Abstract
Androgen reseptor (AR) signalveien forblir den fremste målet for nye behandlingsformer for kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Imidlertid varianter ekspresjon av konstitutivt aktive AR mangler den karboksy-terminale region i CRPC kan føre til dårlig effektivitet terapi. Disse AR varianter er ment å understøtte PCa cellevekst i et androgen fattig miljø, men deres virkningsmåte er fremdeles uløst. Videre har nylige studier indikerer at konstitutivt aktive AR-varianter er uttrykt i primær prostatakreft og kan bidra til tumorprogresjon. Målet med denne studien var å undersøke effekten av konstitutivt aktive AR varianter på uttrykk for tumorprogresjon markører. N-cadherin uttrykk ble analysert i LNCaP celler overekspresjon villtype AR eller en konstitutivt aktiv AR variant av QRT-PCR, Western blot og immunfluorescens. Vi viste her for første gang at N-cadherin uttrykk ble økt i nærvær av konstitutivt aktive AR varianter. Disse resultatene ble bekreftet i C4-2B celler som overuttrykker disse AR varianter. Selv om N-cadherin uttrykk er ofte forbundet med en nedregulering av E-cadherin, var dette fenomenet ikke observert i vår modell. Ikke desto mindre, i tillegg til den økte ekspresjon av N-cadherin, en oppregulering av andre mesenchymale markører uttrykk for eksempel
vimentin, SNAIL
og
ZEB1
ble observert i nærvær av konstitutivt aktive varianter. I konklusjonen, våre funn markere nye konsekvensene av konstitutivt aktive AR varianter på regulering av mesenchymale markører i prostatakreft
Citation. COTTARD F, Asmane jeg, Erdmann E, Bergerat JP, Kurtz JE, Céraline J (2013 ) konstitutivt aktiv androgen Receptor Varianter oppregulerer Expression of Mesenchymale Markører i prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (5): e63466. doi: 10,1371 /journal.pone.0063466
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 9. januar 2013, Godkjent: 02.04.2013; Publisert: 02.05.2013
Copyright: © 2013 COTTARD et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Universitetet i Strasbourg; Ligue Contre le Cancer, Alsace Contre le Cancer; og Foreningen pour la Recherche sur les Tumeurs Prostatiques (ARTP). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen hos menn over 50 år og den andre årsaken til mannlig dødelighet av kreft i Europa. Androgener signalering spiller en nøkkelrolle ved PCA celler spredning eller overlevelse [1], og androgen tilbaketrekking er fortsatt den viktigste behandlingen for lokalt residiv og androgen-avhengige metastatisk PCa. Imidlertid er fordelen med denne behandlingen forbigående og alle svulster slutt går igjen som kastrering-resistente PCa (CRPC).
Genetiske og spleise hendelser som påvirker androgen reseptor (AR) genet har vært knyttet til CRPC. Konstitutivt aktive AR-varianter, som mangler den karboksy-terminale region som omfatter den ligand-bindende domene og aktiveringsfunksjonen 2, kan bidra til utviklingen av PCa til kastrering motstand. Disse konstitutivt aktive AR-varianter resulterer fra for tidlig stopp-kodoner som følge av nonsens mutasjoner som rapportert for ARQ640X [2], [3], [4], [5] eller fra alternativ spleising med bibehold av en kryptisk exonic sekvens som beskrevet for AR -V7 [4], [6], [7], [8],.
rollen til konstitutivt aktive AR-varianter i CRPC har blitt vist i mange studier [7], [8], [11 ], [12]. Uttrykket av disse avkuttet AR-varianter er økt med en 20-fold i CRPC sammenlignet med lokaliserte PCa [9], og er korrelert med kapasitet på PCA celler til å vokse
in vitro Hotell og
in vivo
i fravær av androgen [7]. Men de nøyaktige molekylære mekanismene som fører til deres aktivering og deres virkningsmekanisme ved PCA og CRPC fortsatt uklare.
Nyere studier tyder på at konstitutivt aktive AR varianter kan spille en rolle i tumorprogresjon. Faktisk, selv om disse konstitutivt aktive AR varianter er allerede uttrykt i grunnskolen prostatakreft, er deres uttrykk desto mer uttrykt i beinmetastaser [8]. Videre er deres ekspresjon forbundet med en økning av NFAT (Nuclear faktor på aktiverte T-celler) og AP-1 (aktivator protein-1) aktivitet, to transkripsjonsfaktorer som er involvert i celle-proliferasjon, migrering og overlevelse [13].
N-cadherin, som tilhører cadherin super, ligger på adherens veikryss i nervøse, endotelceller eller mesenchymalceller og er involvert i tumorprogresjon [14], [15]. Faktisk er N-cadherin ekspresjon økt i de fleste kreftformer og tumorceller fremmer migrasjon, invasjon og overlevelse [14]. Økt N-cadherin ekspresjon er også forbundet med epitelial-mesenkymale overgang (EMT), et fenomen som kjennetegnes ved en reduksjon av epitel-markører som E-cadherin og en økning av mesenchymale markører så som vimentin eller N-cadherin [16], [17 ], [18], [19]. Disse molekylære og cellulære modifikasjoner spiller en viktig rolle i tumorceller formidling ved sekundærsider [20], 21.
Mer nylig, har studier vist at kastrering-resistente PCa er forbundet med en oppregulering av N-cadherin ekspresjon i cellemodeller samt PCA xenotransplantater og kliniske prøver av CRPC [22], [23], [24]. Dessuten har monoklonale antistoffer mot N-cadherin er vist å forsinke fremveksten av kastrering motstand og for å redusere veksten av xenografter CRPC [23]. Til sammen viser disse data at det er en sammenheng mellom N-cadherin ekspresjon og motstand mot kastrering. Likevel molekylære mekanismer der N-cadherin uttrykk er økt i CRPC fortsatt ukjent.
Formålet med dette arbeidet var å vise en mulig sammenheng mellom tilstedeværelsen av konstitutivt aktive AR varianter og uttrykk for tumorprogresjon markører. Nærmere bestemt har vi fokusert på virkningen av konstitutivt aktive AR varianter på uttrykk for N-cadherin og andre mesenchymale markører. I denne studien har vi vist at
N-cadherin
samt
vimentin
,
SNAIL Hotell og
ZEB1
er oppregulert i nærvær av konstitutivt aktive AR varianter ved PCA.
Materialer og metoder
Cell kultur
den menneskelige prostata carcinom LNCaP cellelinje, klone FGC og 22Rv1 cellelinje (ECACC, Salisbury, Storbritannia) ble opprettholdt i RPMI-1640 komplett medium inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, Frankrike) og 1 mM natriumpyruvat (Invitrogen, Fisher Scientific, Frankrike).
C4-2B cellelinje (ViroMed Laboratories, Minnetonka, MN, USA) ble opprettholdt i DMEM-medium supplert med 20% Hams F12, 10% FCS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 5 ug /ml insulin, 13,65 pg /ml trijod-tyronin, 4,4 ug /ml apo-transferrin human, 0,244 ug /ml D-biotin og 12,5 ug /ml adenin (Sigma- Aldrich, Frankrike).
plasmider og transfeksjon
For immunfluorescens eksperimenter, villtype androgen reseptor (AR) (AR-WT) og konstitutivt aktiv AR Q640X og AR Q670X [25] varianter var knyttet til EGFP som tidligere beskrevet [2], [3]. For genekspresjonsanalyser og Vest-blot, ble PE-ARWT, PE-ARQ640X og PE-AR-V7 plasmider konstruert ved å sette den tilsvarende AR cDNA mellom NheI og BamHI setene i pEGFP-C3.
For trans den JetPEI
TM transfeksjon reagens (Polyplus transfeksjon, Ozyme, Frankrike) ble brukt i henhold til produsentens protokoll. LNCaP celler ble sådd i 10 cm retter på 1 × 10
6 celler /tallerken eller i 6-brønner plate på 2 × 10
5 /brønn. Tre dager senere ble mediet skiftet, og cellene ble transfektert med 10 ug av den angitte plasmidet ved å bruke 20 ul av JetPEI transfeksjon reagens i 10 cm skåler eller med 3 ug plasmid ved bruk av 6 ul av JetPEI til 6-brønner plate. Mediet ble forandret 48 timer etter, og cellene ble inkubert i opp til 9 dager i henhold til forsøkene. Mediet ble skiftet annenhver dag, og for inkubasjoner utover 4 dager etter transfeksjon, ble cellene inkubert i nærvær av 400 ug /ml geneticin (Invitrogen, Frankrike).
Virkning av androgener på N-cadherin ekspresjon
LNCaP-celler ble sådd ut i 6-brønner plate i fullstendig medium og transfektert som beskrevet tidligere. Tjuefire timer senere ble mediet endret til fenol rød fri RPMI-1640 supplert med 5% dekstran-belagt trekull-strippet FCS (DCC-FCS) og med den angitte konsentrasjon av dihydrotestosteron (DHT) (Sigma-Aldrich, Frankrike) eller kjøretøy (etanol).
For eksperimentere med MDV3100, transfekterte LNCaP celler ble inkubert i RPMI-1640 supplert med 5% DCC-FCS inneholder indikert DHT dose og 100 nM MDV3100 (Enzalutamide, Selleck Chemicals, Euromedex, Frankrike) eller vehikkel (dimetylsulfoksid, DMSO). For å bekrefte effekten av androgener på N-cadherin uttrykk, ble 22Rv1 celler dyrket i RPMI-1640 med 100 nM eller 1fiM MDV3100 eller DMSO.
Cell Sorting
LNCaP celler ble sådd i 10cm retter på 1 × 10
6 celler /parabol og ble transfektert med pEGFP-ARWT eller pEGFP-ARQ640X. Fire dager etter transfeksjon ble cellene trypsinert og sortert takket være grønn fluorescens (EGFP) med en BD FACSAria-II celle sorter (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrike). Total RNA ble ekstrahert fra EGFP negative (ikke-transfektert) og EGFP positive (transfektert) celler og ble brukt til å analysere genuttrykk ved QRT-PCR.
kvantitativ real-time PCR
Totalt mobil RNA ble ekstrahert fra cellelinjer under anvendelse av NucleoSpin® RNA II-analyse (Macherey-Nagel, Frankrike) i henhold til produsentens prosedyre. RNA-konsentrasjon og renhet ble kvantifisert å måle absorbansen ved 260 nm og 280 nm (GeneQuant pro, GE Healthcare, Frankrike). Revers transkripsjon ble utført fra 400 ng eller en mikrogram RNA ved hjelp av RT Omniscript analysen (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike). RNA ble fortynnet i 13 ul, og denaturert ved 65 ° C i løpet av 5 minutter. En 7 pl reaksjonsblanding inneholdende 1 x RT templat, 0,5 mM av hver dNTP, 1 uM oligo dT, 10U RNase inhibitor og 4U Omniscript revers transkriptase ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble inkubert i 1 time ved 37 ° C. Reaksjonen ble stoppet ved oppvarming til 93 ° C i 5 minutter.
N-cadherin
,
E-cadherin
,
vimentin
,
SNAIL
,
TWIST1
, og
ZEB1
mRNA nivåer ble kvantifisert ved hjelp av real-time PCR med LightCycler 480 (Roche Applied Science, Meylan, Frankrike). For PCR reaksjoner, 5 mL LightCycler® 480 SYBR Grønn Jeg Master (Roche, Molecular Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og 1 mL spesifikke primere (tabell 1) (Qiagen, QuantiTect Grunning Courtaboeuf, Frankrike) ble blandet med 4 pl 1: 5 cDNA fortynning. Resultatene ble normalisert ved hjelp av husholdningsgenet
β-ACTIN
eller
PBGD plakater (Porphobilinogen deaminase) (Qiagen, QuantiTect Primer). Amplifisering spesifisitet ble bekreftet ved å analysere smeltekurve og ved elektroforese migrasjon. Alle forsøk ble realisert i triplikat og gjentatt 3 ganger. Relativ kvantifisering ble brukt til å determinate ganger endring i uttrykket nivået av ΔΔCt metoden. Hver verdi er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM ΔΔCt. Resultatene ble analysert med Student t-test og
p
-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant
Western Blot
Celler ble lysert i buffer som inneholder 10 mM Tris. -HCI pH 7, 140 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5 x Igepal, 5 mM DTT, 1 x fosfatase-inhibitor, og 1 x protease inhibitor. Proteinkonsentrasjonen for hver prøve ble kvantifisert ved å bruke BCA-proteinanalyse (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) i henhold til produsentens prosedyre. En mengde på 15 ug til 100 ug av total protein ble applisert på 7,5% SDS-PAGE. Etter migrering og overføring til nitrocellulosemembran, ble membraner mettet med PBS /0,1% Tween /2% ECL og inkubert ved 4 ° C over natten med 0,1 ug /ml monoklonalt muse anti-N-cadherin (katalog nr. 610920, BD Biosciences, Frankrike) eller 1 pg /ml mus monoklonalt anti AR (katalog nr. 554225, BD Biosciences, Frankrike) antistoff. β-aktin (0,2 ug /ml) (katalog nr. sc-47778, Tebu-bio, Frankrike) ble benyttet som intern kontroll. Etter vask, ble immunkomplekser oppdaget med 0,2 mikrogram /ml HRP-konjugert geit anti-mus (katalog nr. Sc-2005, Tebu-bio, Frankrike), eller 0,5 mikrogram /ml rotte anti mus IgG2a sekundære antistoffer (katalog nr. 553391, BD biovitenskap, Frankrike), og til slutt avslørt av chemiluminescence (Immobilon
TM Western, Millipore, Molsheim, Frankrike).
immunfluorescens Farging
Lab-Tek II kammer lysbilder (2 brønner) var belagt med LNCaP medium i to timer og 1 x 10
5 LNCaP-celler /brønn ble sådd ut. LNCaP-celler ble transfektert med 2 pg av pEGFP-WT, pEGFP-ARQ640X eller pEGFP-ARQ670X 3 dager senere og inkubert i 4 dager. LNCaP-celler ble skylt i PBS og fiksert med 2% paraformaldehyd. Celler ble blokkert og permeabilisert med 0,1% Triton /1% bovint serumalbumin (BSA) /PBS i 30 min ved romtemperatur. Kulturer ble inkubert med 2,5 ug /mL anti-N-cadherin mus monoklonalt antistoff (katalog nr. 610920, BD Biosciences, Frankrike) eller isotyp antistoff (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrike) ved 4 ° C over natten. Etter vasking i PBS ble LNCaP-celler inkubert med 2 ug /ml Alexa Fluor 568-konjugert geit-anti-mus (Invitrogen, Fisher Scientific, Frankrike) i 1 time og kjerner ble farget med 0,1 pg /ml DAPI-løsning i 20 minutter ved 30 ° C. Bilder ble tatt med Leica LAS AF6000 fluorescens mikroskop bruker LAS AF programvare (Leica).
Resultater
konstitutivt aktive androgen reseptor varianter oppregulere N-cadherin uttrykk i prostatakreftceller
konstitutivt aktive AR varianter som er forbundet med CRPC. Dessuten, noen studier viste at CRPC er også forbundet med en oppregulering av N-cadherin uttrykk [22], [23]. Vi undersøkte om konstitutivt aktive AR varianter oppregulere N-cadherin uttrykk i PCA celler.
N-cadherin
mRNA-nivået ble bestemt ved QRT-PCR i LNCaP-celler som overuttrykker den konstitutivt aktive AR Q640X eller AR-V7, eller AR-WT som kontroll (figur 1).
N-cadherin
uttrykk forble uendret i LNCaP celler overekspresjon AR-WT sammenlignet med kontroller. Interessant,
N-cadherin
uttrykk ble økt med 8000-fold i nærvær av ARQ640X og AR-V7 (figur 1A-B). Disse data ble bekreftet i C4-2B celler (figur S1) og på proteinnivå i LNCaP-celler (figur 1C). I tillegg er et tidsforløp eksperiment viste at N-cadherin proteinnivåer ble konsekvent økning fra dag 3 etter LNCaP-celler transfeksjon med ARQ640X (figur 1D).
A). N-cadherin-ekspresjon ble bestemt ved QRT-PCR i LNCaP-celler som overuttrykker den konstitutivt aktive AR Q640X eller AR-V7, eller AR-WT og i celler transfektert med den tomme plasmidet (C3). Celler ble dyrket i komplett medium i 9 dager etter transfeksjon. Foreldre LNCaP celler ble brukt som kontroll. y-aksen representerer den relative ganger endring sammenlignet med kontrollgruppen (foreldre LNCaP celler).
β-ACTIN
ble anvendt som endogene normaliseringskontroll. Relativ ekspresjon er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. Hver prøve sammenlignes en etter en av to hale uparede t-test.
NS: Ikke signifikant * P 0,05, ** P 0,01 og *** P 0,001
. B). Western Blot viser AR uttrykk i transfekterte og ikke transfekterte LNCaP celler. C). Immunoblot-analyse av N-cadherin ekspresjon i transfekterte LNCaP-celler 4 og 9 dager etter transfeksjon. D). Kinetisk analyse av N-cadherin-ekspresjon ved Western Blot i LNCaP-celler som overuttrykker AR Q640X fra 2 til 9 dager etter transfeksjon. β-actin ble brukt som lasting kontroll.
For å bekrefte disse data fra transient transfeksjon, ble utført en celle-sortering analyse etter LNCaP transfeksjon å vise at N-cadherin uttrykk var begrenset til celler som uttrykker en konstitutivt aktiv AR.
N-cadherin
uttrykk ble analysert i EGFP negative (ikke-transfektert celler) eller EGFP positive (transfekterte celler) fraksjoner av QRT-PCR. I samsvar med ovennevnte resultatene,
N-cadherin
uttrykk var umulig å oppdage i både EGFP- negative og positive fraksjoner følgende LNCaP transfeksjon med pEGFP-ARWT. Imidlertid ved transfeksjon med pEGFP-ARQ640X,
N-cadherin
ekspresjon ble øket i EGFP-positive celler som overuttrykker den konstitutivt aktive AR, men ikke i den EGFP negativ fraksjon (figurene 2A-B). Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved immunfluorescens analyse som viser en N-cadherin merking utelukkende i EGFP positive celler som uttrykker en konstitutivt aktiv AR variant (figur 2C).
LNCaP celler ble transient transfektert med pEGFP-ARWT eller pEGFP-ARQ640X plasmid og ble sortert etter 4 dager. EN).
N-cadherin
uttrykk ble analysert ved QRT-PCR i EGFP positive (transfektert) og EGFP negative (ikke-transfektert) fraksjoner. B). Androgenreseptoren (AR) nivået ble analysert ved hjelp av Western Blot for å kontrollere renheten av hver fraksjon etter cellesortering. C). Immunofluorescens-analyse av N-cadherin (rød fluorescens) ekspresjon i LNCaP-celler transfektert med EGFP-merket (grønn fluorescens) AR-WT, AR Q640X eller AR Q670X ekspresjonsplasmid. Forstørrelse:. × 20
Samlet utgjør disse dataene sterkt at konstitutivt aktive AR varianter oppregulere N-cadherin uttrykk i PCA celler
Androgener negativt regulere N-cadherin uttrykk indusert av. konstitutivt aktiv androgen reseptor varianter
en fersk studie rapporterte at konstitutivt aktive AR varianter kan kreve en full-lengde AR (AR-FL) for å aktivere endogene målgener. For å utforske virkningen av den endogene AR-FL tilstede i LNCaP-celler på evnen av konstitutivt aktive AR-varianter for å indusere N-cadherin ekspresjon, ble LNCaP-celler som overuttrykker AR-WT eller et konstitutivt androgen variant inkubert i nærvær av 100 nM DHT, eller kjøretøy, og N-cadherin-ekspresjon ble analysert ved QRT-PCR. I henhold til våre tidligere resultater, ble det ikke N-cadherin uttrykk observert i celler som overuttrykker AR-WT. Interessant nok ble det observert en 1,4 gangers reduksjon i N-cadherin ekspresjonsnivå når celler som overuttrykker AR Q640X eller AR-V7 ble dyrket i nærvær av 100 nM DHT i forhold til kjøretøyet (figur 3A). I tillegg er androgen-mediert N-cadherin undertrykkelse var doseavhengig (figur 3B). Disse resultatene tyder på at konstitutivt aktive androgen-reseptor-varianter ikke krever AR-FL for å oppregulerer N-cadherin uttrykk. Imidlertid synes DHT-aktivert AR-FL til å motvirke effektene av konstitutivt aktive androgen reseptor varianter på N-cadherin uttrykk (Figur 3C). For å bekrefte denne hypotesen, ble romanen anti-androgen MDV3100 brukes til å hemme DHT-aktivert AR-FL i transfekterte LNCaP celler. Som forventet, ble det observert en ytterligere betydelig økning av N-cadherin ekspresjon i LNCaP-celler som overuttrykker AR variantene i nærvær av 100 nM MDV3100 (figur 3D). Disse resultater ble også bekreftet i kastrerings-resistente 22Rv1 celler, som er kjent for å uttrykke både AR-FL og konstitutivt aktive AR-varianter. Det ble observert en 2-ganger økning i N-cadherin mRNA nivå når 22Rv1 celler ble dyrket i 4 dager i nærvær 100 nM og 1 uM av anti-androgen MDV3100 (figur S2).
A). LNCaP-celler ble dyrket i RPMI-1640 inneholdende 5% FCS og DCC-100 nM DHT eller bærer (EtOH). N-cadherin-ekspresjon ble analysert ved QRT-PCR i LNCaP-celler 4 dager etter transfeksjon med AR-WT eller den konstitutivt aktive AR Q640X eller AR-V7 ekspresjonsplasmid. B). N-cadherin ekspresjonsnivået i LNCaP-celler ble undersøkt ved QRT-PCR 4 dager etter transfeksjon med AR Q640X ekspresjonsplasmidet i nærvær av forskjellige DHT-konsentrasjon (10 nM, 25 nM og 50 nM) eller bærer. C). N-cadherin ekspresjon indusert av konstitutivt aktive AR-varianter (AR varianter) er negativt regulert når LNCaP-celler ble dyrket i nærvær av DHT. Vi hypotese at endogen AR-FL stede i LNCaP celler og AR varianter kan handle annerledes. I denne modellen undertrykker DHT-stimulert endogen AR-FL N-cadherin uttrykk mens AR varianter oppregulere sitt uttrykk. D). LNCaP-celler som overuttrykker AR-WT, AR Q640X og AR-V7 ble dyrket i DCC-FCS-medium supplert med 100 nM DHT, og i nærvær av 100 nM av MDV3100 eller DMSO som kontroll i løpet av 3 dager. N-cadherin uttrykk ble analysert ved QRT-PCR 4 dager etter transfeksjon, og var normalisert til
β-ACTIN
. Den ΔΔCt metoden ble brukt for å beregne relative uttrykk og hver verdi ble rapportert som gjennomsnittet av ΔΔCt ± SEM.
NS: Ikke Betydelig * P 0,05, ** P 0,01 og *** P 0,001
Alle sammen, disse data tyder på at DHT-aktivert AR-FL. kunne konkurrere med konstitutivt aktiv androgen receptor for regulering av N-cadherin uttrykk.
konstitutivt aktive androgen-reseptor-varianter er assosiert med ekspresjonen av mesenchymale markører
det er allment kjent at det i tumorceller, ekspresjon av mesenchymale markører er forbundet med en nedregulering av epiteliale markører. Vi antok at oppregulering av N-cadherin ekspresjon observert i nærvær av konstitutivt aktive AR-varianter er ledsaget av en redusert ekspresjon av E-cadherin. For å teste denne hypotese, analyserte vi E-cadherin ekspresjon i LNCaP transfektert med ARQ640X, AR-V7 eller villtype-AR ekspresjonsplasmid, eller det tomme plasmidet som kontroll.
E-cadherin
mRNA nivåer i LNCaP celler ved transfeksjon med ARQ640X eller AR-V7 uttrykk plasmid viste ingen signifikant forskjell sammenlignet med kontroller (Figur 4A). Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved Western blot-analyse (data ikke vist), noe som tyder på at ekspresjon av konstitutivt aktive AR-varianter i PCa er forbundet med en markert økning i N-cadherin uttrykk, men er ikke korrelert med en nedregulering av E- cadherin.
LNCaP celler ble transfektert med nevnte ARwt, ARQ640X eller AR-V7 uttrykk plasmid eller tomt plasmid (C3). EN).
E-cadherin
, B).
vimentin
, C).
TWIST1
, D).
SNAIL Hotell og E).
ZEB1
uttrykk nivåer ble analysert ved QRT-PCR på dag-9 etter transfeksjon. For hver prøve, uttrykk nivåer ble normalisert til
PBGD
eller
β-ACTIN Hotell og rapporteres som relativ verdi til LNCaP foreldrecellelinje. Verdier er presentert som gjennomsnittet av ΔΔCt ± SEM.
NS: Ikke Betydelig * P 0,05, ** P 0,01 og *** P 0,001
. F). Western Blot viser utviklingen av ZEB1 uttrykk i LNCaP celler overekspresjon konstitutivt aktive AR varianter. Immunoblot fra 100 ug av det totale proteinekstrakter. β-actin ble brukt som lasting kontroll.
Vi har også undersøkt om konstitutivt aktiv AR uttrykk i PCA celler er assosiert med andre mesenchymale markører. Expression nivåer av
vimentin Hotell og transkripsjonsfaktorer
TWIST1, ZEB1 Hotell og
SNAIL
ble bestemt ved QRT-PCR på dag-9 etter LNCaP celler transfeksjon med ARQ640X eller AR-V7 ekspresjonsplasmid, villtype-AR plasmid eller den tomme vektoren som kontroller (figur 4B-E).
vimentin
uttrykk ble økt med 2,5 og 1,5 ganger i LNCaP celler som overuttrykker ARQ640X og AR-V7 sammenlignet med kontroller henholdsvis (figur 4B).
Selv Twist1 er kjent for å indusere
N-cadherin
uttrykk i PCA ingen signifikant forskjell i mRNA nivåer av
TWIST1
ble observert (Figur 4C). Men konstitutivt aktive AR varianter førte til en statistisk signifikant økning av
SNAIL Hotell og
ZEB1
mRNA nivåer (figur 4D, E). ZEB1 oppregulering ble også bekreftet på proteinnivå (figur 4F).
Diskusjoner
AR signalering er svært viktig for spredning og overlevelse av prostata kreft celler. AR veien forblir aktivert under utviklingen av PCa mot en kastrering-resistent sykdom og fremveksten av konstitutivt aktiv AR-varianter mangler ligand-bindende domene er nå ansett som en viktig hendelse i CRPC. Til tross for noen studier tyder på at konstitutivt aktive AR varianter har en innvirkning på tumorprogresjon, forblir deres funksjon så langt uavklart.
I denne studien har vi vist at N-cadherin er oppregulert i LNCaP celler uttrykker konstitutivt aktiv AR varianter, men ikke i LNCaP celler som overuttrykker en full-lengde AR. Disse dataene antyder for første gang at konstitutivt aktive AR varianter kan indusere N-cadherin uttrykk. Dette funnet bør kobles til nyere studier rapporterer en sammenheng mellom CRPC og N-cadherin oppregulering [22], [23], [24]. I samsvar med disse studiene våre data tyder på at konstitutivt aktiv AR varianter signalering kan være en mekanisme som fører til N-cadherin uttrykk i CRPC.
Disse funnene igjen markere sammenhengen mellom AR signalveien og N-cadherin uttrykk. Nyere studier tyder på at AR regulerer negativt N-cadherin uttrykk [22], [23]. Faktisk er N-cadherin oppregulering assosiert med en redusert ekspresjon av AR i kastreringsfast PCA xenotransplantater [23]. Videre kan oppregulering av N-cadherin observert i kastrerings-resistente LNCaP-celler 19 bli reversert i nærvær av androgener [22], [26], [27]. I samsvar med disse data, har vi vist at androgener var assosiert med en redusert N-cadherin ekspresjon i vår modell som overuttrykker en konstitutivt aktiv androgen receptor variant. Disse resultatene tyder på at AR-FL og konstitutivt aktive AR varianter kan handle annerledes (Figur 3C). For eksempel kan DHT-stimulert AR-FL rekruttere co-repressors og i sin tur undertrykker
N-cadherin
uttrykk. Dessuten varianter konstitutivt aktiv AR mangler av karboksyterminale region kan oppføre seg annerledes og indusere
N-cadherin
uttrykk. Videre kan AR-FL og konstitutivt aktive AR varianter konkurrere med hverandre for å regulere N-cadherin uttrykk. I samsvar med denne hypotesen,
N-cadherin
genet inneholder en klynge av androgen responselementer (ER) gjentar i intron 1 [28].
Men konstitutivt aktive AR varianter kan også indirekte kontroll
N-cadherin
uttrykk. For eksempel, i prostatakreft,
N-cadherin
uttrykk var assosiert med en kjernefysisk translokasjon av Twist1 [29]. Selv om våre data viste ingen signifikant forskjell i
TWIST1
mRNA nivåer, kan konstitutivt aktive AR varianter forbedre kjernefysisk translokasjon av Twist1, som igjen kan indusere
N-cadherin
uttrykk etter binding til E- boks innen den første intron av
N-cadherin
.
Disse hypotesene fortjener å bli studert i videre studier for å forstå hvordan konstitutivt aktive AR varianter regulere
N-cadherin
uttrykk.
i denne studien har vi også vist at konstitutivt aktive AR varianter ble assosiert med økt uttrykk av mesenchymale markører som
vimentin
,
SNAIL Hotell og ZEB1. Disse resultatene er i samsvar med en fersk undersøkelse, som viste en økning på mesenchymale markører i svulster fra pasienter behandlet med androgen deprivasjon terapi [24]. Til sammen våre funn tyder på at konstitutivt aktive AR varianter kan være assosiert med EMT prosessen. Men disse markørene ikke konsekvent assosiert med EMT. For eksempel, SNAIL gir resistens mot apoptose i tumorceller som er utsatt for ioniserende stråling og genotoksiske narkotika, og gjør det mulig for brystceller til å bli tumor-initiering celler [30], [31], [32], [33], [34].
uttrykket av mesenchymale markører rapportert her i nærvær av konstitutivt aktive AR varianter var ikke assosiert med en nedregulering av E-cadherin i vår modell. Den inverse sammenhengen mellom N-cadherin oppregulering og E-cadherin downregulation er fortsatt debattert. Faktisk McKeithen og kolleger, og mer nylig Tiwari og kolleger rapportere en co-uttrykk for både E- og N-cadherins i tumorceller [35], [36]. I disse studiene viser E-cadherin protein forskjellige subcellulære lokalisering. Videre er det rapportert N-cadherin oppregulering etter kastrering i LNCaP-celler som 19 ikke er ledsaget av en reduksjon av E-cadherin ekspresjon i
in vitro cellekultur
[22]. Likevel er den forventede E-cadherin nedregulering i denne modellen bare observert i ortotopiske svulster etter kastrering, men ikke i subkutane LNCaP-19 tumorer, noe som antyder en viktig rolle for det omgivende miljø for prostata E-cadherin nedregulering [22]. Dessuten har en invers korrelasjon mellom kastrering-indusert N-cadherin uttrykk og E-cadherin downregulation blitt dokumentert i LAPC9 og LuCaP35 subkutane xenoimplantater modeller [23], [24]. Men dette cadherins Bryteren har ikke blitt rapportert i to studier som fokuserer på kliniske svulster prostata, fra pasienter med eller uten androgen deprivasjon terapi [22], [24].
Videre studier er garantert å forstå funksjonelle konsekvenser av N-cadherin og andre mesenchymale markører oppregulering i nærvær av konstitutivt aktive AR-varianter. N-cadherin uttrykket er vidt forbundet med tumorprogresjon særlig på grunn av sin rolle i migrering og invasjon. Faktisk favoriserer N-cadherin migrering av kreftceller via cytoskjelettet omorganisering og lamellipodia formasjon [14]. Det fremmer også migreringen av kreftceller som etablerer homofilist interaksjoner med nærliggende vev som det stromale vev eller endotel [37], [38]. N-cadherin uttrykk er også forbundet med overlevelse i prostatakreftceller og melanomceller. Faktisk kan N-cadherin uttrykk aktivere phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT vei å inaktivere pro-apoptotiske proteiner og å indusere en økning av anti-apoptotiske proteiner som BCL-2 [39], [40]. Til slutt, en fersk studie viste at N-cadherin kunne mekle angiogenese ved å fremkalle monocyttkjemoattraktant protein-1 (MCP-1) uttrykk via PI3K /AKT vei [41].
Det er for tiden stor interesse for modus virknings konstitutivt aktive AR varianter i CRPC. I denne studien har vi vist for første gang at konstitutivt aktiv AR varianter indusere N-cadherin uttrykk og andre mesenchymale markører ved PCA. Disse funnene støtter hypotesen om at disse konstitutivt aktive AR varianter kan bidra til systemisk spredning av PCA celler, og forsterke viktigheten av å målrette disse AR varianter ved PCA.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
