Abstract
Svulsten-avledet monoklonalt IgM antistoff PAT-SM6 spesifikt dreper ondartede celler ved en apoptotisk mekanisme knyttet til overdreven opptak av plasmalipider. Mekanismen er antatt å forekomme med en flerpunktsfeste av PAT-SM6 til den ufoldede protein respons regulator GRP78, som ligger på overflaten av tumorceller, koblet til den samtidige binding av plasma low density lipoprotein (LDL). Vi har fremstilt og karakterisert LDL og LDL oksidert ved hjelp av sedimentering hastighet og liten vinkel-røntgenstråle-spredning (SAXS) analyse. Enzyme-linked immunosorbent (ELISA) teknikker indikert tilsynelatende dissosiasjon konstanter på ca 20 nM for binding av LDL eller oksidert LDL til Pat-SM6. ELISA-forsøk viste kryss konkurranse med LDL inhibering PAT-SM6 binding til immobilisert GRP78, mens, i den motsatte forsøket, GRP78 hemmet PAT-SM6 binding til immobilisert LDL. I motsetning til resultatene fra ELISA-eksperimenter, sedimentehastighets forsøk indikerte forholdsvis svake interaksjoner mellom LDL og PAT-SM6, noe som tyder immunoabsorbance til mikrotiterplaten drives av en aviditet binde- mekanisme. Betydningen av grådighet og flerpunkts feste av antigener til PAT-SM6 ble videre undersøkt ved bruk av antigen-belagte polystyren perler. Absorpsjon av GRP78 eller LDL til polystyren-mikrokuler førte til en økning i inhiberingen av PAT-SM6 å binde til mikrotiterplater belagt med GRP78 eller LDL, respektivt. Disse resultatene støtter hypotesen om at den biologiske virkning av PAT-SM6 i tumorcelle apoptose avhengig av det flerverdige natur av PAT-SM6 og evnen til å kommunisere samtidig med LDL og flere grp78 molekyler gruppert på tumorcelleoverflaten.
Citation: Rosenes Z, Mok YF, Yang S, Griffin MDW, Mulhern TD, Hatters DM, et al. (2013) Samtidig Binding av Anti-Cancer IgM monoklonalt antistoff PAT-SM6 til lav tetthet lipoproteiner og GRP78. PLoS ONE 8 (4): e61239. doi: 10,1371 /journal.pone.0061239
redaktør: Gunnar F. Kaufmann, The Scripps Research Institute og Sorrento Therapeutics, Inc., USA
mottatt: 03.01.2013; Godkjent: 06.03.2013; Publisert: 19 april 2013
Copyright: © 2013 Rosenes et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av en ARC sammenhengen stipend (LP100100392) og ved Patrys Ltd, et selskap gjennomfører for tiden kliniske studier av PAT-SM6 som en potensiell anti-kreft behandling. FH er administrerende direktør i Patrys, GmbH. PAT-SM6 antistoff eies Patrys Limited og selskapet går med på å gjøre for å gjøre fritt tilgjengelig materiale og informasjon som er beskrevet i deres publikasjon som kan være rimelig spurt i den hensikt faglige, ikke-kommersiell forskning. På grunn av den proprietære natur antistoff partene må inngå en overtakelsesavtale. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dette arbeidet støttes av en ARC sammenhengen stipend (LP100100392) og ved Patrys Ltd, et selskap gjennomfører for tiden kliniske studier av PAT-SM6 som en potensiell anti-kreft behandling. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. FH er administrerende direktør i Patrys, GmbH. PAT-SM6 antistoff eies Patrys Limited og selskapet går med på å gjøre for å gjøre fritt tilgjengelig materiale og informasjon som er beskrevet i deres publikasjon som kan være rimelig spurt i den hensikt faglige, ikke-kommersiell forskning. På grunn av den proprietære natur antistoff partene må inngå en overtakelsesavtale.
Innledning
Den menneskelige IgM monoklonalt antistoff, PAT-SM6, avledet fra humant tumorvev [1] , er et potensielt anti-cancermiddel istand til å indusere tumorcelle apoptose i prekliniske modeller av human kreft [2]. Mens den nøyaktige mekanisme av PAT-SM6 indusert celledød ikke er kjent, er prosessen ledsages av intracellulær lipidakkumulering som fører til den hypotese at PAT-SM6 letter opptaket av plasmalipider. I samsvar med dette forslaget er observasjonen at både lav tetthet lipoproteiner (LDL) og oksidert LDL samhandle med PAT-SM6 og forbedre PAT-SM6-indusert apoptose [2]. PAT-SM6 binder seg også til den ufoldede protein respons regulator GRP78, som er over-uttrykt utvendig på celleoverflaten av tumorceller [3]. GRP78, også kjent som BiP (immunoglobulin tungkjedebindende protein), er et medlem av varmesjokkprotein 70 (HSP70) familie som hindrer stress-fremkalt apoptose. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), ved bruk av forskjellige konsentrasjoner av belegg GRP78, har tidligere etablert en høy aviditet interaksjon mellom PAT-SM6 og GRP78 mediert av multi-punkts feste av PAT-SM6 til GRP78 gruppert på overflaten av mikrotiter skuffen [4]. I denne studien undersøkte vi aviditet av interaksjoner av PAT-SM6 med LDL og oksidert LDL og konkurransedyktig natur binding av LDL og GRP78 til PAT-SM6. Rollen multivalency i interaksjoner av PAT-SM6 med mål antigener ble undersøkt ved hjelp av antigen-belagte polystyren perler. Resultatene viser viktigheten av antigen clustering i å generere høye avidities som preger PAT-SM6 antigeninteraksjoner. Evnen til PAT-SM6 å binde både GRP78 og LDL er i samsvar med forslaget om at PAT-SM6 dreper-celler ved å levere overskudd av lipid i form av LDL inn i tumorer ved å binde samtidig til GRP78 til stede på overflaten av tumorceller [2].
eksperimentelle prosedyrer
Material
humant monoklonalt antistoff PAT-SM6 ble uttrykt og renset fra stabile suspensjonskulturer av en human cellelinje i serumfritt medium [5], [6]. Isotypekontrollantistoff IgM ble hentet fra Jackson Immunoresearch Labs, inc, West Grove, PA. PAT-SM6 ble merket med fluorescein ved hjelp av fluoresceinisotiocyanat (Sigma-Aldrich) i henhold til produsentens instruksjoner. Eldre menneske GRP78 inneholder en C-terminal 6 × His-tag ble uttrykt og renset fra
E. coli
som beskrevet tidligere [4].
Etikk erklæringen
Ferske humane blodprøver ble hentet fra St Vincent Hospital, Melbourne ved hjelp av protokoller godkjent av St Vincent Hospital Urne Menneskelig forskningsetiske komité . Skriftlig informert samtykke fra deltakerne ble oppnådd for den opprinnelige menneskelige arbeidet som produseres blodprøvene for isolering av LDL. LDL ble isolert ved fraksjonering tetthet preparativ ultrasentrifugering ved bruk av KBr [7]. Oksidert LDL ble fremstilt ved tilsetning av 20 uM CuSO
4-200 ug /ml LDL og inkubasjon ved romtemperatur i 16 timer [8]. Oksidasjon ble overvåket ved å måle absorbansen ved 234 nm og ved thioflavin T (ThT) fluorescens. ThT ble tilsatt til LDL til en sluttkonsentrasjon på 8 um og fluorescensen målt ved anvendelse av en
f
max
platereader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) utstyrt med 444/485 nm eksitasjon /emisjonsfiltre. Oksidasjon ble stoppet ved tilsetning av EDTA til en sluttkonsentrasjon på 1 mM. LDL og oksidert LDL ble dialysert i fosfatbufret saltvann (PBS; 20 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,4) inneholdende 1 mM EDTA og 0,1% NaN
3 og lagret ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen av LDL ble bestemt fra absorbansen ved 280 nm korrigert for lysspredningen [9] og ved å bruke en ekstinksjonskoeffisient på 844 cm
2 /g beregnet fra aminosyresammensetningen av apolipoprotein B. den molare konsentrasjon av LDL ble beregnet ved å anta en verdi på 2,2 × 10
6 for den gjennomsnittlige molekylvekten av menneskelig LDL [10].
Small-Angle X-ray spredning (SAXS)
Synchrotron SAXS med inline størrelseseksklusjonskromatografi (SEC-SAXS) av LDL og oksidert LDL ble utført ved Australian Synchrotron SAXS /waxs beamline. Prøvene ble utsatt for SEC på en kolonne med en porestørrelse på 500 Å (WTC-050N5, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA), som gir en effektiv protein MW separering området 15.000 til 5.000.000 Da. Kolonnen ble ekvilibrert i buffer inneholdende PBS ved en strømningshastighet på 0,4 ml /min. Injeksjoner ble 20 ul med en proteinkonsentrasjon på 3 mg /ml. Bjelken størrelse på prøven var 250 pm horisontale x 150 um vertikal (FWHM). Pilatus 1M detektor bildene ble analysert som gjennomsnitt av ti etterfølgende 2 s eksponeringer og konvertert til individ
I
(
q
) SaXs profiler ved hjelp av Scatterbrain programvare (Australian Synchrotron).
I
(
q
) er spredt X-ray intensitet som funksjon av omfanget av momentum transfer vektor
q
= (4πsinθ) /λ, der spredningsvinkel er 2θ og røntgenstrålebølgelengden er λ (1,12713 Å). Data ble samlet inn ved 298 K ved hjelp av et kamera lengde på 3,3 m, som tillot intensiteter å bli samlet inn over en
q-
spekter av 0,00429 til 0,24575 Å
1. SAXS-profiler ble analysert ved anvendelse av ATSAS (versjon 2.4) pakke med programmer [11].
Sedimente Velocity Analysis
Sedimentation hastighets eksperimenter ved hjelp av absorbans-optikk ble utført ved bruk av et XL-I analytisk ultrasentrifuge (Beckman Coulter, Fullerton, CA) utstyrt med en An-60 Ti rotor ved 20 ° C. Proteinprøver ble lagt til dobbelt sektor EPON fylt centre med PBS i referanserommet. Radial absorbans dataene ble innsamlet ved en rotorhastighet på 28000 opm, ved bruk av en bølgelengde på 280 nm, og med radiale trinn på 0,003 cm i kontinuerlig skannemodus. Sedimentehastighetsforsøk ble også utført under anvendelse av et XL-A analytisk ultrasentrifuge utstyrt med et fluorescens-deteksjonssystem (FDS; Aviv Biomedical) for å overvåke sedimentering av fluorescein-merkede PAT-SM6 og KBPA-101. De sedimenterende grenser ble utstyrt med en modell som forutsatt en fordeling av sedimenterings koeffisienter for ikke-interagerende art, C (S), ved hjelp av programmet SEDFIT [12]. Data ble montert ved hjelp av maksimal entropi regularisering, en P-verdi på 0,95 og en friksjonsforhold på 1,9 [4]. Sedimentering koeffisienter ble korrigert for virkningene av LDL på løsningens tetthet og viskositet, forutsatt at verdiene for 0,967 ml /g og 3,4 ml /g for den partielle spesifikke volum og grenseviskositet av LDL, henholdsvis [10].
Enzyme Linked immunosorbant analyse (ELISA)
antigener ble belagt på 96-brønners mikrotiterplater brett (Nunc Maxisorp) ved inkubering over natten ved 4 ° C. Plater ble deretter vasket 3 ganger i PBS, 3 ganger i PBS + 0,1% Tween 20, 3 ganger i PBS og blokkert med 5% (w /v) BSA i PBS i 1 time ved romtemperatur, deretter vasket igjen som ovenfor. Alle antistoffpreparater ble tatt opp i 5% (w /v) BSA i PBS. For indirekte ELISA forsøk ble antistoffer påføres direkte på plate og inkubert i 1 time. For konkurrerende ELISA, ble antistoffer inkubert i oppløsning sammen med forskjellige mengder av antigen før påføring på mikrotiterplaten. Etter vasking på nytt som ovenfor, ble peroxidise-konjugert kanin-anti-humant IgM-sekundært antistoff (Dako) påført platen og inkubert i en time i henhold til produsentens instruksjoner. Etter en endelig vask, antistoff-binding ble bestemt ved anvendelse av 100 ul per brønn av 3,3 «, 5,5»-tetrametylbenzidin substratløsning (Sigma) og måling av fargeendring ved 655 nm. Tidsforløpet for fargeutvikling ble hovedsakelig lineær over optisk tetthet serien 0-3. Målinger ble tatt 15 minutter etter tilsetning av substrat. I kontrolleksperimenter som involverer direkte belegging av platene med PAT-SM6, over konsentrasjonsområdet 0-2,5 pg /ml, ble det observert en systematisk økning i ELISA-signal med økt belegg-konsentrasjonen, noe som tyder på en direkte korrelasjon mellom ELISA-signalet og den mengden av antistoff bundet til platen. ELISA-data for titrering av primære antistoff-binding til immobilisert LDL ble analysert anta en enkel Langmuir spesifikk binding isotermen beskrevet av forholdet Y = K
a /(1-K
a) hvor Y er størrelsen av ELISA-signalet og K
a er den tilsynelatende bindende konstant, forutsatt at en enkelt klasse av bindingssteder.
Antigen-belegg av polystyren Sfærer
utestengelse av 1 mikrometer diameter polystyren mikrosfærer (Polysciences, Inc) ved en konsentrasjon på 2,5% (vekt /volum) ble vasket ved gjentatt pelletisering (x 3) i en mikrosentrifuge og resuspendering i PBS, PBS-0,1% Tween 20, og deretter en siste gang med PBS. De vaskede mikrokuler ble så pelletert og resuspendert i 2 mg /ml antigen (LDL eller GRP78) eller 5% (vekt /volum) BSA (blokkeringsløsning) til en endelig mikrokulekonsentrasjon på 2,5% (vekt /volum). Rør av mikrokule /antigen blanding ble inkubert over natten på en roterende plattform ved 4 ° C. For å bestemme graden av antigen-binding, ble mikrokulene pelletisert, og absorbansen i supernatanten målt ved 280 nm og sammenlignet med absorbansen av det opprinnelige antigenet løsning. De belagte mikrokuler ble så vasket som ovenfor og deretter blokkert ved hjelp av 5% BSA og lagret ved 4 ° C til den er klar til bruk.
Resultater
Oksidasjon av LDL
Cu
2+ indusert oksidasjon av LDL ble overvåket ved å måle lyset absorbans ved 234 nm (figur 1A). Økningen i absorbans ved 234 nm nærmer seg et maksimum etter 24 timer og kan tilskrives dannelsen av konjugerte diener [13]. LDL-oksidasjon ble også overvåket av en sammenhengende ThT assay [8]. Resultatene viser at ThT fluorescens av LDL inkubert med 20 mM CuSO
4 øker over den samme tidsperioden nådde et platå etter 16 timer uten tilsvarende endringer observert for kontroll inkubasjoner av LDL eller ThT alene. Ytterligere karakterisering av oksidert LDL ble utført ved bruk av sedimentehastighetsanalyse. Sedimente koeffisient fordelinger (figur 1C) viste en enkelt symmetrisk topp for LDL med en sperrende sedimente koeffisient på omkring 4,5 S, mens den oppnådde for oksidert LDL fordeling var bimodal med det sedimenterende hovedtopp med en sperrende sedimente koeffisient på ca. 8 S. denne økningen i sedimenteringshastighet skyldes en endring i partikkeltetthet på grunn av et betydelig tap av lipid etter oksidasjon [8].
(A) endring i absorbans ved 234 nm som en funksjon av inkubasjonstid. (B) Tidsforløp for endringen i fluorescens ThT av LDL (heltrukket linje), LDL ble inkubert med 20 mM CuSO
4 (stiplet linje) eller PBS alene (prikket linje). (C) Sedimente koeffisient fordeling oppnådd fra sedimentehastighetsanalyse av LDL (stiplet linje) og oksidert LDL (heltrukket linje).
Liten vinkel røntgen Scattering (SAXS) Analyse av LDL og oksidert LDL
SAXS analyse har blitt brukt mye til å karakterisere LDL og Cu
2 + -behandlet oksidert LDL [14], [15], [16]. Denne teknikken gir informasjon om den totale størrelsen og formen på lipoprotein partikler fra parametere som treghetsradier (
R
g) og den maksimale dimensjon (
D
maks), samt informasjon om den interne strukturen av partiklene fra paret avstand fordelingsfunksjonen
P product: (
r
). Her ble LDL og oksidert LDL kastet synkrotron størrelse-eksklusjonskromatografi SAXS (SEC-SAXS) [4]. Denne metoden forbedrer kvaliteten på SAXS data ved å levere størrelsen fraksjonert prøven direkte inn i strålen, og dermed skille spredning fra partikkelen av interesse fra det av eventuelle aggregater, men også å tilveiebringe en nær perfekt buffer match for subtraksjon i datareduksjon prosess.
elueringen av LDL og oksidert LDL fra kolonnen ble overvåket ved absorbans ved 280 nm og SAXS intensitet ved null-vinkel (
i
(0)) som en funksjon av volum. De SAXS profiler av de mest aktive artene er vist i figur 2A. For hver art,
R
g ble beregnet ut fra skråningen av sine respektive Guinier tomter (ln [
I
(
q
)] vs.
q
2) (figur 2B). For LDL den Guinier tomten var lineær over et
q
.
R
g spekter av 0,8 til 2,4, noe som gir en
R
g verdi av 134 ± 1 Å.
R
g av peak LDL arten målt her er i god overensstemmelse med den publiserte middelverdien av 139 A fra området 121-160 Å observert for 17 LDL preparater fra 12 givere [16]. For oksidert LDL den Guinier tomten var lineær over et
q
.
R
g spekter av 0,8-1,6 gi en
R
g verdi av 112 ± 3 Å. Tidligere X-ray og nøytron spredning studier av LDL oksidasjon ansatt statiske prøver, som viste tidsavhengig og [Cu
2 +] – avhengige økninger i tilsynelatende
R
g, opptil ~160 Å, på grunn av dannelsen av aggregater [16], [17]. SEC-SAXS avledet
R
g verdi rapporteres her er den første målingen for isolerte oksiderte LDL-partikler i fravær av aggregater. For hver SAXS profilere
P product: (
r
) -funksjonen ble beregnet ved indirekte Fourier transform (figur 2C).
P product: (
r
) analyse indikerte at LDL og oksidert LDL hadde lignende
D
høyeste verdi på ~250 Å, som er konsistent med tidligere målinger [ ,,,0],16].
R
g verdi for LDL fra
P product: (
r
) analysen var 131 ± 2 Å og for oksidert LDL var 109 ± 3 A, som er i god overensstemmelse med verdiene fra Guinier analysene. Cu
2 + formidlet oksidasjon forårsaker karakteristiske endringer i den interne organiseringen av LDL partikkel, med har blitt tilskrevet tap av bestilt kolesterol ester og triacyglycerol struktur [16].
P product: (
r
) analyse er diagnostisk for denne endringen, som
P product: (
r
) kurve av LDL viser en sterk negativ topp på
r
= 135 A, som er helt tapt ved oksidasjon (Figur 2C). Det er blitt foreslått at denne negative topp er på grunn av negativ kontrast av de bestilte hydrokarbonkjedene i det ytre monolag av LDL, som har lavere elektrontetthet enn det omgivende oppløsningsmiddel. Oksidasjon er antatt å resultere i tilsetningen av oksygen til de umettede acylkjeder, noe som gjør dem mer elektron tetthet enn vann, og som resulterer i positiv kontrast [16], [17].
A. De SaXs data er vist som gjennomsnitt intensitet
I
(
q
) ± 1 standardavvik, som en funksjon av momentum transfer
q
for LDL (fylte sirkler) og oksidert LDL (åpne sirkler). (B) Guinier plott av de SaXs data ved lav
q
for LDL (fylte sirkler) og oksidert LDL (åpne sirkler). Den nedre og øvre
q
.
R
g grenser for Guinier analysene er angitt. (C) Pair avstand fordelingsfunksjon
P product: (
r
) som funksjon av radiell avstand
r
for LDL (lukkede sirkler) og oksidert LDL (åpne sirkler).
Enzyme-linked Immunsorbentanalyser Analyser av PAT-SM6 Interaksjon med LDL og oksidert LDL
ELISA ble utført ved hjelp av en rekke PAT-SM6 konsentrasjoner og plater belagt med ulike konsentrasjoner av enten LDL eller oksidert LDL (figur 3). Resultatene viser en systematisk økning av ELISA-signalet som en funksjon av PAT-SM6 konsentrasjon med mer utstrakt binding observert ved høyere antigen-konsentrasjoner belegg. Data ble tilpasset til en enkel Langmuir spesifikk binding isoterm for å oppnå den tilsynelatende bindingskonstant (K
a) som en funksjon av LDL belegg konsentrasjon (figur 3C). Resultatene viser at interaksjonen av PAT-SM6 med LDL eller oksidert LDL er lik og forholdsvis uavhengig av beleggkonsentrasjoner med tilsynelatende K
a-verdier omtrent 50 uM
1, svarende til dissosiasjonskonstantene på 20 nM. Disse verdiene indikerer at samspillet mellom PAT-SM6 og LDL er svakere enn samspillet mellom PAT-SM6 og GRP78, hvor ELISA studier ga tilsynelatende dissosiasjon konstanter på ca. 4 nM [4].
Analysene ble utført ved hjelp av ( A) LDL eller (B) oksidert LDL ved belegg konsentrasjoner på 0 mikrogram /ml (åpne sirkler), 1 ug /ml (lukkede trekanter), 2 ug /ml (åpne diamanter), 3 ug /ml (lukkede firkanter), 4 ug /ml (åpne omvendte trekanter), og 5 mikrogram /ml (lukkede sirkler). (C) Data ble tilpasset til en enkel binding isoterm for å oppnå tilsynelatende bindingskonstant (K
a) for PAT-SM6 binding som en funksjon av belegget konsentrasjonen av LDL (åpne sirkler) eller oksidert LDL (lukkede sirkler). Feilfelt representerer 95% konfidensintervall fra montering av ELISA data til en Langmuir bindingskurve.
samtidig Binding av LDL og GRP78 til PAT-SM6
Evnen PAT-SM6 å samhandle samtidig med GRP78 og LDL ble undersøkt ved hjelp av konkurranse ELISA eksperimenter. Resultatene ble utført ved anvendelse av lave konsentrasjoner av pletterings GRP78 eller LDL for å tillate mer effektiv inhibering av PAT-SM6 binding ved tilsetning av løselig antigen. Resultater ved hjelp av løselig LDL som en konkurrent viste at signifikant hemming av PAT-SM6 binding ble observert for plater belagt med enten GRP78 eller LDL. Motsatt resultater ved hjelp GRP78 som en konkurrent avdekket betydelig hemming av PAT-SM6 binding til immobilisert GRP78 eller LDL, bekrefter evne GRP78 og LDL å konkurrere med hverandre for å binde seg til PAT-SM6. En ytterligere observasjon av figur 4, er at høyere konsentrasjoner av LDL er nødvendig for halvparten av maksimal inhibering, sammenlignet med GRP78, i samsvar med den høyere affinitet for GRP78 for PAT-SM6 åpenbart fra direkte ELISA-forsøk (figur 3 og [4]).
Wells ble belagt med 7,5 mg /ml GRP78 (sirkler), 7,5 mg /ml LDL (trekanter) eller ble forlatt ubestrøket (firkanter). PAT-SM6 (5 mg /ml) ble inkubert med ulike konsentrasjoner av konkurrenten før søknad til mikrotiterplate.
Sedimentasjon Velocity Analyse av PAT-SM6 og LDL
Resultatene på figur 3 viste at den tilsynelatende K
a verdier for interaksjonen av PAT-SM6 med immobilisert LDL eller oksidert LDL var uavhengig av antigenet belegget konsentrasjon. Disse funnene er i motsetning til de resultater som ble oppnådd med GRP78 [4] hvor den sterke avhengighet av PAT-SM6 bindende belegg konsentrasjonen av GRP78 ble tatt som bevis for antigen gruppering som en viktig bestemmende faktor for styrken av PAT-SM6 bindende vekselvirkninger. Resultatene observert for LDL antydet at LDL kan være gruppert på mikrotiterplaten, selv ved lave konsentrasjoner kontaktflate, eller at PAT-SM6 kan binde seg direkte til de enkelte LDL-partikler. For å undersøke sistnevnte mulighet, ble sedimenteringshastigheten eksperimenter utført for å karakterisere interaksjonen mellom løselig LDL og PAT-SM6. Resultatene i figur 5A viser sedimentasjonskoeffesienter distribusjoner for en blanding av LDL og PAT-SM6. To store topper er observert med modale sedimente koeffisienter nær de målte verdiene for LDL alene og PAT-SM6 alene. Analyse av den gjennomsnittlige sedimente koeffisienten for den hurtigere topp, å korrigere for den lille effekt for LDL på løsningens tetthet og viskositet, viste ingen signifikant forskjell sammenlignet med gjennomsnittet sedimente koeffisienten for PAT-SM6 alene. Fraværet av noen påviselig endring i frekvensen av sedimentering av PAT-SM6 i nærvær av LDL indikerer svært lite interaksjon mellom disse artene under disse forholdene, og er i strid med de sterke interaksjoner observert i ELISA-forsøk (figur 3 og 4). Én mulighet betraktet var at bruk av 50 mg /ml BSA som et blokkeringsmiddel i ELISA-eksperimenter kan virke som et makromolekylært samles middel og øker bindingsaffinitet [18]. For å teste denne muligheten sedimentehastighetsforsøk ble utført under anvendelse av fluorescensmerkede PAT-SM6 og fluorescens deteksjonssystemet i den analytiske ultrasentrifuge. Dette tillot frekvensen av sedimentering av merket PAT-SM6 som skal overvåkes i nærvær og fravær av høye konsentrasjoner av BSA. Resultatene i figur 5 viser at LDL har svært liten virkning på graden av sedimentering av fluorescensmerkede PAT-SM6 enten i nærvær eller fravær av 50 mg /ml BSA. De sedimente hastighet resulterer i figur 5 ekskludere en høy affinitet interaksjon mellom løselig LDL og enkelte steder på PAT-SM6 og støtter forslaget om at bindingen av PAT-SM6 til LDL immobilisert på mikrotiterplater drives av en grådighet binde- mekanisme ellers svake interaksjoner (i det minste høy pM området).
(A) sedimentasjonskoeffesienter fordelinger oppnådd ved anvendelse av absorpsjon ved 280 nm optikk for PAT-SM6 (0,3 uM, svart), LDL (1,8 uM, rød) og en blanding av PAT-SM6 og LDL (0,3 uM og 1,8 uM, henholdsvis (grønn). (B) sedimentasjonskoeffesienter fordelinger oppnådd ved anvendelse av fluorescens-optikk for FITC-merket PAT-SM6 (40 nM) i nærvær (heltrukket linje) og fravær (brutt linje) av LDL (1,8 uM). (C) sedimentasjonskoeffesienter fordelinger oppnådd i nærvær av BSA (50 mg /ml) ved anvendelse av fluorescens-optikk for FITC-merket PAT-SM6 (40 nM) i nærvær (heltrukket linje) og fravær (stiplet) av LDL (1,8 mm).
de Samhandling av PAT-SM6 med Antigen-belagt polystyren mikrosfærer
bevisene PAT-SM6 samhandler med multi-punkts feste til gruppert antigener foreslått at opptaket av GRP78 eller LDL til polystyren-mikrokuler kan øke evnen til disse antigenene for å inhibere PAT-SM6 bindende vekselvirkninger. Antigen-belagte polystyren-mikrokuler ble fremstilt ved inkubering av polystyren-mikroperler med antigener og overvåkning av graden av binding ved anvendelse av en sentrifuge pelletering assay. Resultatene i figur 6 viser at GRP78 og LDL binder seg raskt til de polystyrenkuler. Resultatene viser også at graden av binding av grp78 øker som en funksjon av GRP78 konsentrasjon og som BSA binder seg til perlene i en mettbar måte (figur 6).
(A) Mengde proteinbundet per gram mikrokuler som en funksjon av GRP78 (lukkede sirkler) eller BSA-konsentrasjon (åpne sirkler). (B) tidsforløpet av GRP78 (fylte sirkler) og LDL (åpne trekanter) binding til polystyren mikrosfærer.
ELISA eksperimenter for å teste om GRP78 eller LDL belagt mikro hemme bindingen av PAT-SM6 til antigen belagte mikrotiterplater ble utført ved anvendelse av høye konsentrasjoner av belegget antigen for å maksimere graden av samling på plate. Resultatene i Figur 7 viser at GRP78 belagt sfærer hemme PAT-SM6 binding til mikrotiterplater belagt med enten GRP78 stund, over samme konsentrasjonsområde og forhold, løselig GRP78 eller BSA-belagte kontrollsfærer ikke hemme. Disse resultatene indikerer sterk binding av PAT-SM6 til grp78 kuler via multivalent vedlegg som sequesters PAT-SM6 og hindrer binding av PAT-SM6 å GRP78 belagte mikrotiterplater. Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av LDL-belagte mikrotiterplater, men i dette tilfellet både grp78-belagte kuler og oppløselig GRP78 hemmet PAT-SM6 binding til platene. Dette resultatet er i overensstemmelse med den høyere tilsynelatende aviditet av PAT-SM6 for GRP78 forhold til LDL. Resultatene i figur 8 viser at LDL-belagte mikrokuler hemme PAT-SM6 å binde til mikrotiterplater belagt med LDL, mens under samme konsentrasjonsområde og tilstander løselig LDL eller BSA-belagte kontroll-mikrokuler ikke inhiberer. Resultatene i Figur 8 viser også LDL-belagt sfærer ikke hemme bindingen av PAT-SM6 å GRP78 belagte plater, i samsvar med en høyere aviditet av PAT-SM6 for gruppert GRP78 forhold til gruppert LDL.
PAT -SM6 (5 mg /ml) ble inkubert med grp78-belagt sfærer (sirkler), løselig grp78 (trekanter) eller BSA belagte sfærer (firkanter) før tillegg til mikrotiterplater.
mønstre SM6 (5 mg /ml) ble inkubert med LDL-belagt sfærer (sirkler), løselig LDL (trekanter) eller BSA belagte mikrosfærer (firkanter) før tillegg til mikrotiterplater.
Diskusjoner
Natural IgM-antistoffer er en del av det medfødte immunrespons hvor de er involvert i godkjenning av utenlandsk partikler, inkludert oksidert og kjemisk modifisert proteiner og transformerte celler [19]. Denne klassen av antistoffet typisk vis lav antigenspesifisitet sammen med evnen til å binde mer enn én type av antigen [20]. Denne evnen til å binde mer enn en type antigen som er tydelig i tilfellet av PAT-SM6 hvor ELISA-dataene indikerer sterk vekselvirkning med den strukturelt ikke-relaterte cellemembran-assosiert GRP78 i tumorceller [3], og med både native og det oksyderte plasma lipoproteiner med lav densitet [2]. Tidligere studier viser at interaksjonen av PAT-SM6 med GRP78 medieres gjennom en aviditet basert mekanisme basert på den multivalency av antistoffet. Resultatene presentert i den foreliggende studie antyder en lignende aviditet basert mekanisme opererer for binding av PAT-SM6 med LDL. Flere observasjoner støtter denne konklusjonen. Samspillet mellom PAT-SM6 med LDL analysert ved sedimente hastighet viste ingen signifikant endring i frekvensen av sedimentering av PAT-SM6 i nærvær av LDL. I kontrast, ble det observert sterke interaksjoner mellom immobilisert GRP78 og PAT-SM6 i ELISA-eksperimenter. Disse studiene tyder på relativt svake interaksjoner (i mikromolare konsentrasjonsområde) når PAT-SM6 og LDL er gratis i løsning, men mye sterkere samhandling med LDL gruppert på mikrotiterplate. Støtte for rollen gruppering er også gitt ved resultatene fra eksperimentene som anvender antigen-belagte polystyren-mikrosfærer, som viste forbedret inhibering av bindingen av PAT-SM6 til antigen-belagte mikrotiterplater, sammenlignet med tilsvarende konsentrasjoner av løselige former av antigenet. En markert forskjell PAT-SM6 interaksjoner med LDL forhold til samhandling med GRP78 er at den tilsynelatende grådighet for PAT-SM6 interaksjoner med LDL ikke avsløre en avhengighet av belegget konsentrasjonen av LDL. I tilfelle av GRP78 den tilsynelatende aviditet for PAT-SM6 øker med belegg konsentrasjon, i samsvar med et antigen clustering effekt [4]. En mulig forklaring på denne forskjell er den store størrelsen av LDL og sterkere binding til mikrotiterplaten fører til gruppering, selv ved lave konsentrasjoner belegg.
Analyse av bindingen av PAT-SM6 til LDL og oksidert LDL indikert lik åpen avidities (K
d ca 20 nM) og total svakere binding sammenlignet med interaksjonen med GRP78. Tidligere studier av interaksjonen mellom PAT-SM6 med LDL og oksidert LDL, utføres ved hjelp av et enkelt antigen belegg og PAT-SM6 konsentrasjonen ga en lavere ELISA signal (65%) for binding til LDL sammenlignet med oksidert LDL [2] i motsetning til resultatene presentert i Figur 3, der bindingskurvene for PAT-SM6 til LDL og oksidert LDL var svært like. Mulige forklaringer på dette avviket er variasjoner i de metoder som brukes for å forberede oksidert LDL.
