Abstract
I denne studien brukte vi krakk profilering for å identifisere tarmbakterier og metabolitter som er forskjellig representert hos mennesker med tykktarmskreft (CRC) sammenlignet med friske kontroller for å identifisere hvordan mikrobiell funksjoner kan påvirke CRC utvikling. Avføringsprøver ble samlet fra friske voksne (n = 10) og pasienter med kolorektal kreft (n = 11) før kolon reseksjon kirurgi ved University of Colorado Health-Poudre Valley Hospital i Fort Collins, CO. V4 regionen 16S rRNA-genet ble pyrosequenced og begge kortkjedede fettsyrer og globale avføring metabolitter ble hentet ut og analysert ved hjelp av gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS). Det var ingen signifikante forskjeller i den generelle mikrobiell samfunnsstruktur i forbindelse med sykdomstilstanden, men flere bakteriell genera, spesielt smørsyre-produserende arter, ble underrepresentert i CRC prøvene, mens en mucin nedbrytende arter,
Akkermansia muciniphila
, var omtrent fire ganger høyere hos CRC (p 0,01). Forholdsmessig høyere mengder smørsyre ble sett i avføring hos friske individer, mens relative konsentrasjoner av acetat var høyere i avføring av CRC pasienter. GC-MS viste profilering høyere konsentrasjoner av aminosyrer i avføringsprøver fra CRC-pasienter og høyere poly- og monoumettede fettsyrer og ursodeoxycholsyre, en konjugert gallesyre i avføringsprøver fra friske voksne (p 0,01). Samsvarende analyse mellom de samlede datasett avdekket noen potensielle relasjoner mellom avføring metabolitter og visse bakteriearter. Disse foreningene kan gi innsikt i mikrobielle funksjoner som forekommer i en kreft miljø og vil hjelpe direkte fremtidige mekanistiske studier. Ved hjelp av integrerte «omics» tilnærminger kan vise et nyttig verktøy for å identifisere funksjonelle grupper av tarmbakterier og tilhørende metabolitter som nye terapeutiske og chemopreventive mål
Citation. Weir TL, Manter DK, Sheflin AM, Barnett BA, Heuberger AL, Ryan EP (2013) Krakk mikrobiomer og metabolomet Forskjeller mellom pasienter med kolorektal kreft og friske voksne. PLoS ONE åtte (8): e70803. doi: 10,1371 /journal.pone.0070803
Redaktør: Bryan A. Hvit, University of Illinois, USA
mottatt: 6 april 2013; Godkjent: 24 juni 2013; Publisert: 6. august 2013
Copyright: © 2013 Weir et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH NCI R03CA150070, Colorado Landbruk Experiment Station (CAES), og Shipley Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en sunn mage-systemet er avhengig av en balansert commensal biota å regulere prosesser som kosttilskudd energi høsting [1], metabolisme av mikrobiell og verts avledet kjemikalier [2], og immunmodulering [3]. Akkumulerende bevis tyder på at nærværet av mikrobielle patogener, eller en ubalanse i den opprinnelige bakterie fellesskap bidrar til utvikling av visse gastrointestinale cancere. En årsakssammenheng mellom magekreft og
Helicobacter pylori
er etablert [4], som fører til hypotesen om at andre vertsassosierte organismer er involvert i kreft etiologi.
En sammenheng mellom tykktarmskreft ( CRC) og kommensale bakterier har vært mistenkt i flere tiår. For eksempel
Streptococcus infantarius plakater (tidligere
S. Bovis
) ble diagnostisk viktig etter at det ble kjent at bakteriemi på grunn av denne organismen er ofte forbundet med colorectal neoplastisk sykdom [5], [6] . Imidlertid ble tidlige studier assosiere genera av bakterier med tykktarmskreftrisiko begrenset til kulturbaserte metoder som ikke reflekterer kompleksiteten av mage-tarmfloraen [7] – [9]. Utvikling av high-throughput sekvensering har tilrettelagt detaljerte undersøkelser av tarmen microbiota, og en mer grundig og komplekse tykktarmskreft (CRC) -associated mikrobiomer dukker opp. Sobhani et al. [10] fant at Bacteroides /
Prevotella
gruppe ble overrepresentert i både avføring og slimhinner prøver fra personer med tykktarmskreft sammenlignet med sine kreftfrie kolleger. De fant også at
Bifidobacterium Longum
,
Clostridium clostridioforme
, og
Ruminococcus bromii
var underrepresentert i prøver fra disse personene, og konkluderte med at det ikke er samsvar mellom tumorstadium /størrelse med over-representert populasjoner foreslo en medvirkende rolle bakterier i tumorutvikling. Ytterligere to studier, publisert samtidig, undersøkte bakterieflora til stede i svulsten slimhinnen og tilstøtende friskt vev fra personer med tykktarmskreft og begge studiene viste en overrepresentasjon av
Fusobacterium spp product: [11], [12], mens andre har avdekket en overflod av
Coriobacteria Hotell og andre probiotiske arter [13], [14].
spørsmålet er om overrepresentasjon av bestemte mikrobielle arter i avføring og slimhinneprøver indikerer en medvirkende rolle i utviklingen av CRC eller en konsekvens av svulsten miljø. Selv om en kausal rolle intestinal biota i CRC utviklingen ikke er påvist, er det bevis som tyder på at induksjon av pro-inflammatoriske responser ved commensals bidra til startfasen og utvikling [10], [14]. Produksjon av genotoxins og DNA-skade superoxide radikaler er også mekanismer som commensals kan bidra til CRC utvikling [15]. Alternativt har det vært en teori om at visse probiotiske bakterier fungere som kreftnitter, drar nytte av en økologisk nisje skapt av de fysiologiske og metabolske endringer i svulsten mikromiljøet [14].
For å klargjøre hvilken rolle intestinal biota i utvikling av CRC, vil det være nødvendig å gå utover taksonomisk overrepresentasjon og undersøke forandringer i CRC tilhørende mikrobiomer i en mer funksjonell sammenheng. En viktig funksjonell parameter er slik kommensal organismer bidrar til fluksen av metabolitter og nedbrytning av ernæringskomponenter. Dermed metabonomics, studiet av globale endringer i metabolitter som svar på biologiske stimuli [16], blir brukt til å identifisere og karakterisere den funksjonelle mikrobiomer som driver metabolske endringer knyttet til ulike dietter, genotyper og sykdomstilstander [17] – [19 ]. Krakk metabolittprofiler er validert som et middel til å vurdere gut mikrobiell aktivitet [20] og den aktuelle studien bidrar til den voksende listen over gut mikrober i CRC mikrobiomer, men benytter også en metabonomics tilnærming for å identifisere potensielle mikrobiomer-metabolomet interaksjoner.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle individer gitt skriftlig informert samtykke før du deltar i studien. Alle studieprotokoller ble godkjent av Colorado State University (protokoll tall 10-1670H og 9-1520H) og Poudre Valley Hospital-universitetet i Colorado Health Systems Institutional Review Boards (protokoll tall 10-1038 og 10-1006).
Prøvetaking og DNA-ekstraksjon
Avføringsprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble samlet fra friske individer (n = 11) og nylig diagnostisert tykktarmskreftpasienter (n = 10) før operasjon for tykktarms reseksjon (tabell 1-note: ikke alle prøvene ble utsatt for alle analyser. Se tabell 1 fotnote). Eksklusjonskriterier for alle deltakere inkludert bruk av antibiotika innen to måneder av studiet deltakelse, og regelmessig bruk av NSAIDs, statiner, eller probiotika. Personer som rapporterte kroniske tarmlidelser eller matallergier /kosttilskudd restriksjoner ble også ekskludert fra studien. Tilleggs utelukkelse for CRC pasienter inkludert kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Avføringsprøver ble gitt for analyser før administrering av eventuelle pre-operative antibiotika eller tarm forberedelse. Prøvene ble transportert til laboratoriet innen 24 timer etter innsamling av deltagerne. Avføringsprøver ble homogenisert, og tre delprøver ble samlet inn med sterile bomullspinner. DNA ble ekstrahert fra alle prøver ved hjelp Mobio Powersoil DNA-ekstraksjon kits (Mobio, Carlsbad, CA) i henhold til produsentens instruksjoner og lagret ved -20 ° C før forsterkning trinn.
pyrosekvensering analyse
Amplifikasjon av V4-regionen i det bakterielle 16S rRNA-genet ble utført i triplikat ved anvendelse av primere 515F 806R og merket med 12-bp feilkorrigerende Golay strek [21]. Tyve ul reaksjoner inneholdende 5 Prime Hot Master Mix (5 Prime, Inc., Gaithersburg, MD) ble amplifisert ved 94 ° C i 5 minutter etterfulgt av 35 sykluser ved 94 ° C i 1 minutt, 63 ° C i 1 min, og 72 ° C i 1 minutt, etterfulgt av en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 minutter. Replikere PCR-reaksjoner fra hver prøve ble slått sammen og gel renset ved anvendelse av GenElute Gel Extraction Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), etterfulgt av ytterligere rensing med AMpure perler (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) og kvantifisert med nevnte PicoGreen DNA-analysen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) før biblioteket pooling. Pyrosekvensering ble utført under kontrakt ved University of South Carolina Engencore Sekvense Facility ved hjelp av en 454 biovitenskap GS FLX System med standard kjemi.
Alle sekvens lese redigering og behandling ble utført med Mothur Ver. 1.25 [22] med standardinnstillingene med mindre annet er angitt. I korthet, leser sekvensen var (i) trimmet (bdiff = 0, pdiff = 0, qaverage = 25, minlength = 100, maxambig = 0, maxhomop = 10); (Ii) justert til bakteriell-undergruppe SILVA justering tilgjengelig på Mothur nettsted (https://www.mothur.org); (Iii) filtrert for å fjerne vertikale gap; (Iv) screenet for potensiell kimærer ved hjelp av uchime metoden; (V) klassifisert med Grønne Gener database (https://www.mothur.org) og den naive Baysian klassifikator [23] innebygd i Mothur. Alle sekvenser identifisert som kloroplast ble fjernet; (Vi) sekvenser ble screenet (optimalisere = minlength-end, kriterier = 95) og filtrert (vertikal = T, trumf =.) Slik at alle sekvenser dekket samme genetiske plass; og (vii) alle sekvensene ble pre-gruppert (diff = 2) for å fjerne potensielle pyrosekvensering støy og gruppert (calc = onegap, coutends = F, method = nærmeste) inn Otus [24]. For å fjerne effekten av utvalgsstørrelsen på beregninger samfunnet komposisjon, leser under prøver av 1250 ble tilfeldig valgt fra hver avføringsprøve. Etter clustering sekvens leser inn Otus (dvs. nærmeste-naboer på 3% genetisk avstand) eller phylotypes (dvs. sekvenser som sams en felles slekt i Grønne Genes Database), de replikere underprøver ble i gjennomsnitt for å gi et enkelt samfunn profil for hver prøve. Utvalgsstørrelse uavhengige verdier for alpha mangfold samfunnet deskriptorer som er observert artsrikdom (
S
obs
), Chao1 estimater av total artsrikdom (
S
Chao
), Shannon mangfold (
H «) og jevnhet (
E
H
), og Simpson mangfold (1-D) og jevnhet (E
D) ble bestemt ved å tilpasse en 3- parameter eksponensiell kurve [
y
=
y0
+
a product: (1-e
-bx
)] for å forfinede parametere over et område fra 100-1250 sekvens leser, hvor den asymptotiske maksima er lik summen av
y0 Hotell og
en
. Effektiv antall arter ble beregnet som S
H = exp (H «) for Shannon-indeksen og S
D = 1 /D for Simpson. All sekvens data er offentlig tilgjengelig gjennom Sequence Les Archive (SRA) under studien sjonsnummer ERP002217, som er tilgjengelig på følgende link: https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/ERP002217.
Nontargeted metabolittprofilering og data Processing Metoder
Ett hundre milligram lyofilisert avføringsprøve ble ekstrahert to ganger med 1 ml 03:02:02 isopropanol: acetonitril: vann spunnet på 14 000 rpm i 5 minutter og supernatantene ble kombinert. Ekstraktet ble tørket ved hjelp av en speedvac, resuspendert i 50 ul pyridin inneholdende 15 mg /ml av methoxyamine hydroklorid, inkubert ved 60 ° C i 45 minutter, ultralydbehandlet i 10 min, og inkubert i ytterligere 45 minutter ved 60 ° C. Deretter ble 50 ul av N-metyl-N-trimetylsilyltrifluoracetamid med 1% trimetylklorsilan (MSTFA + 1% TMCS, Thermo Scientific) tilsatt, og prøvene ble inkubert ved 60 ° C i 30 minutter, sentrifugert ved 3000 x g i 5 min, avkjølt til romtemperatur, og 80 ul av supernatanten ble overført til en 150 mL glass inn i en GC-MS autosampler hetteglass. Metabolitter ble oppdaget ved hjelp av en Trace GC Ultra koblet til en Thermo DSQ II (Thermo Scientific). Prøvene ble injisert i en 01:10 split ratio to ganger i diskrete randomiserte blokker. Separasjon forekom ved anvendelse av en 30 m TG-5MS kolonne (Thermo Scientific, 0,25 mm id, 0,25 mikrometer filmtykkelse) med en 1,2 ml /min helium gass-strømningshastighet, og programmet besto av 80 ° C i 30 sek, en rampe 15 ° C pr minutt til 330 ° C, og en 8 min hold. Massene mellom 50-650
m /z
ble skannet på 5 skanninger /sek etter elektron innvirkning ionisering. For hver prøve ble en matrise av molekylære egenskaper som definert ved retensjonstid og masse (
m /z
) ble generert ved hjelp av Xcms programvare [25]. Funksjoner ble normalisert til total ionestrøm, og den relative mengden av hver molekyl egenskap ble bestemt ved den midlere område av den kromatografiske toppen blant replikate injeksjoner (n = 2). Molekylære funksjoner ble dannet i rush grupper bruker Amdis programvare [26], og spektra ble vist i National Institute for Technology Standards (www.nist.gov) og Golm (https://gmd.mpimp-golm.mpg.de/) metabolitten databaser for identifikasjoner.
SCFA bestemmelse.
Avføringsprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble ekstrahert for kortkjedede fettsyrer ved å blande 1 g frosne avføring med surgjort vann (pH 2,5) og ultralydbehandlet i 10 min. Prøvene ble sentrifugert og filtrert gjennom 0,45 um nylonfiltere og lagret ved -80 ° C før analyse. Prøvene ble analysert ved hjelp av et spor GC Ultra koplet til en Thermo DSQ II scanning fra
m /z
50-300 med en hastighet på 5 skanninger /sekund i elektronstøt-modus. Prøvene ble injisert ved en 10:01 deleforhold, og innløps ble holdt ved 22 ° C og overføringsledning ble holdt ved 230 ° C. Separasjon ble oppnådd på en 30 m TG-VOKS-A-kolonne (Thermo Scientific, 0,25 mm ID, 0,25 mikrometer filmtykkelse) ved anvendelse av et temperaturprogram med 100 ° C i 1 min, trappet ved 8 ° C per minutt til 180 ° C, holdt ved 180 ° C i ett minutt, trappet til 200 ° C ved 20 ° C /minutt, og holdt ved 200 ° C i 5 minutter. Helium bæreStrømmen ble holdt på 1,2 ml per minutt. Peak områder ble integrert av Thermo Quan programvare ved hjelp av utvalgte ioner for hver av de kortkjedete fettsyrer, og områder ble normalisert til total signal.
Statistical Analysis
Forskjeller i bakterie phylotypes og globale metabolitter mellom prøver fra friske individer og tykktarmskreftpasienter ble bestemt med AMOVA og student t-tester med en betydning cutoff av 0,01. Phylotypes og metabolitter som var signifikant forskjellig mellom gruppene ble videreutviklet ved å fjerne merkene som hadde færre enn 25 total leser (bakterier) eller borderbakgrunnssignaler (metabolitter), eller som var til stede i mindre enn 3 individuelle prøver. Kortkjedede fettsyrekonsentrasjoner ble bestemt i to separate kromatografiske kjøringer, slik at en veid middelverdi ble beregnet for hvert kvantifisert forbindelse og statistiske forskjeller mellom avføringsprøver fra friske individer og tykktarmskreftpasienter ble bestemt ved anvendelse av et blandet modell ANOVA med eksperiment som representerer en tilfeldig effekt og sykdomsstatus som en fast effekt (XLSTAT 2011.1, Addinsoft Corp, Paris, Frankrike). Sammenhenger mellom metabolitter og bakterier ble bestemt ved hjelp av Pearsons r med en moderat korrelasjon angitt av en r≥0.50 og en sterk korrelasjon angitt av en r≥0.70.
Resultater og Diskusjon
Alpha og Beta mangfold i Krakk Biota
Typiske samfunnet beskrivelsene av alfa mangfold for molekylær mikrobiell data inkluderer faktisk og forventet Otu rikdom, og indekser av befolkningen mangfold og jevnhet. I systemer hvor patogener er innført (f.eks
Helicobacter pylori)
, er det markert nedgang i estimater av mangfold og jevnhet [27] tyder på at disse indeksene kan være nyttige prediktorer for infeksjon. Vi undersøkte disse parametrene i avføringsprøver fra friske personer og personer med CRC for å se om de kunne brukes som predikator for sykdom state.We observert noen signifikante forskjeller på 3% genetisk avstand i gjennomsnitt mangfold eller jevnhet av avføring mikrobielle samfunn fra sunt individer sammenlignet med de med CRC (tabell S1). Den gjennomsnittlige dekningen hentet fra 1250 leser per prøve var 84% og 86% hos friske og tykktarmskreft prøver henholdsvis. Gjennomsnittlig effektiv mangfoldet i hver gruppe foreslo en trend mot høyere bakteriell mangfold i avføringsprøver av friske individer (S
H = 63
, S
D = 20) sammenlignet med de fra CRC pasienter (S
H = 46
, S
D = 15); imidlertid variasjon mellom individene var for stor til å oppnå statistisk signifikans. Basert på disse dataene, foreslår vi at alpha mangfold beskrivelsene av avføringsbakterieflora er ikke tegn på sykdomstilstand i CRC; selv om en begrensning av denne studien er at bare avføringsprøver og ikke vev slimhinnen ble analysert. Men til tross for iboende forskjeller i avføringen og slimhinne mikrobielle samfunn våre funn er i samsvar med andre publiserte rapporter om total bakteriell mangfold og jevnhet estimater mellom CRC og sunn avføring og vev /mucosasamples [10].
Denne interindividuell variasjon var også tydelig i estimater av beta mangfold, hvor en lav grad av likhet i samlet mikrobielle samfunn sammensetning mellom individer ble observert som bestemmes ved hjelp av uvektet Jaccard avstand (J
klasse) å sammenligne samfunnet medlemskap (figur 1A) og Yue og Clayton [28] indeks (Θ
YC) å sammenligne samfunnsstrukturer (Figur 1b). På grunn av denne variasjonen ble ingen mønstre i den generelle samfunnet sammensetning bemerket mellom avføringsprøver fra CRC pasienter og friske personer.
Taksonomiske Forskjeller mellom CRC og sunne avføringsprøver
sykdomsstatus av deltagerne drev ikke generelle samfunnsstruktur av avføring bakterieflora, og sammensetningen og relative overflod av de store phyla var like, selv om det var en ikke-signifikant trend mot høyere verrucomicrobia spinosum i prøver fra tykktarm kreftpasienter (figur 2). Det var også høyere nivåer av Synergetes i kreft-gruppen, men dette ble drevet av en enkelt individ med en ekstremt høy andel av dette phyla og var ikke representativ for hele sekvenskreftpopulasjonen. Men på slekten /artsnivå var det en rekke Otu-tallet som var betydelig underrepresentert i avføringen av tykktarmskreftpasienter sammenlignet med friske individer (Tabell 2). Disse inkluderer flere Gram-negative
Bacteroides Hotell og
Prevotella spp
. som har tidligere blitt isolert fra human avføring, men er ikke godt karakterisert med hensyn til deres rolle i tarmfunksjon eller generell helse. To av
Prevotella
arter identifisert var ikke bare underrepresentert, men var helt fraværende fra tykktarm kreft analyserte prøvene.
Prevotella
var en dominerende slektene rapportert i avføring fra barn i et bygdesamfunn i Burkina Faso, men fraværende fra en kohort av italienske barn, og forfatterne av studien hypotese at
Prevotella
hjulpet maksimere energi høste fra et plantebasert kosthold [29]. Derfor er det mulig at høyere nivåer av
Prevotella
i sunn kohort kan gjenspeile forskjeller i inntak av fiber og andre plante forbindelser sammenlignet med personer med tykktarmskreft. På slekten nivå, Shen et al [30] fant
Bacteroides spp.
Å bli beriket i tarmvevet fra friske personer sammenlignet med adenom vev. Lachnospiracae og medlemmer av slektene
Dorea Hotell og
Ruminococcus
ble også foregå rapportert som dominerende phylotypes kjører forskjeller mellom friske og kreft vevsprøver [13]. Den andre Otus at vi identifisert som
Dialister spp.
Og
Megamonas spp
. har ikke tidligere blitt rapportert i forbindelse med tykktarmskreft; imidlertid redusert bestandene av
Dialister invisus
er rapportert ved Crohns sykdom [31].
H prøve tall indikerer prøver fra friske voksne, mens C betegnelsen betyr prøver fra tykktarm kreftpasienter.
det var færre identifiserbare bakterier som var overrepresentert i tykktarmskreft befolkningen (tabell 3). Mest spesielt, observerte vi at mucin nedbrytende bakterier,
Akkermansia muciniphila
, som representerte en relativt stor andel av de totale sekvenser, var til stede i en betydelig større andel i avføringen til tykktarmskreftpasienter. Denne bakterien er en vanlig medlem av tarmfloraen og ble nylig vist å bli redusert i irritabel tarm-syndrom og Crohns sykdom [32]; imidlertid en mer fersk rapport viste økt
A. muciniphila
ved ulcerøs kolitt-assosiert pouchitt [33]. To typer av slimstoffer, MUC1and MUC5AC er reportedely overexpressed i tykktarm kreft [34], noe som tyder på at vår observerte CRC-relaterte økninger i
A. muciniphila
populasjoner kan skyldes økt underlaget tilgjengelighet.
Citrobacter farmeri
, som kan utnytte citrate som eneste karbonkilde var også høyere i prøver fra tykktarm kreftpasienter, men representerte en mye mindre andel av de totale bakterie sekvenser.
Citrobacter farmeri
er blant en gruppe tarmbakterier som inkluderer flere patogene arter som
Salmonella Hotell og
Shigella, etter og som har arylamin
N
-acetyltransferase aktivitet som kan være involvert i aktivering av kreftfremkallende og xenobiotisk metabolisme [35].
Alder og BMI representere andre faktorer som spiller en rolle i utformingen av tarmbakteriesamfunn. Flere rapporter har vist en sammenheng mellom forholdet bacteroidetes til firmicutes og fedme [1]. Vi har utført lineære regresjoner mellom den relative overflod av hver av taxa som vesentlig forskjellig mellom CRC og sunne avføring (se tabell 2 og 3) og BMI og så ingen signifikante korrelasjoner (tabell S2). I tillegg har aldring blitt assosiert med en reduksjon i beskyttende commensal anaerobe bakterier, for eksempel
Feacalibacterium prausnitzii, etter og en økning i
E. coli product: [
36
]. Vi fant en negativ sammenheng mellom alder av deltakerne og
Dorea formicagens product: (R
2 = 0,354; p = 0,041) og
Ruminococcus obeum product: (R
2 = 0,434 ; p = 0,020), begge medlemmer av Clostridium XlVa gruppen, noe som tyder på at forskjeller mellom kohorter med hensyn til disse to artene kan være et resultat av forskjeller i gjennomsnittsalderen for deltakere i hver gruppe i stedet for CRC sykdomsstatus. Så vidt vi vet, en nedgang i bestanden av Clostridium Xiva gruppemedlemmer har ikke tidligere blitt knyttet til aldring, men har vært forbundet med dysbiosis knyttet til intestinal inflammatoriske tilstander som Crohns sykdom [37]. Ingen av de andre bakterielle arter identifisert var korrelert med alder (tabell S3). Derfor kan vi konkludere med at flertallet av taxa som vesentlig forskjellig i avføringsprøver mellom sunne og CRC kohorter var et resultat av sykdomsstatus og ikke av forskjeller i alder eller BMI.
Short Chain Fatty Acid Analysis
korte fettsyrer (SCFA), spesielt butyrat, er utbredt studert mikrobielle metabolitter rapportert å ha anti-tumorigen effekter [38]. SCFA er lett absorberes og utnyttes i vertsvev så deteksjon i avføringen er vanligvis betraktet som en indikasjon på produksjon i overskudd av det som kan utnyttes av verts [29]. Vi og andre [10], [13] har observert at arter av butyratproduserende produserende bakterier, for eksempel
Ruminococcus spp
. og
Pseudobutyrivibrio ruminis
, var lavere i avføringsprøver fra CRC pasienter sammenliknet med friske kontroller. Derfor kvantifisert vi flere kort kjetting fettsyrer fra frosne avføringsprøver. De tre store SCFAs fremstilt som mikrobielle metabolitter, acetat, propionat og butyrat, ble alle detektert som var valerinsyre, isosmørsyre, isovaleriansyre, kapronsyre, heptansyre og syrer. Blant disse, eddiksyre og valeriansyrer var signifikant høyere i avføringsprøver fra CRC pasienter (p 0,0001 og p = 0,024 henholdsvis), mens smørsyre var betydelig høyere i avføringen til friske individer (p 0,0001, figur 3). ble påvist noen forskjeller i propionsyre mellom de to gruppene. Butyrat regnes som en av de viktigste næringsstoffer for normale colonocytes, og alene eller i kombinasjon med propionat det har vist seg å redusere proliferasjon og indusere apotosis i humane kolon karsinom [39]. Selv acetat er en viktig SCFA for å opprettholde helse og colonic som en forløper molekyl for endogene kolesterol produksjon, har forhøyede nivåer av denne metabolitten tidligere vært forbundet med CRC hos mennesker [40]. Acetat kan anvendes for å fremstille butyrat og proporsjonale forskjeller i disse metabolittene mellom CRC og friske prøver kan gjenspeile en utarming av colonic mikrober som kan utføre denne reaksjonen i CRC-prøver eller det kan være et resultat av degradering av butyrat til acetat ved lav colonic pH- assosiert med CRC. Vi har også observert signifikant høyere relative konsentrasjoner av isosmørsyre (p 0,0001) og isovaleriansyre (p = 0,002) i prøver fra personer med CRC (figur 3). Disse to SCFA resultat fra bakteriell metabolisme av forgrenede aminosyrer valin og leucin, som også var høyere i CRC avføringsprøver (tabell 4), og kan forklare de betydelige økninger observert i disse to SCFAs i CRC befolkningen.
Eddiksyre, valeriansyre, isosmørsyre, og isovaleriansyre konsentrasjonene var forholdsmessig høyere mens anti-proliferative SCFA, smørsyre var betydelig lavere.
Globale Krakk Metabolitter
avførings~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP muliggjøre evaluering av bakterier som befinner seg i den intestinale lumen, og derfor er avførings små molekyler anses å være resultatet av co-metabolisme eller stoffskifte utveksling mellom mikrober og vertsceller [13]. Globalt metabolittprofilering utført her på frysetørkede avføringsprøver gitt innsikt i forholdet mellom mikrobielle populasjoner og metabolitter, og låne til identifisering av nye CRC metabolske biomarkører. Den overvåkte multivariat analyse teknikk, ortogonal projeksjon til Latent Structures-diskriminant analyse (OPLS-DA), noe som letter tolkningen ved separat å modellere prediktive og ortogonale (ikke-prediktiv) variabler, ble anvendt for å bestemme om ikke-målrettede GC-MS-profiler ble prediktiv av sykdomstilstanden av donor. Den OPLS-DA viste tilfredsstillende modellering og prediktive evner for dette datasettet (R2Y = 0,986; QY2 = 0,927), avslører en tydelig skille mellom krakk metabolske funksjonene i de to gruppene (figur 4), noe som tyder på at tilstedeværelse eller fravær av CRC er en viktig faktor bak variasjonen i avføring metabolitter.
Sammenlignet med friske kontroller, krakk metabolomet analysen avdekket 11 aminosyrer som viste en 41-80% økning i avføringsprøver av personer med CRC (tabell 4). Grunner som kan forklare denne CRC-assosiert økning i aminosyre konsentrasjoner kan omfatte, men ikke være begrenset til forskjeller i proteinforbruksmønster, betennelse-indusert reduksjon i næringsopptak, og økt autofagi forbundet med tumorceller resulterer i akkumulering av fri aminosyre bassenger [41]. Mikrobiell nedbrytning av Kostholdsproteinene i den distale colon er en putreficative prosess som resulterer i produksjon av toksiske aminer, og kan forklare den økte frie aminosyrer vi observert i CRC avføringsprøver. En øket konsentrasjon av alle aminosyrer bortsett fra glutamin ble tidligere rapportert i mage og tykktarm tumorvev sammenlignet med friskt vev [42]. Forfatterne hypotese om at kreftceller kan få økte glutaminaseaktivitet resulterer i glutamin konvertering til glutamat. I samsvar med disse funnene, så vi også en stor økning, ca 76%, i glutamat uten en tilsvarende økning i glutamin i avføringsprøver fra tykktarmskreftpasienter. En annen fersk studie ved hjelp av NMR til å identifisere og oppdage metabolitter fra avføring vannekstrakter fra friske og CRC prøvene viste at CRC prøver hadde omtrent 1,5 ganger høyere nivåer av cystein, prolin, og leucin [43]. De økte konsentrasjoner av prolin, serin, treonin og som ble observert i CRC-prøvene kan også være et resultat av degradering av tarmslimstoffer, som hovedsakelig består av glykoproteiner som er rike på disse aminosyrene [44]. Dette er konsistent med anrikning av
Akkermansia muciniphila
, et mucin-nedbrytende bakterier, observert i CRC avføringsprøver; Selv om vi så ingen sterke korrelasjon mellom den relative andel av disse bakterier og bestemte amino- syrekonsentrasjoner.
Det var høyere nivåer av glycerol samt flere umettede fettsyrer som detekteres i avføringsprøver fra friske individer. Humane kreftcellene har et kjent transportsystem for opptak av glycerol, noe som tyder krakk glycerol kan være lavere i CRC fordi det blir tatt opp av tumor-cellene. Alternativt kan bakterielle lipaser som er tilstede i friske individer lette forbrenningen av kosten og endogent produsert triacylglyceroler, noe som resulterer i sluttdegraderingsprodukter av glycerol og frie fettsyrer. I tillegg til glyserol, fettsyrer mest nært samsvarende metabolomic signaturer for linolsyre, og stereoisomerer av oljesyre var også høyere i kontrollene (tabell 4). Endelig ursodeoksykolsyre (UDCA), en sekundær gallesyre produseres av tarmbakterier var ca 63% høyere hos friske individer i forhold til barnekonvensjonen. Mens flere gallesyrer så som lithicolic syre og deoksykolsyre har vært forbundet med tumorgenese, har UDCA vist kjemopreventive effekter i prekliniske og dyremodeller av CRC [45].
korrelasjonsanalyse av mikrobiomer og metabolomet data viste sterke assosiasjoner mellom enkelte medlemmer av avføring bakterieflora og kandidat metabolitter.
