p ≤ 0,05 eller p ≤ 0,01.
Resultater
cytotoksiske effekten av cycloartane på HT-29 og CaCO-2 tykktarmskreft cellelinjer
den kjemiske strukturen til cycloartane er vist i figur 1. Både, HT-29 og CaCO-2-celler ble behandlet med forskjellige doser 0.39-200 uM av forbindelsen i 24, 48 og 72 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTS-analyse. Som vist i figur 2, blir forbindelsen redusert cellelevedyktighet i en dose- og tidsavhengig måte. I tillegg IC
50 verdier av cycloartane var 3-30 ganger lavere enn den for standarden chemodrug cisplatin (3,9 til 2000 pM) i hver behandlingstiden punkt, 42-862 ganger lavere sammenlignet med 5-fluorouracil ved 24 og 48 timers tids poeng, men 16-27 ganger mer potent etter 72 timers behandling (tabell 1). IC
50 oppnådde verdier ble brukt som en guide for de påfølgende forsøkene.
Forbindelsen har en cyclopentano per hydro fenantren stillas med en cyclopropane ring mellom C-9 og -10. Sidekjeden knyttet til C-17 har en hydroksylgruppe substituent ved C-26.
For cycloartane (0,39 til 200 uM) av HT-29 (A) og CaCO-2 (B) celle linjer, cisplatin (3,9 til 2000 pM) på HT-29 (C) og CaCO-2 (D) cellelinjer ved 24, 48 og 72 timer, 5-fluorouracil (200-8 x 10
-6 mM) videre HT-29 og CaCO-2-cellelinjer ved 24 (E), 48 (F) og 72 (G) timer. Vesentlige forskjeller er angitt: * p 0,05; ** P 0.01.
Cycloartane induserer cellesyklus og apoptose i HT-29 celler
For å evaluere måte celledød forårsaket av cycloartane, HT-29 kolon kreftceller ble behandlet med forbindelsen i 24 timer. Deretter utførte vi flowcytometri analyse av celler som var dobbelt-farget med annexin-V og propidiumjodid (PI). Kontrollcellene ble behandlet med bærer (0,1% volum /volum DMSO
4), og hadde 99,4% celleviabilitet, med 0,6% av celler i apoptose. Behandling med forbindelsen ved økende konsentrasjoner, fra 12,5 uM til 50 uM, som skyldes redusert cellelevedyktighet fra 68,6% til 30,6%, og en samtidig økning i andelen av apoptotiske celler fra 30,7% til 59,6% og andelen av nekrotiske celler fra 0,7% til 9,8% (figur 3A)
(A) Prosentandel celler som viser fosfatidylserin translokasjon, som målt ved celleoverflate annexin V-binding og fri PI:.-celler som var negative for annexin V og positive for PI er nekrotisk (Q1 ); celler positive for både annexin V og PI er i slutten av apoptose (Q2); celler negative for både annexin V og PI (Q3) er levedyktige celler; og celler positive for annexin V og negative for PI er i begynnelsen av apoptose (Q4). Celler ble inkubert i 24 timer med 0,1% volum /volum DMSO
4 (bærerkontroll) eller cycloartane i konsentrasjoner på 12,5, 25 eller 50 uM, som angitt. (B) Strømningscytometri histogrammer som viser fordelingen av celler i forskjellige faser av cellesyklusen (G
1, S og G
2 /M) ved begynnelsen av forsøket (0 timer) og ved 12, 24 og 48 timer etter behandling med 2,5 uM av cycloartane. Resultatet er representant for en av tre gjentak som hadde vesentlig lignende resultater.
Deretter undersøkte vi cellesyklusen profil av cycloartane behandlet HT-29 celler. Som vist i figur 3B, den strømningscytometri-analyse viste en tidsavhengig økning av celler i G
en fase, med 45,6%, 56,8%, 64,3% og 76,2% av cellene er i G
en fase etter 0- , 12, 24 og 48 timer etter behandling, henholdsvis.
Cycloartane induserer aktivering av caspases 3/7, 8 og 9
kaspaser spille en sentral rolle i apoptose-induksjon, og som vist i fig 4A, HT-29 celler behandlet med forbindelse viste en kraftig økning i aktivitetene til caspases 3/7, 8 og 9 fra 6 til 12 timer. Deres aktiviteter nådde 18 timer for caspase 9 og 24 timer for caspase 3/7 og 8, som ble etterfulgt av en nedadgående trend. Forbehandling med enten kaspase 8 (Z-IED-FMK) eller et pan-kaspaseinhibitor (Z-VAD-FMK) etterfulgt av cycloartane resulterte i høyere celleviabilitet enn i celler uten forbehandling. Imidlertid inhibitorer for kaspase 3 (Z-DEVD-FMK) og 9 (Z-LEHD-FMK) ikke redde cellene fra cycloartane-indusert apoptose (figur 4B).
(A) Tidsforløp ( 0-30 timer) dobling i caspase 3/7, 8 og 9 aktiviteter HT-29 celler etter behandling med cycloartane (50 mm). (B) Effekter av kaspaseinhibitorer på behandlede HT-29 celler. Endringer i kaspase 3/7, 8 og 9 aktiviteter, og celle-levedyktigheten av celler forhåndsbehandlet med caspase 3 inhibitor (Z-DEVD-FMK), caspase 8 inhibitor (Z-IETD-FMK), caspase 9 inhibitor (Z-LEHD -FMK) eller generell kaspaseinhibitor (Z-VAD-FMK), etterfulgt av inkubasjon med cycloartane (50 uM). Ved 18 timers behandling, ble kaspase-aktivitet bestemt, og ved 24 timer etter behandling cellelevedyktighet ble målt. Alle resultater er tre uavhengige bestemmelser med fold øker og prosent celle viabilities beregnet basert på ubehandlet kontroll. Symboler indikerer betydelig høyere sammenlignet med 0 time eller ingen inhibitor forbehandling: * p 0,05; ** P 0.01.
Effekter av cycloartane på apoptose signaliserer proteiner
Deretter samles vi proteinlysatene på 6, 12, 18 og 24 timer etter behandling med cycloartane og lastet dem inn på RayBio Menneskelig Apoptose Array å oppdage nivåene av 43 apoptose-induserende proteiner. Den største økningen i proteinuttrykk ble sett for caspase 8, som økte fra 2 til 4 ganger på 12- og 18-timers tidspunkter. Caspase 3 og bud bare økt etter 18 timer på forbindelsen behandling (figur 5A og 5B).
(A) oppregulert proteiner påvist i menneskelig apoptose antistoff array. (B) Brett endringer av apoptose signalmolekyler i forhold til å styre med en avskåret grense på 1,5 ganger. (C) Western blot-analyse av apoptotisk aliserte proteiner i cycloartane behandlede HT-29 celler og TNF-α-behandlet som positiv kontroll for NFkB translokasjon i løpet av forskjellige tidsintervaller (6, 12, 18 og 24 timer).
helcellelysater av celler behandlet med den cycloartane ble oppsamlet ved forskjellige tidspunkter og underkastet Western blotting-analyse. I samsvar med resultatet av proteingruppe (figur 5A og 5B), ble tidsavhengige økninger i bud og spaltet kaspase 3 og 8 proteiner (figur 5C) observert. Også, TNF-R1, FADD, og Tradd protein uttrykk var oppregulert, noe som indikerer at forbindelsen induserte det ekstrinsiske apoptose signalveien gjennom TNF-R1-reseptor (figur 5C); sTNF-R1 ble også vist å være oppregulert ved resultater protein array (Fig 5A og 5B). De mitokondrie-relaterte pro-apoptotiske proteiner Bax og dårlige også økt betydelig fra 6 til 24 timer. I tillegg ble ingen translokasjon av NFkB fra cytoplasma til kjernen observert over tid, og nivået av spaltet PARP økt over tid. Celler behandlet med 10 ng /ml TNF-α fungert som en positiv kontroll for NFkB trans eksperimenter (Fig 5C).
Cycloartane reduserer mitokondriemembranen potensial (MMP), øker cytokrom c utslipp og NFkB trans hendelser
for å undersøke hvorvidt forbindelsen forårsaker mitokondrieskade og cytokrom c utgivelsen, behandlet vi HT-29 celler med forbindelsen i 24 timer og deretter utført et høyt innhold celle screening analyse. Som vist i figur 6A, den cycloartane ved 6,25 pM og 12,5 pM redusert (p 0,01) MMP. I tillegg observerte vi cytokrom c slipper inn i cytosol av HT-29 celler behandlet med 6,25 uM av forbindelsen sammenlignet med den ubehandlede kontroll (figur 6B). I å undersøke hvorvidt forbindelsen konkurrere med den naturlige ligand, TNF-α, ble den nedstrøms NFkB translokasjon inn i kjernen målt. I figur 6C, behandling av TNF-α (10 ng /ml) resulterte i NFkB økning fluorescensintensitet (p 0,01) i kjernen regionen. Imidlertid førte behandling med cycloartane (12,5 pM) ikke signifikant (p 0,05) øker NFkB fluorescens intensitet sammenlignet med kontrollen. Kombinasjonsbehandling av cycloartane (12,5 pM) og TNF-α (10 ng /ml) resulterte i en signifikant (p 0,05). Reduksjon i NFkB fluorescens intensitet sammenlignet med TNF-α behandling alene
(A) bilder og stolpediagram av mitokondriemembranen potensial (MMP) nedgang. (B) Cytokrom c lokalisering (røde piler) i kontrollceller eller løslatelse fra cycloartane behandlet HT29 tykktarmskreftceller. (C) NFkB fluorescens intensitet i kjernen region er lik mellom kontroll- og cycloartane-behandlede celler, redusere intensiteten i kombinasjonsbehandling av cycloartane og TNF-α eller øke intensiteten i TNF-α alene. Bilder ble tatt til fange ved 100X forstørrelse og vesentlige forskjeller er angitt: * p 0,05; ** P . 0,01
Study of cycloartane docking til TNF-R1
Computational molekylær docking illustrert bindingen av forbindelsen som TNF-R1 (Fig 7) og avslørte en total bindingsenergi – 67,032 kcal. Bindingen området for cycloartane på TNF-R1 er forskjellig fra det aktive sete for det naturlige ligand, TNFa. Forbindelsen binder til det ekstracellulære området i nærheten av cellemembranen. Det ble ikke observert hydrofob interaksjon mellom en av cykloheksan og cyklopentan grupper av forbindelsen og cystein-96, og hydrogenbindinger dannet mellom hydroksyl i C-26 og karbonylgrupper ved C-3 av forbindelsen med lysin-75 og -132 av -reseptoren, respektive.
forstørrelse som viser hydrogenbindinger (grønn stiplede linjer) mellom hydroksylgrupper og karbonylgrupper av forbindelsen med lysin-75 og -132 og hydrofobe interaksjoner (lilla stiplede linjer) mellom cykloheksan og cyklopentan av forbindelsen med cystein-96 av reseptoren.
Diskusjoner
Vår forrige cytotoksiske screening av et panel av kreftcellelinjer viste at cycloartane er mest cytotoksisk mot tykktarmskreft cellelinje HT- 29 [8]. I denne studien ble det observert lignende cytotoksiske effekter i en annen human koloncancer cellelinje, CaCO-2. Resultatene av MTS-analyser viser at behandling med forbindelsen forårsaker en dose- og tidsavhengig reduksjon i celleviabilitet i både HT-29 og CaCO-2-celler. Som IC
50 av forbindelsen var lavest for HT-29 cellelinjen, ble ytterligere forsøk utført i denne cellelinje.
Fosfatidylserin eksternalisering på celleoverflaten er et av kjennetegnene på apoptose [15 ]. Flowcytometri studier viste en konsentrasjonsavhengig økning i annexin-V-FITC cellepopulasjoner sammenlignet med PI-cellepopulasjoner, som indikerer at denne forbindelse induserer apoptose i stedet for nekrose. I tillegg ble akkumuleringen av celler i G
en scene over tid detektert ved strømningscytometri etter cycloartane behandling. Normal cellevekst og differensiering krever riktig regulering av cellesyklusen. Deregulert cellesykluskontroll på grunn av mutasjon, delesjon og transcriptional undertrykkelse av gener, for eksempel FBXW7, pRB, og p53, har vist seg å bidra til tykktarmskreft progresjon [18-20]. Dermed hemmer cellesyklusprogresjon kunne stoppe ukontrollert spredning av tykktarm kreft celler og føre dem inn apoptose
En annen kjennetegnet av apoptose er aktiveringen av caspases, og det er to etablerte stier basert på initiator kaspaser. Den dødsreseptor veien, noe som medfører caspase-8, og mitokondrielle veien, noe som medfører caspase-9 [16]. Oppstart av enten eller begge caspases aktiverer bøddelen caspase (caspase 3/7), som til slutt fører til godt regulert celle død. Inkubasjon med forbindelsen forårsaker en tidsavhengig aktivering av kaspase 3/7 fra 6
th time og utover. Økningen i caspase-8-aktivering var samtidig med økningen av caspase-9 aktivering, noe som tyder på involvering av både død-reseptoren og mitokondrielle baner i induksjon av apoptose ved cycloartane. Det er imidlertid uklart hvilken caspase er den primære initiator basert på utviklingen av kaspase-aktivering. For å finne ut dette, utførte vi en caspase inhibitor eksperiment. Caspase 8 inhibitor (Z-IETD-FMK) var i stand til å undertrykke caspase 9 og 3/7 aktiviteter som fører til en økning av levedyktige celler. Derfor caspase 8 er den primære initiator, mens caspase 9 er et sekundært mediator som forsterker den apoptotiske signal.
Ytterligere undersøkelser av den apoptotiske reaksjonsvei ved protein rekke analyse demonstrerte frigjøring av oppløselig tumor nekrose faktor-reseptor 1 ( sTNF-R1) fra hele celleekstrakter. Aktivering av TNF-R1 er antatt å forårsake at metallprotease TACE å frigjøre ekstracellulære komponent av reseptoren som oppløselige TNF-R1 (sTNF-R1) [14], leder oss til å anta at den TNF-R1 ble utløst i den oppstrøms arrangementet . Western blot-analyse av cellulær membranekstrakt av de behandlede celler bekreftet oppregulering av TNF-R1. TNF-R1 representerer død reseptor-familien, og den cytoplasmiske hale av TNF-R1 inneholder en død domene (DD), som er avgjørende for induksjon av apoptose [21, 22]. Undersøkelser viste at TNF-R1 aktiverer den apoptotiske program ved sekvensiell rekruttering av adapter protein Tradd, den Tradd-veksel adapter protein FADD og den FADD-lignende ICE protein (FLICE, også kalt pro-kaspase-8) for å danne dødsinduserende signale kompleks (DISC) [23, 24]. Aktivering av TNF-R1-reseptor av legemidlene er blitt vist å forsterke renseeffektiviteten i begge medikamentresistente cellelinjer og primære carcinoma celler [25].
TNF-R1 aktivering induserer ytterligere Bud, som aktiverer Bad og Bax , forårsaker mitokondriemembranen potensiale til å redusere, cytokrom c for å bli frigjort og caspase 9 som skal aktiveres. Rollen til Bud og Bad i transducing apoptotiske signaler fra dødsreseptorer til den iboende mitokondriene vei innebærer forsterkning av apoptotiske signaler [26]. Bad og Bax tilhører BCL-2 familiemedlemmer som regulerer celledød og overlevelse. For eksempel har oppregulering av Bax blitt vist å indusere apoptose ved å redusere mitokondriell permeabilitet for å frigjøre cytokrom c [27]. Konsekvensen av cytokrom c frigivelse og caspase 9 aktivering er aktivering av kaspaser nedstrøms 3 og 7, som fører til spalting av PARP og fører til apoptotisk død uten at translokasjon av NFkB i kjernen. Ytterligere fluorescens-merking av NFkB viste at forbindelsen ikke signifikant (p 0,05) øker NFkB translokasjon inn i kjernen i forhold til kontrollen.
