Abstract
Flere studier markere rollen inflammasjonsmarkører i trombose samt i kreft. Men deres kombinerte rolle i cancerassosierte dyp venetrombose (DVT) og de molekylære mekanismer som er involvert i den patofysiologi, må ytterligere undersøkelser. I den foreliggende undersøkelse, C-reaktivt protein, interleukin-6 (IL-6), tumor nekrose faktor-α (TNF-α), interleukin-1 (IL-1β), matriks-metallproteaser-9 (MMP-9), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), vevsfaktor (TF), fibrinogen og løselig P-selektin, ble analysert i plasma og i monocytt prøver fra 385 kreftpasienter, hvorav 64 ble samtidig påvirket av DVT (+). Alle disse markørene var høyere hos kreftpasienter DVT + enn i de DVT-. Følgelig ble betydelig høyere NF-kB aktivitet observert hos kreftpasienter DVT + enn DVT-. Signifikant korrelasjon mellom data oppnådd i plasma og monocytt prøvene ble observert. NF-kB hemming var assosiert med reduserte nivåer av alle molekyler i både kreft DVT + og DVT-. For ytterligere å demonstrere involvering av NF-kB aktivering av de ovennevnte molekyler, behandlet vi monocytter utledet fra friske givere med en pool av sera fra kreftpasienter med og uten DVT. Disse sett med eksperimenter tyder på betydelig rolle spilt av noen molekyler, regulert av NF-kB ytterligere, og detektert i kreftpasienter med DVT. Våre data understøtter ideen om at NF-kB kan betraktes som et terapeutisk mål for kreftpasienter, spesielt de som er komplisert ved DVT. Behandling med NF-kB hemmere kan representere en mulig strategi for å forhindre eller redusere risikoen for DVT hos kreftpasienter
Citation. Malaponte G, Signorelli SS, Bevelacqua V, Polesel J, Taborelli M, Guarneri C, et al. (2015) økte nivåer av NF-kB-Dependent Markører i Cancer-Associated dyp venetrombose. PLoS ONE 10 (7): e0132496. doi: 10,1371 /journal.pone.0132496
Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA
mottatt: 14 mars 2015; Godkjent: 15 juni 2015; Publisert: 20.07.2015
Copyright: © 2015 Malaponte et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er fritt tilgjengelig på papir og i saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den relative risikoen for å utvikle dyp venetrombose (DVT) er omtrent sju ganger høyere hos pasienter med kreft [1,2] antyder en toveis sammenheng mellom trombose og betennelse i kreft. Kjemoterapi er en av de viktigste risikofaktorene for økt risiko for DVT [3,4]. Trombose og kreft er forbundet med en rekke patofysiologiske mekanismer som er generelt knyttet til vertsrespons til kreft. Disse mekanismene omfatter aktivering av koagulering og fibrinolytiske systemer, akuttfase-reaksjon, betennelse, og cytokinproduksjon [5]. Systemisk aktivering av koagulasjon som oppstår i malignitet er vel kjent og har blitt beskrevet under navnet Trousseau syndrom [6,7]. Systemisk inflammasjon er en potent prothrombotic stimulus som fører til en oppregulering av prokoaguleringsbetingelser faktorer, nedregulering av antikoaguleringsmidler og inhibering av fibrinolytisk aktivitet [8,9]. Kronisk betennelse er ofte forbundet med økt risiko for kreft [10,11]. Rudolf Virchow viste nærvær av leukocytter i tumorer, og foreslo at det oppstår tumorer i områder av kronisk inflammasjon og det inflammatoriske mediatorer, ved å forbedre celle-proliferasjon, kan tjene som tumorpromotere [12]. Inflammatoriske celler, cytokiner i ondartede svulster påvirker stromal mikromiljøet, noe som tyder på at betennelse og kreft kan være beslektede gjennom angiogeneprosessen [13-15]. I løpet av inflammasjon, angiogenese sammenfaller ofte med infiltrasjon av inflammatoriske celler slik som nøytrofiler, monocytter /makrofager, som skiller ut cytokiner og vekstfaktorer [13,16,17]. Det ble vist at en rekke mediatorer spiller en viktig rolle i inflammasjon, cancer og trombose, for eksempel C-reaktivt protein, interleukin-6 (IL-6) og tumornekrosefaktor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β ) (markører for inflammasjon), matriks-metallproteaser-9 (MMP-9), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) (reflekterer angiogenese), vevsfaktor (TF) og fibrinogen (koagulasjonsmarkører) og oppløselig P-selektin (markering blodplateaktivering) . Inflammatoriske cytokiner oppregulerer forskjellige angiogene faktorer, slik som VEGF og MMP-9, i vaskulære endoteliale celler, kreftceller og monocytter /makrofager [18-35]. Monocytter delta i de patologiske prosesser av betennelse og trombose gjennom deres evne til å syntetisere TF og som uttrykker P-selektin ved stimulering [36-38]. Vevsfaktor (TF), som er den primære cellulære initiator av blodkoagulering, bidrar til tumorrelaterte patologiske prosesser, slik som hyperkoagulerbarhet, tumor vekst, angiogenese og metastase [39-40]. Intriguingly, er alle av disse molekylene regulert av NF-kB [41,42]. Dette er en induserbar transkripsjonsfaktor styrt av signalaktiverings kaskader. NF-kB styrer et antall gener som er involvert i inflammatoriske responser, cellesyklusprogresjon, hemming av apoptose og celleadhesjon, og dermed fremme tumor angiogenese, karsinogenese og progresjon av kreft. Forebygging og behandling av DVT hos kreftpasienter kan påvirke pasientbehandling, prognose og livskvalitet. Derfor er det et behov for å identifisere nye bio-molekylære markører som kan gjenkjenne kreftpasienter med høy risiko for blodpropp. Selv om flere studier undersøkt på rollen til ulike biomarkører og /eller cytokiner i kreft og /eller trombose, har ingen tidligere studier analyseres sammen disse NF-kB-regulerte markører som i sin tur regulerer NF-kB seg i kreftpasienter med og uten trombose. Identifiseringen av disse markørene kan gjenkjenne NF-kB som et attraktivt mål for terapeutisk intervensjon.
I denne studien en brøkdel av NF-kB-regulerte markører har blitt målt i perifert blod fra kreftpasienter med og uten DVT . Videre er effekten av dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ), et NF-kB-inhibitor [43,44], ble vurdert for å demonstrere direkte rolle av NF-kB-regulerte markører i trombose utvikling hos kreftpasienter. Videre kan identifisering av biomolekylære markører for DVT hos kreftpasienter støtter betydningen av farmakologiske tromboseprofylakse.
Metoder
studiepopulasjonen
Perifere blodprøver fra tre grupper av forsøkspersoner var samlet inn i løpet av de siste 10 årene ved Institutt for Bio-medisinske fakultet, Universitetet i Catania, Catania, Italia. Disse gruppene som følger med: 64 kreftpasienter med samtidig DVT (DVT +) (gjennomsnittsalder 64 ± 10 år); 321 kreftpasienter med ingen historie av DVT (DVT-) (gjennomsnittsalder 62 ± 9 år); 100 friske kontroller (gjennomsnittsalder 61 ± 12 år), matchet etter kjønn og alder (tabell 1). Pasientene ble diagnostisert som påvirkes av DVT, basert på ingen komprimering av en dyp vene i nedre ekstremitetene av doppler sonde og /eller ved nærvær av den ekkogene mønster inn i en dype vener i underekstremitetene. DVT pasienter ble rekruttert ved DVT forekomst. Perifere blodprøver fra disse pasientene ble innhentet før forutsetningen om noen bestemt antitrombotisk medikament. Detaljert informasjon om studien ble gitt til pasientene. Alle pasienter ga et skriftlig informert samtykke før innmelding. Vår studie ble godkjent av University of Catania etikkomité. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen. Alle personene i dette manuskriptet har gitt skriftlig informert samtykke (som beskrevet i PLoS samtykkeskjema) for å delta i denne studien. Pasienter som behandles med anti-inflammatoriske medisiner, statiner og kreft forbindelser som, bevacizubam, thalidomid, lenalidomid og /eller strålebehandling ble ekskludert. Andre eksklusjonskriterier inkludert: BMI 35 kg /m
2, alvorlig systemisk depresjon, diabetes, dyslipidemier, høyt blodtrykk, kroniske betennelsessykdommer, hjertesvikt på ulike tidspunkt, mild eller alvorlig nyresvikt (kreatinin ≥ 2,0 mg /dl), pancytopeni og nyere kirurgiske inngrep ( ≤ 3 måneder). Venøse blodprøver ble samlet inn minst etter 3 måneder av siste kreft behandling for både kreft pasienter DVT + og DVT-
Forkortelser:. DVT, dyp venetrombose; BMI, body mass index.
Blod og laboratorieprosedyrer
Blod ble samlet inn fra hver pasient og friske kontroller trukket i å pyrogenfrie blod samling rør med og uten tilsetningsstoffer. Citratholdig blodplatefattig plasma ble gjort ved hjelp av to sentrifuger trinn: 5 minutter ved 4000 r.p.m, og 10 minutter ved 11000 rpm Flere porsjoner av serum og plasma ble lagret ved-80 ° C. Blodprøver ble benyttet for de følgende analyser: 1) CRP, fibrinogen, IL-6, TNF-α, IL-1β, MMP-9, VEGF, TF-antigen og SP-selektin plasmanivåer; 2) monocytter isolasjon. Plasma fibrinogen nivåer og høy følsomhet C-reaktivt protein ble målt med standard teknikker som brukes i Central Laboratory of Catania universitetssykehus. IL-6, TNF-α, IL-1β, MMP-9, VEGF og SP-selektin ble målt ved hjelp av enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA; R Thiazolyl blå) og dimetylsulfoksid (DMSO) ble kjøpt fra Sigma Chemical (St. Louis, Missouri, USA). Iscoves medium og Polymixin B fra Gibco, Life Technologies Inc (Milano, Italia).
DHMEQ (dehydroxymethylepoxyquinomicin), syntetisert som tidligere beskrevet [43] ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) ved en konsentrasjon på 10 ug /ml og lagret ved 20 ° C. Denne stamløsningen ble fortynnet i kulturmedium til en sluttkonsentrasjon på under 0,1%. Midler. DHMEQ ble vennlig levert av Dr Kazuo Umezawa, Institutt for Anvendt kjemi, Fakultet for naturvitenskap og teknologi, Keio University, Yokohama, Japan.
Isolering av humane monocytter
Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert fra citrat blod kreftpasienter DVT + og DVT- og friske kontrollpersoner ved Ficoll-Paque. For isolering av monocytter, ble PBMC plassert i 2 timer i kultur plate, og de ikke-adherente celler ble fjernet med tre forandringer av varm PBS. Pure monocytter ble så positivt valgt av anti-CD14-belagt magnetiske mikroperler (Mini MACS separasjon kolonne; Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) Følgende produsentens instruksjoner. Monocyte renhet var 98%, som målt ved flow-cytometri (data ikke vist). Cellene ble samlet og resuspendert i en sluttkonsentrasjon på 1×10
6 celler /ml i et frysemedium bestående av 30% autologt plasma citrat, 60% Iscoves og 10% DMSO. Neste cellene ble frosset i alikvoter på 1 ml i sterile cryovials (Greiner, Tyskland) ved hjelp av en standard prosedyre kontrollert frysing og deretter lagret i flytende nitrogen.
Behandling og dyrkning av humane monocytter
Når tining ved værelsestemperatur, de cryopreserved monocytter hadde en levedyktighet på 85%, som vist ved trypan blå eksklusjon. Humane monocytter ble analysert for NF-kB-aktivering, for cytokiner produksjon og for TF aktivitetsanalyse (se etterfølgende tekst). I korthet, monocytter (5 x10
5 /ml) ble høstet, vasket og sådd ut på brønner i RPMI 1640 supplert med 10% varme-inaktivert FBS, L-glutamin (2 mM), penicillin (100 IU /ml) streptomycin (100 ug /ml), og forbehandlet med DHMEQ (10 ug /ml) i 2 timer, og hvoretter inkubert i 24 timer. Deretter ble cellekultur-supernatanter oppsamlet for kvantifisering av cytokin proteinnivået ved en enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA). Endotoksin forurensning av cellekulturer ble rutinemessig utelukket med den kromogene Limulus amebocyttlysat-analyse (Sigma). Videre er det i alle cellekulturer 10 ug /ml polymiksin B ble tilsatt for å nøytralisere eventuelle LPS forurensning.
ELISA for aktiv NF-kB p65 subenheten
For måling av NF-kB-aktivering p65 subenheten , nukleære ekstrakter ble fremstilt fra 5×10
5 monocytter, forhåndsbehandlet og ikke med DHMEQ (10 ug /ml) i 2 timer og deretter stimulert med 100 ng /ml LPS for det ønskede tidsrom, ved anvendelse av en Nuclear Extract Kit ( aktiv Motif, Rixensart, Belgia) i henhold til produsentens protokoll. Nivåer av atom P65 konsentrasjoner ble bestemt av en følsom ELISA assay (trans-AM, Aktiv Motif, Rixensart, Belgia).
Påvisning av TF aktivitet i monocytter av en kromogen analyse
I cellelysater aktiviteten TF ble målt ved actichrome1 TF aktivitet kit (American diagnostisk, Pfungstadt, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk. Prøvene ble inkubert sammen med faktor VII og Spectrozyme FVIIa. TF-FVIIa komplekse spalter Spectrozyme FVIIa som et meget spesifikt kromogent substrat frigjør en paranitroanilin-kromofor med en bestemt endring av absorpsjon ved 405 nm. Resultatene er uttrykt i picomol per liter (PM) av peptidyl aktivitet lipidert TF spalte Spectrozyme FVIIa komplekset.
Serum avhengig aktivering av cytokiner og NF-kB i monocytter
Monocytter (5×10
5) fra 25 friske donorer ble dyrket i 20 timer i medium (RPMI 1640) supplert med enten 40% serum fra 64 kreftpasienter DVT + og 257 DVT- med de høyeste cytokiner plasmanivåer (≥ 75
th persentil) eller 40% serum fra 100 friske givere med lavest cytokiner verdier (≤ 25
th persentil). For behandling av serum, ble 80μl av serum fra hver kreftpasient DVT + og DVT- og fra hvert frisk donor tilsatt til monocytt kulturmediet umiddelbart etter tining. Cellene ble behandlet med DHMEQ (10 ug /ml) i 2 timer, og deretter stimulert med 100 ng /ml LPS for den ønskede periode. Behandling av monocytter med LPS ble anvendt som positiv kontroll. I de LPS forsøkene ikke polymiksin B ble tilsatt. Etter inkubering ble cellekultursupernatanter også oppsamlet for kvantifisering av cytokin protein nivå og NF-kB-aktivering ved hjelp av ELISA.
MTT-analysen
Effekter av DHMEQ på cellenes levedyktighet ble analysert ved 3- ( 4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetranatrium-bromid (MTT) metoden [45]. Monocyttene (3×10
5) ble sådd ut i 96-brønners plater i 48 timer for cytostatisk DHMEQ. Serielle fortynninger av DHMEQ (ved 2 ug /ml, 5 ug /ml, 10 ug /ml) ble samlet og tilsatt til cellene. Etter inkubasjon med DHMEQ eller DMSO ved de angitte konsentrasjoner og tidspunkter. Celler behandlet ved MTT-oppløsning (1 mg /mL) i 4 timer ble målt ved hjelp av en mikroplateleser (Bio-Rad, Richmond, CA) ved en referansebølgelengde på 630 nm og en testbølgelengde på 570 nm. Cellelevedyktigheten ble uttrykt som en prosentandel av DMSO-behandlede kontrollprøver.
Statistisk analyse
For kontinuerlige variabler, forskjell i gjennomsnittlig mellom studiegruppene ble evaluert ved analyse av varians (ANOVA, i tilfelle av tre grupper), eller t-test (to-grupper). For diskrete variabler, ble forskjellen i fordelingen mellom ulike studiegrupper evalueres gjennom testen χ
2 test. Sammenhengen mellom kontinuerlige variabler ble evaluert gjennom Spearman rank korrelasjonskoeffisienten
r
.
Resultater
baseline karakteristikker av friske kontroller og kreftpasienter med og uten DVT er vist i tabell 1. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom gruppene med hensyn til alder, kjønn, røyking, og kroppsmasseindeks. Frekvensen av lokaliserte cancere var lignende hos kreftpasienter med og uten DVT, så vel som fordelingen av krefttype /området (tabell 1).
Biomarker plasmanivåer av inflammasjon, angiogenese og koagulasjon hos kreftpasienter DVT + og DVT-
Mean plasmanivået av ulike biomarkører, inkludert de av betennelse, angiogenese og koagulasjon, analysert i kontrollgruppen og hos kreftpasienter med og uten DVT er rapportert i Tabell 2. Sammenlignet med kontrollgruppen, høyere plasma CRP-nivå, fibrinogen, IL-6, TNF-α, IL-1β, MMP-9, ble VEGF, TF-antigen, og SP-selektin observert hos kreftpasienter med og uten DVT (P 0,01). Som forventet, vil konsentrasjonen av alle markører i DVT + gruppen var signifikant høyere enn i DVT- (p 0,01) med det eneste unntak av fibrinogen (p = 0,35). Korrelasjon av alle markører med hverandre er rapportert i (S1 tabell). Positive korrelasjoner (| r | 0,45) mellom CRP, IL-6, TNF-a, IL-1, MMP-9, VEGF, og TF-antigen ble funnet i begge grupper av kreftpasienter, mens den fibrinogen korrelert bare i DVT + gruppe. Ingen sammenheng mellom markørene ble observert hos friske kontroller (S1 tabell)
Forkortelser:. DVT, dyp venetrombose; IL-6, interleukin-6; TNF-α, tumor nekrose faktor-α; IL-1β, interleukin-1β; CRP, C-reaktivt protein; MMP-9, matriks-metalloproteinase-9; VEGF, vaskulær endotelial vekstfaktor; TF, vev faktor; løselig P-selektin (SP-selectin). Vesentlige forskjeller mellom inflammatoriske, angiogene og koagulasjonsmarkører var tydelig hos kreftpasienter med og uten DVT sammenlignet med kontroller med ytterligere økning i DVT kreftpasienter. P-verdien er gitt ved hjelp av variansanalyse (ANOVA test, i tilfelle av tre grupper), eller t-test (to-grupper).
Cytokiner og MMP-9-sekresjon i humane monocytter
utskillelsen av disse markørene analysert i monocytter supernatant viste lignende trend som er observert i plasma. Spontan produksjon av cytokiner, slik som IL-6, TNF-α, Il-1β og VEGF var signifikant høyere i begge grupper av kreftpasienter med og uten DVT enn de fra friske kontroller (p 0,0001) (figur 1). Sammenlignet med DVT- kreftpasienter, DVT + viste en økt ganger endring på 1,28 (95% KI: 1,20 til 1,37; p 0,0001), 1,34 (95% KI: 1,23 til 1,46; p 0,0001), 1,41 (95% CI: 1,30 til 1,54; p 0,0001), og 1,61 (95% KI: 1,45 til 1,78; p 0,0001) for IL-6, TNF-α, IL-1β, og VEGF, henholdsvis. I tillegg til cytokiner, også MMP-9 produksjon og TF aktivitet var høyere i DVT + kreftpasienter enn hos dem DVT- og friske kontroller (gjennomsnitt ± SD, 103 ± 23, 73 ± 24, 8,8 ± 4, for MMP-9 og middelverdi ± SA, 35,6 ± 6,4, 28 ± 5, 3,3 ± 0,7 for TF-aktivitet, henholdsvis). Som forventet, sterk korrelasjon mellom nivåene av IL-6, TNF-α, IL-1β, VEGF, MMP-9 og TF i plasma fra kreftpasienter DVT + og DVT- og de som frigjøres fra monocytter av de samme pasientene ble observert (tabell 3 ).
Nivåer av IL-6, TNF-α, IL-1β, og VEGF ble målt i supernatantene av rensede monocytter fra kreftpasienter med og uten DVT av et følsomt enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA). Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD.
DVT, dyp venetrombose. En positiv sterk korrelasjon mellom plasma cytokiner, angiogene og koagulasjonsmarkører og utskillelsen
in vitro
av de samme merkene i to grupper av kreftpasienter med og uten DVT.
Effekt av DHMEQ på NF-kB p65 subenheten aktivitet i monocytter
Aktivering av NF-kB p65 subenhet i ikke-stimulerte monocytter, fra kreftpasienter DVT + og DVT- og fra friske kontroll, ble analysert av en følsom ELISA assay. Denne analysen har fordelen av å være ti ganger mer sensitive enn elektroforese mobilitetsskift-analyse (EMSA) og tillater større fleksibilitet i den eksperimentelle trinn. Som vist i figur 2, NF-kB p65 subenheten aktivitet på monocytter varieres på alle undersøkte grupper. Høyere NF-kB p65 subenheten aktivitet ble observert hos kreftpasienter DVT + og DVT- enn hos friske kontroller (p 0,0001). Signifikante forskjeller av NF-kB p65 aktivitet ble også påvist mellom kreftpasienter DVT + og DVT- (p 0,0001). Det ble allerede vist at NF-kB regulerer flere molekyler inkludert de som er analysert i den foreliggende undersøkelsen [41,42]. Følgelig er alle disse markørene positivt korrelert med NF-kB aktivitet (tabell 4). Identifiseringen av disse markørene kan gjenkjenne NF-kB som et attraktivt mål for terapeutisk intervensjon. Derfor tenkte vi å hemme NF-kB ved DHMEQ, en kjent NF-kB hemmer [46,47]. Effekten av DHMEQ, ved en dose på 10 ug /ml, på NF-kB p65 subenheten aktivitet inhibering i monocytter fra de to grupper av kreftpasienter, ble undersøkt (Fig 2). Kontroll eksperimenter med DMSO er inkludert (figur 2). Spesielt, DHMEQ var ikke effektive i monocytter fra friske kontroller på annen dose og tid (S1 fig). Selv DHMQ forårsaket reduksjon av cellenes levedyktighet av monocytter avledet fra kreftpasienter DVT + og DVT-, ble denne effekten ikke observert i monocytter fra friske kontroller (S2 fig).
Den aktiverte NF-kB p65 subenheten var signifikant høyere hos kreftpasienter DVT + og DVT- enn hos friske kontroller (P 0,0001). (ANOVA test). NF-kB p65 subenheten var signifikant høyere hos kreftpasienter DVT + enn i de DVT- (P 0,001) (t-test). For å undersøke effekten av DHMEQ, ble monocytter behandlet med 10 mikrogram /ml DHMEQ. Som kontrollforsøk, ble DMSO anvendt i stedet for DHMEQ. Monocytter fra kreftpasienter DVT + var mer lydhør overfor DHMEQ enn de fra DVT-. Forbløffende nok ingen effekt av DHMEQ det var hos friske monocytter. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD. OD, optisk tetthet; DVT, dyp venetrombose; DMSO, dimetylsulfoksid;
Forkortelser DHEMQ, dehydroxymethylepoxyquinomicin. DVT, dyp venetrombose. En positiv korrelasjon ble funnet mellom NF kb p65 subenhet aktivitet og alle molekyler i kreftpasienter med og uten DVT. Spearman Rank korrelasjonsanalyse ble anvendt.
Effekt av LPS og DHMEQ på nukleær faktor-kB p65 i monocytter
Som vist i figur 3, behandling av monocytter med LPS ved 100 ng /mL sterkt aktivert NF-kB p65 på 46%, 73% og 35% i forhold til basalverdien sammenlignet med ustimulerte celler i kreftpasienter DVT +, DVT- og i friske kontroller, respektivt (p 0,0001). Preinkubering med DHMEQ, før LPS stimulering, sterkt redusert NF-kB p65 subenheten aktiviteten til 4,5-ganger, tre ganger og 3,2-ganger i kreft DVT + og DVT- og i friske kontroller (p 0,0001), sammenlignet med LPS alene. For å forsterke våre funn på NF-kBp65 nedregulering av DHMEQ i LPS-aktiverte monocytter, ble mengden av NF-kB p65 subenheten aktivitet i kjernefysiske ekstrakter fra de samme eksperimentene senere målt med ELISA. Som forventet, behandling med DHMEQ i LPS stimulerte monocytter indusert reduksjon av NF-kB aktivitet blant de tre gruppene som ble analysert (fig 3).
Nuclear ekstrakter ble fremstilt fra monocytter, forbehandlet og ikke med DHMEQ (10 mikrogram /ml) i 2 timer og deretter stimulert med 100 ng /ml LPS i 24 timer, ved anvendelse av en Nuclear Extract Kit. Stimulering av monocytter med LPS på 100 ng /ml indusere un betydelig økning av den kjernefysiske NF-kB p65 protein nivå i alle grupper eller kreftpasienter DVT +, DVT- og hos friske kontroller, sammenlignet med ikke-stimulerte celler, (P 0,0001). NF-kB p65 subenheten var signifikant høyere hos kreftpasienter DVT + enn i de DVT- (P 0,0001) (t-test). DVT, dyp venetrombose.
Effekter av DHMEQ på markører utgivelsen av monocytter
DHMEQ behandling ble brukt til å asses hvis NF-kB er direkte forbundet med utgivelsen av alle merkene, oppdaget ovenfor, fra monocytter kreftpasienter DVT + og DVT-. Fig 4 viser at behandling med DHMQ dramatisk reduserer nivåene av IL-6, TNF-alfa, IL-1beta og VEGF i begge grupper av kreftpasienter, sammenlignet med ubehandlede celler. Lignende trend ble observert for MMP-9 og TF. I motsetning til dette ble det ikke observert noen forskjeller i kontrollgruppen hvor konstitutiv NF-kB-aktivering var fraværende.
Monocytter ble behandlet eller ikke med 10 ug /ml DHMEQ, hvoretter mengden av interleukinene (IL) -6 , tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), IL-1β og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) som utskilles ble målt ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Monocyttene ble inkubert i 24 timer. Behandlingen med DHMEQ induserer en reduksjon av alle molekyler i begge grupper av kreftpasienter med og uten DVT sammenlignet med ubehandlede celler (P 0,0001), (t-test). Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD. DVT, dyp venetrombose,
Serum avhengig aktivering av NF-kB hos friske monocytter
Som vist i figur 5, inkubasjon av sunne monocytter med sammenslåtte sera, avledet fra kreft pasienter DVT + eller DVT- med de høyeste verdier av cytokiner, induserte en signifikant økning av NF-kB-aktivering sammenlignet med sammenslåtte sera avledet fra friske kontroller med de laveste verdier av de samme cytokiner, (p 0,0001). I tillegg ble en høyere NF-kB-aktivering observert i monocytter stimulert med sera avledet fra cancerpasienter DVT + sammenlignet med den stimuleres av sera avledet fra DVT- (p 0,001) (figur 5). For ytterligere å utelukke muligheten for at noen LPS forurensning kan bidra til NF-kB-aktivering, ble 10 ug /ml av polymiksin B tilsettes i alle cellekulturer for å nøytralisere eventuelle LPS forurensning. I stedet, som positiv kontroll av NF-kB-aktivering, ble LPS vurdert. LPS-stimulerte kulturer induserte en høyere NF-kB aktivitet statistisk signifikant sammenlignet med kreft avledet sera-stimulerte kulturer (p 0,001), mens ingen signifikant forskjell var tydelig mellom LPS-stimulerte kulturer og DVT kreft avledet sera- stimulerte kulturer. I de LPS forsøkene ikke polymiksin B ble tilsatt. NF-kB-aktivering, stimulert med sera avledet fra kreftpasienter med og uten DVT eller LPS, ble delvis blokkert ved DHMEQ (10 ug /ml) når de tilsettes i begge kulturer og LPS-stimulerte kulturer.
Monocytter fra 25 friske kontroller ble evaluert for NF-kB-aktivering etter at de ble dyrket i 20 timer i medium supplementert med enten 40% serum fra tre grupper. Monocytter (5×10
5) fra 25 friske donorer ble dyrket i 20 timer i medium (RPMI 1640) supplert med enten 40% serum avledet fra 64 kreftpasienter DVT + og 257 DVT- med høyest cytokiner plasmanivåer (mer enn 75-percentilen ) eller 40% serum avledet fra 100 friske givere med lavest cytokiner verdier ( 25 persentil). Den inkubasjon av sunne monocytter med sammenslåtte sera avledet fra kreftpasienter DVT + (sCADVT +) eller DVT- (sCADVT-) induserte en signifikant økning av NF-kB aktivitet sammenlignet med det vi friske kontroller (HM) etter behandling med serum fra friske kontroller ( SH) (P 0,0001). En høyere NF-kB p65 subenheten aktivering ble observert i monocytter stimulert med sera fra cancerpasienter DVT + i forhold til den stimuleres av sera avledet fra DVT- (P 0,001) (t-test). Ingen NF-kB p65 subenheten aktivering ble observert i monocytter stimulert med sera avledet fra friske kontroller.
Serum avhengig aktivering av cytokiner produksjon hos friske monocytter
I tillegg til NF-kB aktivitet, utforsket vi aktivering av cytokiner hos friske monocytter behandlet med sammenslåtte sera hentet fra kreftpasienter DVT + og DVT- og fra friske kontrollpersoner. Høyere midlere nivåer av IL-6, TNF-a, IL-1, VEGF, MMP-9 og TF ble utskilt fra friske monocytter som ble behandlet med sera avledet fra kreftpasienter DVT sammenlignet med de fra DVT- (p 0,01). Tvert imot friske monocytter ble behandlet med sera fra friske kontroller viste ingen signifikante effekter (tabell 5). Når friske monocytter ble inkubert med sera avledet fra pasienter med og uten DVT i nærvær av DHMEQ, den cytokiner produksjon sterkt redusert sammenlignet med ubehandlede celler (p 0,0001). (Tabell 6)
HM, Monocytter fra friske personer; SH, sera fra friske personer LPS, lipopolysakkarid; sCaDVT-, serum fra kreftpasienter uten dyp venetrombose; sCADVT +, serum fra kreftpasienter med dyp venetrombose; IL-6, interleukin-6; TNF-α, Tumor necrosis factor alpha; IL-1β, Interleukin-1 beta; VEGF, vaskulær endotelial vekstfaktor; MMP-9, matriks-metalloproteinase-9; TF, vevsfaktor. Alle p-verdiene ble beregnet ved Wilcoxon matchede-Pairs Signed-Ranks Test
HM, monocytter fra friske personer.; SH, sera fra friske personer LPS, lipopolysakkarid; sCaDVT-, serum fra kreftpasienter uten dyp venetrombose; sCADVT +, serum fra kreftpasienter med dyp venetrombose; IL-6, interleukin-6; TNF-α, Tumor necrosis factor alpha; IL-1β, Interleukin-1 beta; VEGF, vaskulær endotelial vekstfaktor; MMP-9, matriks-metalloproteinase-9; TF, vevsfaktor. Alle p-verdiene ble beregnet ved Wilcoxon matchede-Pairs Signed-Ranks Test.
Kontroll eksperimenter utført med LPS, indikerte at en bemerkelsesverdig betydelig forbedring av alle markører produksjon, sammenlignet med dem stimulert med sera avledet fra kreftpasienter DVT- (p 0,0001). Som forventet ble det ingen signifikante forskjeller observert i produksjonen av alle merkene mellom gruppe friske monocytter behandlet med LPS og som behandles med sera avledet fra kreftpasienter DVT + (S2 Table).
Diskusjoner
Pasienter med kreft kan oppleve komplikasjoner inkludert trombose, blødning, og disseminert intravaskulær koagulasjon. Identifisering av nye terapeutiske mål i kreftpasienter med høy risiko for DVT kan oppmuntre ytterligere beskyttende studier for å forbedre forvaltningen av disse pasientene. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som analyserer flere NF-kB-avhengige markører hos kreftpasienter med og uten DVT.
I tillegg ble protein sekresjon også testet, for å finne ut om endringene i cytokin plasmanivået var assosiert med endringer i cytokiner produksjon. Som forventet, var plasmanivået av markørene analysert oppregulert i kreftpasienter med og uten DVT sammenlignet med friske kontroller, selv om de var statistisk høyere i DVT +, med unntak av fibrinogen som var lik i begge grupper. Cytokinene målt i våre eksperimenter er hovedsakelig involvert i oppregulering av inflammatoriske reaksjoner og således i en rekke kreftformer. Når vi har undersøkt proteinets sekresjon, ble det samme plasma tendens også observert hos monocytter hos pasienter.
