Abstract
Bakgrunn
Toll-lignende reseptorer (TLR) er viktige faktorer i det medfødte immunsystemet og initiere den inflammatoriske respons på utenlandske patogener som bakterier, sopp og virus. I mikromiljøet av tumorgenese, kan TLR’ene fremme inflammasjon og celle-overlevelse. Toll-like receptor 2/6 (TLR2 /6) signalering i tumorceller regnes som en av mekanismene for kronisk inflammasjon, men det kan også mediere tumorcelleimmun flukt og tumorprogresjon. Imidlertid har uttrykket av TLR2 og dens biologiske funksjon i utvikling og progresjon av hepatokarsinom ikke undersøkt. Denne studien forsøkte å bestemme uttrykket av TLRs 1-10 i den etablerte menneskelige leverkreft cellelinje BLE-7402, for å undersøke den biologiske effekten av TLR2 på cellevekst og overlevelse.
Metoder
TLR uttrykk i bLE-7402 celler ble analysert ved RT-PCR, real-time PCR og flowcytometri (FCM). For ytterligere å undersøke funksjonen av TLR2 i hepatokarsinom vekst, ble BLE-7402-celler transfektert med rekombinante plasmider som uttrykker en av tre former for TLR2 siRNA (sh-TLR2 RNAi (A, B og C)). TLR2 knockdown ble bekreftet ved hjelp av RT-PCR, real-time PCR og fluorescens mikroskopi. Tumorcelle-proliferasjon ble målt ved MTT-analyse og utskilt cytokiner i supernatanten av transfekterte celler ble målt ved hjelp av kulebasert FCM, ble funksjonen av TLR2 siRNA også undersøkt in vivo.
Resultatene
BLE-7402-cellelinjen uttrykt TLR’ene 2 til 10 ved både mRNA og proteinnivåer. TLR2 var den mest høyt uttrykt TLR. Mens alle de tre sirnas hemmet TLR2 mRNA og protein uttrykk, sh-TLR2 RNAi (B) hadde den sterkeste knockdown effekt. TLR2 knockdown med sh-TLR2 RNAi (B) redusert celleproliferasjon. Videre, sekresjon av IL-6 og IL-8 ble også redusert. Resultatet viste en drastisk reduksjon i tumorvolum hos mus behandlet med sh-TLR2 RNAi (B).
diskusjon
Disse resultater antyder at TLR2 knockdown hemmer proliferasjon av dyrkede celler hepatokarsinom og redusere sekresjonen av cytokiner. Det foreslås at TLR2 lyddemping kan verdt ytterligere undersøkelser for siRNA basert genterapi i behandling av hepatokarsinom
Citation:. Huang Y, Cai B, Xu M, Qiu Z, Tao Y, Zhang Y, et al. (2012) Gene stanse av Toll-like receptor 2 hemmer proliferasjonen av humane leverkreft celler og sekresjon av inflammatoriske cytokiner. PLoS ONE syv (7): e38890. doi: 10,1371 /journal.pone.0038890
Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan
mottatt: 04.01.2012; Godkjent: 14 mai 2012; Publisert: 16.07.2012
Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Jiangsu Provincial Natural Science Foundation (BK2011175). YZH støttes av Jiangsu Provincial Natural Science Foundation (BK2011164), Health Research Program i Jiangsu-provinsen (X200736, X201110). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hepatocellulært karsinom eller leverkreft er ansett for å være en primær cancer som stammer fra leverceller; Det er en av de mest ødeleggende kreft form, spesielt i Kina. Foreløpig mangler av effektiv behandling ledelsen søker ny behandlingsstrategi, slik som genterapi. Kort interfererende RNA, siRNA kan tilbys som en ny terapi en gang et godt mål er funnet. Det er nylig foreslått TLRs er uttrykt i mange humane tumorer [1],
Toll-lignende reseptorer (TLR) er et høyt konservert familie av type I transmembrane reseptorer som gjenkjenner spesifikke patogen-forbundet molekylære mønstre (PAMPs), f.eks lipopolysakkarid, lipotechoic syre og andre bakterielle veggskikt [1], [2], og det kan også mediere tumorcelleimmun flukt og tumorprogresjon. Humane TLR’ene har et cytoplasmatisk domene som er homologt med det cytoplasmatiske domene av den humane interleukin (IL) -1 reseptor [3]. Hittil har 11 pattedyr TLRs blitt identifisert og karakterisert.
Nylig har ny forskning vist at TLRs er uttrykt av mange humane tumorer [2], [3], [4], [5], [6 ], inkludert prostatakreft, lungekreft, brystkreft og leverkreft. Selv om TLR’ene har forskjellige funksjoner på forskjellige tumorceller, har enkelte Resultatene indikerte at TLR signalering kan spille en rolle i tumorvekst og progresjon. For eksempel kan TLR2 signalisering fremme lungekreft cellevekst og resistens mot apoptose [7], [8]; TLR3-avhengig signalisering kan direkte fører til apoptose i humane brystcancer [6]; gjennom sine handlinger på metallproteasene og inte kan TLR2 og TLR9 føre til økt invasivitet og metastase [8], [9]; TLR4 kan megle metastaser som aktivt fremmer tumorcelle invasjon, spredning og overlevelse av prostata kreft celler [10].
Toll-like receptor 2/6 (TLR2 /6) signalering i kreftceller er av spesiell interesse som det regnes som en av mekanismene for kronisk betennelse, men det kan også formidle svulst celle immun flukt og tumorprogresjon. I tillegg TLR2 fungere som en potensiell antiviral mekanisme i hepatitt B-infiserte hepatocytter cellelinjer [11].
TLR’ene uttrykkes på en rekke forskjellige tumorceller, og er mistenkt for å spille en viktig rolle i initiering og progresjon av kreft, har imidlertid uttrykk for TLRs av hepatokarsinom cellene ikke blitt undersøkt på en systematisk måte, og lite er kjent om TLR interaksjon med sykdomsprogresjon. I denne studien ønsket vi å bestemme ekspresjon av TLR’ene 1-10 i den etablerte human leverkreft cellelinje BLE-7402. Vi i tillegg forsøkte å undersøke den biologiske effekten av TLR2 på cellevekst og overlevelse, og å vurdere sitt potensial innen kreftbehandling.
Materialer og metoder
Alle forsøkene holdt med gjeldende lover of China.
cellelinje
den menneskelige leverkreft cellelinje BEL-7402 ble kjøpt fra cellen bank av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). BEL-7402 ble dyrket uten antibiotika i 5% CO
2 ved 37 ° C i RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, California) inneholder 10% FBS.
Bygging av siRNA-uttrykke Plasmider
Tre små interfererende oligonukleotider (A: 5′-aactatccactggtgaaacaa-3 «, B: 5′- aaacttgtcagtggccagaaa-3′, C: 5»- aaagtcttgattgattggcca-3 «) ble utformet basert på sekvensen av human TLR 1 -10 (tabell 1) og syntetisert. RNAi plasmidvektorer (fig S1) som uttrykker sirnas for TLR2 under kontroll av en human CMV-promoter, ble samlet inn ved å sette inn par av de sammenbundne DNA-oligonukleotider som er spesifikke for TLR2 ved Hindlll og BamHI-setene i rekkefølge inn i pGenesil-1 plasmid (shTLR2, tabell 2). En pGenesil-1-egge vektor ble anvendt som en kontroll.
Kvalitative RT-PCR
TRIzol reagens (Invitrogen) ble anvendt for å isolere total RNA i henhold til produsentens instruksjoner. En 4 ug porsjon av total-RNA ble blandet med en oligo-dT primer og myeloblastosis-virus (MLV) revers transkriptase (Promega, Madison, WI). PCR-primere for TLR 1-10, sammen med GAPDH som kontroll, ble utformet som vist i tabell 1. PCR-betingelsene var som følger: 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser av 95 ° C i 1 min, 55 ° C i 1 min, og 72 ° C i 1 min. Den endelige forlengelse var ved 72 ° C i 10 min. PCR-produktene ble analysert på 1,5% (vekt /volum) agarose-geler inneholdende 0. 5 mikrogram /ml ethidium-bromid og ble visualisert under UV-lys. Band tetthet ble analysert og kvantifisert ved hjelp av Imagequant programvare (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Real-time PCR
Reaksjonsblandingen inneholdt 45 pl DEPC-H
2o, 1,0 mL cDNA ved en 1:100 fortynning, 2,0 ul (10 pM) av hver primer og frysetørket pulver i henhold til manfacturer anvisning av AccuPower Greenstar® qPCR forblanding. Fremgangsmåten for PCR var som følger: 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek. Fluorescens ble målt etter hvert forlengelsestrinn på 72 ° C i 30 sek (Eppendorf, Tyskland). Ved slutten av reaksjonen ble smeltekurven for hver analyserte prøve. BIONEER Exicycler ™ analyseprogramvare (Bioneer Corp., Daejeon, Korea) ble brukt for å oppnå C
t-verdier. Relativ uttrykk av målgener ble bestemt av to
-ΔΔ CT-metoden [12].
flowcytometrisystemer Påvisning av TLR Protein Expression
En suspensjon av 2 × 10
6 dyrkede BEL-7402 celler ble utarbeidet og permeabilized å oppdage TLR protein uttrykk. Cellene ble samlet opp og vasket to ganger med 1 x PBS, deretter farget med 5 ul renset anti-human TLR2-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved 4 ° C i 1 time beskyttet mot lys. Etter vasking to ganger med 1 x PBS, ble cellene oppsamlet ved lavhastighetssentrifugering (1500 g, 10 min) og inkubert med 2 mL PE-konjugert geit-anti-kanin-IgG-mAb (Santa Cruz Biotechnology) ved 4 ° C i 30 minutter i mørket, etterfulgt av to vaskinger med 1 x PBS. Til slutt ble de fargede celler suspendert i 500 mL 1 x PBS og analysert ved flowcytometri (FACSCalibur; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ved anvendelse av BD Cellquest-programvare. Den negative kontrollen ble behandlet på samme måte, men uten anti-TLR2 antistoff.
RNA interferens analysen
Celler ble transfektert med GFP-uttrykke plasmid pGsil-en (Genesil, Wuhan, Kina ) inneholdende siRNA rettet mot TLR2, som vist i tabell 2. de transfekterte celler ble sådd ut ved 2 x 10
5-celler /brønn i 6-brønners skåler og dyrket over natten før de nådde 70% konfluens. Transfections ble utført ved hjelp av Lipofectamine ™ 2000 reagens (Invitrogen) etter produsentens anvisninger. Fire ug av plasmid-DNA (sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B), sh-TLR2 RNAi (C), vektor pGenesil-1 og egge siRNA) ble anvendt for transfeksjon inn i cellene henholdsvis (SunShineclean ™ Without- endotoksin Plasmid Mini Extraction Kit, SunShineBio, Kina). Transfekterte celler ble inkubert i 72 timer, deretter fluorescens ble observert ved bruk av et fluorescens mikroskop. På denne tiden celler ble også samlet inn for FCM og immunfluorescens analysen.
Immunofluorescensanalyse
BEL-7402 celler ble transfektert med ulike siRNA plasmider og dyrket over natten, deretter fast med alkohol for 30 min, og blokkert i 1 x PBS (pH 7,4) oppløsning med 3% BSA. Den anti-TLR2-antistoff (sc-166 900, Santa Cruz Biotechnology) ble tilsatt ved en 1:200 fortynning og inkubert over natten ved 4 ° C i en fuktet boks. Etter vasking ble det fluorescerende sekundært antistoff (SC-22766, Santa Cruz Biotechnology) tilsatt ved en 1:100 fortynning og inkubert i 2 timer. Cellene ble deretter vasket tre ganger med 1 x PBS, og mot-farget med DAPI. Konfokalmikroskopi ble utført og fluorescens ble analysert ved hjelp av en fluorescens mikroskop (Leica DMI4000B, Buffalo Grove, IL).
Cell Proliferation Assay
MTT analysen (Sigma, St. Louis, MO) var brukes til å evaluere celleformering etter transfeksjon. Celler ble dyrket i 96-brønners celleplater (1 x 10
4 /brønn, 5 brønner pr tilstand) over natten, og celletransfeksjoner ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 48 timer ble en prøve av de transfekterte cellene oppsamlet som 0 h prøven, mens de andre cellene fortsatte i kultur i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Ved slutten av hver behandlingsperiode ble MTT tilsatt til kulturmediet i hver brønn i en konsentrasjon på 5 mg /ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), og så inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Supernatanten ble deretter fjernet, og cellene ble blandet med 100 pl /brønn dimetylsulfoksyd. Absorpsjonen ble målt ved hjelp av en automatisk mikro spektrofotometer (340st, Anthos Zenyth, Salzburg, Østerrike) på 490 nm
Menneske inflammatoriske cytokin analysen
Supernatant ble samlet inn fra transfekterte celler.. IL-6 og IL-8 nivåer ble oppdaget ved hjelp av menneske inflammatorisk cytokin kit (BD ™ cytometri Bead Array) i henhold til produsentens instruksjoner.
Experiment av Mouse Model in vivo
atymiske male nude mus (Balb /c -nu /nu, 5-7 uker gamle) ble delt i fem behandlingsgrupper med ti mus per behandlingsgruppe. Animal håndtering og eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av dyreforsøk Committee of Nanjing Medical University. En suspensjon av BEL-7402 celler (1 x 10
7) i 500 mL PBS ble injisert i subkutant av abodomen. Denne cellekonsentrasjonen var nødvendig for å oppnå konsistent lokal tumorvekst i løpet av 10 dager etter implantasjon. På dag 10 og 15 etter implantering, ble svulstene injisert henholdsvis med plasmid DNA (sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B), sh-TLR2 RNAi (C), vektor pGenesil-en og egge siRNA) sammen med 150 ug hver gang. Svulsten skala ble bestemt ved visuell inspeksjon og målt ved verniercaliper 15 d etter den andre injeksjonen.
Statistical Analysis
Data vises er fra minst tre separate forsøk og er representert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Elevens
t
-test og ANOVA ble benyttet for å bestemme betydning, og forskjellene ble vurdert signifikant på
P
verdi på mindre enn 0,05.
Resultater
Expression of TLRs i BEL-7402 cellelinje
Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse viste at mRNA for TLRs (TLR 2-10) er uttrykt i BEL-7402 celler (figur 1A), mens TLR1, 7 mRNA uttrykk var knapt synlig. Videre analyser av real-time PCR viste at TLR7 uttrykkes på det laveste nivået. Vi har derfor valgt å henvise alle andre TLR mRNA-nivåer i forhold til nivået av TLR7-mRNA. TLR2 og TLR4 viste de høyeste uttrykk nivåer, noe som kan tyde på at de har noen funksjon i BEL-7402 cellevekst og progresjon (figur 1B).
Semi-kvantitativ RT-PCR resultat av TLRs i BEL-7402. GAPDH mRNA ble anvendt som kontroll (A). Real-time RT-PCR av TLRs i BEL-7402. Ekspresjonen av TLR7 ble normalisert til 1,0 som nivået var lavest blant alle TLR’ene (B). TLR protein ekspresjonsnivåene i BEL-7402 ved flowcytometri (C). Alle resultatene er representative for tre separate eksperimenter.
TLR protein uttrykk nivåer ble bestemt ved flowcytometri (FCM). TLR2 ble uttrykt på høyeste nivå i TLR1-10, de andre TLRs ble alle uttrykt på et moderat nivå uttrykt eller svakt (figur 1C). Til sammen våre resultater viser at BEL-7402 celler i kultur uttrykker TLR2-TLR10, med TLR2 å være den mest uttrykt. Dette resultatet oppmuntret oss til å undersøke funksjonen av TLR2 på vekst og progresjon av BEL-7402 celler.
Effektiv knockdown av TLR2 uttrykk i BEL-7402 cellelinje ved tre sirnas
Å ytterligere undersøke potensialet funksjon TLR2 i hepatokarsinom, brukte vi små hårnål RNA til knockdown endogene TLR2 genuttrykk [Gene ID: 10333]. Plasmidvektorer var konstruert for å uttrykke tre forskjellige sirnas, sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B), sh-TLR2 RNAi (C). Alle tre eksperimentelle siRNA vektorene ble transfektert inn i BEL-7402-celler henholdsvis med egge siRNA vektor og den tomme vektoren som kontroller. Etter 48 timer var den gjennomsnittlige transfeksjonseffektiviteten ble omtrent 70% som beregnet av grønn fluorescens-positive celler under florescence mikroskop. Alle tre eksperimentelle sirnas effektivt redusert TLR2 mRNA uttrykk i transfekterte celler (Figur 2i). TLR2 mRNA-nivåer var 29,85% ± 9,2%, 50,75 ± 6,7% og 31,34 ± 8,3% av den tom vektorkontroll med sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B) og sh-TLR2 RNAi (C) henholdsvis, en statistisk signifikant reduksjon i uttrykket i forhold til de tomme vektorkontrollcellene (
P
0,05) (figur 2ii). Ingen statistisk signifikant reduksjon i uttrykket ble sett i celler transfektert med egge siRNA (
P
0,05). TLR2-protein-ekspresjon ble redusert med alle tre sirnas med nivåer av 33,0% ± 3,0% (sh-TLR2 RNAi (A)), 57,9% ± 4,7% (sh-TLR2 RNAi (B)) og 43,7% ± 4,5% (SH- TLR2 RNAi (C)) av den tomme vektor kontroll (figur 2III). Ingen signifikant forskjell i TLR2 protein uttrykk ble sett i egge siRNA kontroll (
P
0,05). Disse dataene indikerer at sh-TLR2 RNAi (B) er den mest effektive rekombinant plasmid i silencing TLR2. Vi har derfor valgt å bruke bare sh-TLR2 RNAi (B) i videre eksperimentering.
I, RT-PCR av TLR2 fra pGenesil-en vektor, ScrambledsiRNA, sh-TLR2 RNAi (A, B, C) transfektert BEL-7402. II, uttrykk for TLR2 på mRNA nivå i pGenesil-en vektor, ScrambledsiRNA, og sh-TLR2 RNAi (A, B, C) transfektert BEL-7402 med real-time PCR. III, flowcytometri analyse av TLR2 uttrykk, student
t
-test og ANOVA ble benyttet for å bestemme betydning.
TLR2 protein uttrykk i BEL-7402 celler ble videre analysert ved farging med et anti-TLR2-antistoff og visualisert under et fluorescensmikroskop. Positiv farging ble dramatisk redusert ved sh-TLR2 RNAi (B) sammenlignet med tom vektorkontroll (fig. 3IV). Ingen signifikant forskjell i farge nivåer av egge siRNA kontroll i forhold til tom vektor kontroll (Fig. 3IV).
I, MTT analyse av den proliferative rate av pGenesil-en vektor, ScrambledsiRNA og sh-TLR2 RNAi (B) transfekterte celler. II og III, IL-6 og IL-8 tilstedeværelse i supernatanten utskilt av pGenesil-en vektor, egge siRNA og sh-TLR2 RNAi (B) transfekterte celler. Celle supernatant ble samlet og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Alle resultater er representative for tre separate eksperimenter, studentens
t
-test og ANOVA ble brukt til å bestemme betydning. IV, immunofluorescensanalyse av genspesifikke siRNA på TLR2 protein ekspresjon i pGenesil-en vektor (i), egge siRNA (ii) og sh-TLR2 RNAi (B) (iii) transfekterte celler. Nukleær farging utført ved anvendelse av DAPI (blå) (200 x). TLR2 stanse undertrykker tumorvekst i en musemodell. Sammenligning av volumet av tumorer fra hver behandlingsgruppe ble vist. Behandling med BEL-7402 celle (VI_i), sh-TLR2 RNAi (B) konstruktiv DNA ble injisert i tumor gruppe (VI_ii) Vesentlige forskjeller fra kontrollgrupper (V.▪, VI_iii) var representert med stjerner (
P
. 0,05)
Dermed har vi vist bestemt siRNA-rettet knockdown av TLR2 genet i menneskets leverkreft cellelinje BEL-7402, og vist at sh-TLR2 RNAi (B ) var den mest effektive rekombinant plasmid i lyddemping TLR2.
spredning av transfekterte BEL-7402 cellelinje Etter TLR2 Gene slå ned
Vi brukte MTT analyse for å fastslå effekten av sh-TLR2 RNAi (B) -mediert TLR2 stanse på celleproliferasjon. Celler ble dyrket i 0 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer etter 48 timer etter transfeksjon. Prosenten av levedyktige celler ble redusert i nærvær av TLR2 siRNA med ~ 50% i gjennomsnitt sammenlignet med celler uten noen behandling. Den proliferative evne til BEL-7402 celler ble redusert med sh-TLR2 RNAi (B) transfeksjon (Figur 3I). Ingen signifikant forskjell ble observert i cellene transfektert med siRNA kontroll (
P
0,05).
nedregulering av TLR2 av siRNA Blocks sin Nedstrøms Melde i BEL-7402 Cells
De biologiske endringer forårsaket av TLR2 nedregulering kan skyldes endring av TLR2-mediert nedstrøms signalisering som fører til endringer i etterfølgende funksjoner.
TLR2 kan spille en rolle i TLR2 /MyD88 signalering og etterfølgende nedstrøms funksjoner [17], og vi antar at cytokiner sekresjon er et resultat av TLR2 signalering. Derfor har vi utviklet en protokoll for å undersøke nivået av inflammatoriske cytokiner i BEL-7402 celler etter TLR2 genet knockdown. BEL-7402 celler ble transfektert med sh-TLR2 RNAi (B). Etter 72 timer ble supernatanten fjernet, og nivået av IL-6 og IL-8 bestemmes ved cytometrisk kuleanalyse. IL-6 og IL-8-nivåer ble funnet å være markert deprimert. IL-6 ble redusert med 50,2 ± 2,6% og IL-8 med 49,7 ± 3,5% sammenlignet med tom vektorkontroll (
P
0,05); ingen signifikant forskjell ble sett i siRNA-transfektert kontroller (Figur 3II og Figur 3III).
TLR2 Gene av siRNA hemmer tumordannelse i hårløse mus
Etter å ha etablert de betydelige effekter av TLR2 knockdown av RNAi i BEL-7402 celler
in vitro
, lurer vi på om TLR2 RNAi vil også undertrykke tumorigenitet av BEL-7402 svulster i nakne mus. På dag 7 og 14 etter-implantering, ble tumorene injisert med plasmid-DNA som uttrykker TLR2 siRNA. Brutto morfologi av primære tumorer ble undersøkt. Tumorer ble målt og en drastisk reduksjon i tumorvolum ble observert i mus behandlet med sh-TLR2 RNAi (B) (fig 3V-VI ii).
Diskusjon
Toll-lignende reseptorer (TLR’ene ) er et konservert familie av reseptorer som registrerer tilstedeværelse av patogener ved å anerkjenne PAMPs [13], [14]. I tillegg er de også er involvert i regulering av inflammasjon [15], en rolle som er blitt foreslått å være i det minste delvis avhengig av evnen til TLR’ene til å gjenkjenne flere endogene TLR ligander som er kjent som skade-assosierte molekylmønstre (demper). Nylig har mange studier på TLRs og deres potensielle rolle i kreftforskning og terapi blitt rapportert. Yang et al [16] undersøkt den mulige rollen til TLR2 signalisering på tumormetastase i en musemodell av intravenøst injiserte B16 melanomceller. Resultatet viser at TLR2 er et attraktivt mål mot metastase, anti-TLR2-antistoff kan bli brukt til å combate den livstruende metastasis.Thompson et al [11] har vist at hepatom-cellelinjer som uttrykker funksjonelle TLR2-reseptorer, som, når den blir stimulert, setter i gang en signaleringskaskade som inhiberer hepatitt B-viruset. Xu et al [17] har oppdaget perifere mononukleære blodceller fra HBV-infiserte pasienter viste redusert nivå av ekspresjon TLR7 og TLR9 mRNA, men en økning i TLR9 ekspresjon på proteinnivået.
Fra disse studiene, vet vi at TLR2 , TLR7 og TLR9 spiller viktige roller i leversykdommer og TLR2 har et potensial funksjon i reguleringen av tumor toleranse, progresjon av kreft og metastase [13]. Orihara et al [18] har vist at TLR2 og /eller TLR4 på sirkulerende monocytter er signifikant oppregulert i bakterie-infeksjon. TLR2 ekspresjonsnivåene for monocytter har vist seg å tilveiebringe kritisk informasjon ved planlegging av behandling mot bakterielle infeksjonssykdommer [18] og filarial sykdommer [19], eggstokk-kreft [20], leversykdommer [21], og bakterielle infeksjonssykdommer [22], [ ,,,0],23], [24], [25]. Men veksten, spredning og metastasering av leverkreft er kompliserte og dynamiske prosesser. Hver prosess er sannsynlig å være forbundet med handlingene (og samspill) av flere TLR’ene [26]. I lys av dette, bestemte vi oss for å utforske uttrykk for andre TLRs i leverkreft og undersøke om disse kan påvirke vekst, progresjon og overlevelse av leverkreft. Våre forsøk viser at TLR 2-10 er uttrykt i BEL-7402 celler både på mRNA og protein nivå. Vi har vist, ved sanntids-PCR-analyse og flowcytometri, som TLR2 er den mest høyt uttrykt av den TLR’ene.
Det er voksende bevis på at mange forskjellige celletyper i leveren uttrykke TLR2 [27]. slik som Kupffer celler, hepatocytter og galle epitelceller. TLR-medierte signaler føre til hepatitt B, hepatitt C, alkoholisk leversykdom, alkoholfrie leversykdommer, primær biliær cirrhose, primær skleroserende kolangitt, hepatisk fibrose, iskemisk-reperfusjonsskade og lever allotransplantatavvisning [27]. Huang et al. viste at
Listeria monocytogenes
aktiverte mitogenaktiverte proteinkinaser og nukleær faktor-kB i tumorceller via TLR2 signalisering, som resulterer i økt produksjon av nitrogenoksid og interleukin-6 og økt proliferasjon av tumorceller [7]. Kim et al. viste at Lewis lungekarsinom (LLC) var den mektigste makrofag aktivator som fører til produksjon av interleukin-6 og tumor-nekrose faktor-α gjennom aktivering av Toll-like receptor (TLR) familiemedlemmer TLR2 og TLR6 [9] og deres resultater forklarte hvordan avanserte kreftceller endre verts medfødte immunsystemet og dermed generere en inflammatorisk mikromiljø. Huang et al. viste at mikromiljøet av store tumorer favoriserer overlevelse av bakterier, noe som i sin tur direkte akselererer tumorvekst ved å aktivere tumorcelle Toll-like receptor 2 [7].
Proinflammatoriske faktorer som for eksempel nitrogenoksyd, IL-6 og IL- 12 ble vist å bli løst fra kreftceller i tidligere studier [10]. Både IL-6 og IL-12 er kjent for å bidra til tumorceller motstå cytotoksiske T-lymfocytter og naturlige dreperceller, som fører til flukt fra immunovervåkning [10]. I vår studie ble TLR2 valgt å utforske funksjon TLRs i veksten av BEL-7402 celler. Vår undersøkelse bekrefter viktigheten av TLR2-mediert tumor proliferasjon, analyse av inflammatoriske cytokiner demonstrert deprimert produksjon av TLR2-ekspresjon etter TLR2 knockdown, og viste at evnen til BEL-7402-celler for å motstå immunceller angrep og lette å unndra fra immunovervåkning kan bli redusert . Dette tyder på at alle de fenotypiske endringer observert i disse cellene ble formidlet ved å undertrykke virkningen av TLR2.
mus modusen for kreft ble også undersøkt, og volumet av tumoren fra siRNA behandling ble vist. Ved å ha etablert de betydelige effekter av TLR2 knockdown av RNAi i BEL-7402 celler in vitro, lurer vi på om TLR2 RNAi vil også undertrykke tumorigenitet av BEL-7402 svulster i nakne mus. På dag 10 og 15 etter implantering, ble svulstene injisert med å uttrykke plasmid DNA sh-TLR2 RNAi. Brutto morfologi av primære tumorer ble undersøkt. En drastisk reduksjon i tumorvolum ble observert i mus behandlet med sh-TLR2 RNAi (B).
Resultatene som presenteres i denne artikkelen gir bevis for at TLR2 knockdown ikke bare in vitro, men in vivo kunne hemme veksten av leveren svulster. TLR2-mediert kreft vekst ser ut til å være en viktig faktor i tumorprogresjon. Bruk av systemisk levert TLR2 siRNA kan dermed gi en ny behandling for forebygging av kreft progresjon som fører til bedre utsikter til å overleve.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
RNAi plasmidvektorer (pGenesil-en plasmid).
doi: 10,1371 /journal.pone.0038890.s001 plakater (JPG)
Takk
Vi takker Dr. Dongxu Liu (School of Life Sciences, Hubei University, Hubei, PR Kina) for å gi teknisk støtte.
