Abstract
Wnt /β-catenin signalveien er viktig for tumor initiering og progresjon. Den lave tetthet lipoprotein-reseptor-relatert protein-6 (LRP6) er en viktig Wnt ko-reseptor for Wnt /β-catenin signalering og representerer en lovende anticancer mål. Nylig ble antihelminthic stoffet, niclosamide funnet å hemme Wnt /β-catenin signalering, selv om mekanismen ikke er godt definert. Vi fant ut at niclosamide var i stand til å undertrykke LRP6 uttrykk og fosforylering, blokkere Wnt3A-indusert β-catenin akkumulering, og hemme Wnt /β-catenin signal i HEK293 celler. Videre ble de inhiberende virkninger av niclosamide på LRP6 ekspresjon /fosforylering og Wnt /β-catenin signaledannet i human prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D kreftceller. Videre viste vi at den mekanismen som niclosamide trykkes LRP6 resultat av økt nedbrytning som tydelig ved en kortere halveringstid. Til slutt, vi demonstrert at niclosamide var i stand til å fremkalle kreft celle apoptose, og vises utmerket anticancer aktivitet med IC
50-verdier mindre enn 1 mikrometer for prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D kreftceller . IC
50 verdiene er sammenlignbare med de som er vist å undertrykke aktiviteter Wnt /β-catenin signalisering i prostata og brystkreft celler. Våre data indikerer at niclosamide er en unik lite molekyl Wnt /β-catenin signale inhibitor målretting Wnt ko-reseptor LRP6 på celleoverflaten, og at niclosamide har et potensial til å bli utviklet en ny Kjemopreventivt eller terapeutisk middel for human prostata og brystcancer .
Citation: Lu W, Lin C, Roberts MJ, Waud WR, Piazza GA, Li Y (2011) Niclosamide undertrykker kreft celle vekst ved å fremkalle Wnt Co-Receptor LRP6 Nedbrytning og Hemme Wnt /β-catenin pathway. PLoS ONE 6 (12): e29290. doi: 10,1371 /journal.pone.0029290
Redaktør: Lin Mei, Medical College of Georgia, USA
mottatt: 01.09.2011; Godkjent: 24 november 2011; Publisert: 16.12.2011
Copyright: © 2011 Lu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra National Institutes of Health (RO1CA124531, til YL). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Wnt /β-catenin signal spiller en viktig rolle i fosterutviklingen og kan føre til svulstdannelse når abnormt aktivert. Et kjennetegn på Wnt /β-catenin signaliserer aktiveringen er stabilisering av cytosoliske β-catenin, som går inn i kjernen for å aktivere Wnt målgener ved å binde transkripsjonsfaktorer av T-celle faktor /lymfoid fremmende faktor (TCF /LSF) familie [ ,,,0],1], [2]. I fravær av wnt ligander, blir β-catenin nivåene effektivt reguleres ved en supra kompleks som inneholder adenomatøs polypose coli (APC), Axin, og glykogen-syntetase kinase 3β (GSK3p). Dette komplekset fremmer fosforylering av β-catenin av kasein kinase 1 (CK1) og GSK3p. Fosforylert β-catenin blir multi-ubiquitinmolekyler (Ub) og degradert av 26S proteasomet. Virkningen av dette komplekset er hemmet ved binding av Wnt til sine reseptorer på celleoverflaten [1], [2]. En rekke Wnt /β-catenin målgener er blitt identifisert, inkludert de som regulerer celleproliferasjon og apoptose, således mediere kreft initiering og progresjon [3] – [5]. Overbevisende bevis har vist at det er en unormal oppregulering av denne veien i tumorigenesis av mange typer kreft, og at avbrudd av Wnt /β-catenin signal representerer en stor mulighet til å utvikle nye legemidler mot kreft chemoprevention og terapi [6] – [8].
Eksperimenter utført i Drosophila [9], [10] Xenopus og mus [11] har vist at den low-density lipoprotein-reseptor-relatert protein 5 (LRP5) /LRP6 (betegnet pil i Drosophila) virker som et co-reseptor for wnt ligander som vekselvirker både med syv transmembrane reseptor ifølge frizzled (Fz) familie og LRP5 /6 for å aktivere den kanoniske wnt signalveien. De cytoplasmatiske haler av LRP5 /6, ved reseptor aktivering av Wnt ligand, er fosforylert, og rekruttere cytosoliske scaffoldprotein Axin til membranen. LRP6 er uttrykt i humane kreftcellelinjer og oppregulert på humane ondartede vev [12] – [16]. Studier de siste årene har vist at LRP6 er et lovende terapeutisk mål for utvikling av nye kreftmedisiner [6] -. [8], [15], [17], [18]
Niclosamide (handel navnet Niclocide) er en teniacide i antihelmintic familien som er spesielt effektiv mot cestoder, som infiserer mennesker. Niclosamide har blitt godkjent av FDA for slike indikasjoner, og har vært brukt i mennesker i nesten 50 år [19] – [21]. Det antas at niclosamide hindrer oksidativ fosforylering i mitokondriene av cestoder; en aerob metabolisme, som mange cestoder er avhengig. Nylig er det blitt demonstrert at niclosamide kan nedregulere cytosoliske β-catenin uttrykk for å inhibere Wnt /β-catenin signalering [22], [23], og undertrykke tykktarmskreft vekst og metastase [23], [24]. Siden mekanismen ikke er godt definert, vi videre studert dette. Vi demonstrerte for første gang at niclosamide kan hemme Wnt /β-catenin signal ved å fremkalle LRP6 degradering, og at denne aktiviteten er nært knyttet til sin antiproliferative og apoptose induserende aktivitet.
Resultater
Niclosamide blokkene Wnt /β-catenin signalering indusert ved Wnt3A og LRP6 ved å undertrykke LRP6 ekspresjon i HEK293-celler
kompleksdannet cytosoliske β-catenin (fri β-catenin) er den aktive formen av β-catenin som blir translokert til cellen kjernen for å aktivere transkripsjonsfaktorene av TCF /LEF familien, som fører til transkripsjon av wnt målgener. For å bestemme om niclosamide kan hemme Wnt /β-catenin signalering, ble HEK293-celler behandlet for med Wnt3A kondisjonert medium (CM) i nærvær av niclosamide eller bærer (DMSO). Nivåene av cytosoliske gratis β-catenin og total cellular β-catenin ble deretter undersøkt ved Western blotting. Som vist i figur 1A, niclosamide var i stand til å blokkere Wnt3A-indusert cytosol-fri β-catenin og totalt cellulært β-catenin akkumulering i HEK293-celler i konsentrasjoner så lave som 0,6 uM (figur 1A).
(A) HEK293-celler i 6-brønners plater ble behandlet med Wnt3A CM (20%) og niclosamide ved indikerte konsentrasjoner i 24 timer. Nivåene av cytosoliske gratis β-catenin, total cellular β-catenin, LRP6 og fosfor-LRP6 (p-LRP6) ble undersøkt. Alle prøvene ble også probet med anti-actin-antistoff for å bekrefte lik belastning. (B) HEK293-celler i 24-brønners plater ble transient transfektert med plasmid LRP6 eller den tilsvarende kontrollvektor, sammen med TOPFlash konstruere og β-galaktosidase-uttrykkende vektor i hver brønn. Etter å ha blitt inkubert i 24 timer, ble cellene behandlet med niclosamide eller niclosamide pluss Wnt3A CM ved indikerte konsentrasjoner i 24 timer. Luciferaseaktiviteten ble deretter målt 24 timer senere med normalisering av aktiviteten av β-galaktosidase. Verdier er gjennomsnitt av tre bestemmelser med standardavvik angitt med feilfelt. ** P 0,01 sammenlignet med kontrollceller uten niclosamide behandling
LRP6 er en viktig Wnt co-reseptor for Wnt /β-catenin signalveien, og LRP6 fosforylering er kritisk for Wnt /β. -catenin signale aktivering indusert av wnt proteiner [25] – [28]. For å utforske den molekylære mekanismen bak Wnt /β-catenin signal hemming av niclosamide, undersøkte vi LRP6 uttrykk og fosforylering etter niclosamide behandling. Som vist i figur 1A, behandling av Wnt3A CM markert induserte endogent LRP6 fosforylering i HEK293-celler, som ble opphevet ved behandling niclosamide. Viktigere, fant vi også at det totale cellenivå av endogen LRP6 ble sterkt redusert etter niclosamide behandling i HEK293 celler (figur 1A).
For å bekrefte den hemmende effekten av niclosamide på LRP6 uttrykk og fosforylering, utførte vi en Wnt /β-catenin signale reporter analyse for å teste om niclosamide er i stand til å hemme Wnt /β-catenin signal aktivering av LRP6 og Wnt3A. HEK293 celler ble transient transfektert med LRP6 sammen med Wnt /β-catenin signal reporter TOPFlash, og behandlet med Wnt3A CM og niclosamide. Som vist i figur 1B, LRP6 uttrykk økte TOPFlash aktivitet i HEK293-celler, noe som ble ytterligere forsterket når cellene ble transfektert med LRP6 og behandlet med Wnt3A CM (figur 1B). Videre ble økt TOPFlash aktivitet indusert av LRP6 eller LRP6 pluss Wnt3A CM blokkert av niclosamide (figur 1B).
Niclosamide undertrykker LRP6 Expression og Fosforylering og blokker Wnt /β-catenin signale i prostata og brystkreft celler
for å finne ut om niclosamide kan blokkere Wnt /β-catenin signalisering i kreftceller, undersøkte vi nivået av cytosoliske gratis β-catenin etter niclosamide behandling. Vi fant ut at cytosoliske gratis β-catenin nivåer i menneskelig prostata PC-3 og bryst MDA-MB-231 kreftceller ble betydelig redusert etter niclosamide behandling (figur 2A). Videre, når PC-3 og MDA-MB-231 celler ble transient transfektert med Wnt /β-catenin signal reporter TOPFlash, fant vi at niclosamide behandling sterkt redusert TOPFlash aktivitet i PC-3 og MDA-MB-231 celler ( fig. 2B).
(A) Prostatakreft PC-3 og brystkreft MDA-MB-231 celler i 6-brønners plater ble behandlet med niclosamide ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. Nivåene av cytosoliske fri β-catenin ble deretter undersøkt ved hjelp av GST-E-cadherin bindingsanalysen. (B) Prostatakreft PC-3 og brystkreft MDA-MB-231 celler i 24-brønners plater ble transient transfektert med luciferase TOPFlash konstruksjonen og β-galaktosidase-uttrykkende vektor i hver brønn. Etter 24 timers inkubering ble cellene behandlet med 2,4 uM niclosamide. Luciferaseaktiviteten ble deretter målt 24 timer senere med normalisering av aktiviteten av β-galaktosidase. Verdiene er gjennomsnittet av trippel bestemmelser med S.D. angitt med feilfelt. ** P . 0,01 sammenlignet med kontrollcellene
Det er vel anerkjent at axin2 er en spesifikk transkripsjonen målet for Wnt /β-catenin signalveien, og at ekspresjonsnivået av axin2 er underskrift av aktivering av Wnt /β-catenin signal [29] – [32]. Cyclin D1 er en transkripsjonen mål av Wnt /β-catenin signalering, og er kritisk for kreftcelleformering [33], [34]. For å bestemme den hemmende effekten av niclosamide på Wnt /β-catenin signalisering i humane kreftceller, undersøkte vi axin2 og cyclin D1 uttrykk i menneskelig prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D kreftceller. Som vist i figur 3, niclosamide undertrykte betydelig axin2 og cyklin D1-ekspresjon i alle fire kreftcellelinjer.
(A) DU145 og PC3 prostata kreft celler og MDA-MB-231 og T-47D brystcancerceller i 6-brønns plater ble behandlet med niclosamide ved indikerte konsentrasjoner i 24 timer. De totale cellulære nivåer av LRP6, p-LRP6, Dvl2, Axin2 og Cyclin D1were deretter undersøkt. Alle prøvene ble også probet med anti-actin-antistoff for å bekrefte lik belastning. (B) PC-3 og DU145 prostata kreft celler og MDA-MB-231 og T-47D brystcancerceller i 6-brønners plater ble behandlet med niclosamide ved angitte konsentrasjoner i 24 timer. De cytosoliske nivåer av Dvl2 ble deretter undersøkt. Alle prøvene ble også analysert med anti-aktin antistoff for å bekrefte lik belastning.
For å finne ut om den hemmende effekten av niclosamide på Wnt /β-catenin signal er relatert til LRP6 uttrykk, vi undersøkte LRP6 uttrykk og fosforylering etter niclosamide behandling. Som vist i figur 3A, niclosamide var i stand til å undertrykke LRP6 ekspresjon og fosforylering i alle fire kreftcellelinjer, noe som indikerer at niclosamide kan undertrykke Wnt /β-catenin signalisering i bryst og prostata cancerceller ved å undertrykke LRP6 ekspresjon.
niclosamide Induserer LRP6 Nedbrytning
for å definere den molekylære mekanismen bak effekten av niclosamide på LRP6 protein nivå, studerte vi LRP6 omsetning. PC-3-celler ble behandlet med niclosamide på 1,2 pM for 0, 3, 6, 10 og 24 timer i nærvær av cykloheksimid, en proteinsynteseinhibitor. Som vist i figur 4, i fravær av niclosamide behandling ble LRP6 degradert med en halveringstid på omkring 6,9 timer. Behandling med niclosamide betydelig forbedret LRP6 omsetning med en halveringstid på omkring 2,3 timer (Figur 4A). Denne forkorting av LRP6 halveringstid antyder at niclosamide kan stimulere LRP6 degradering. For å teste om niclosamide regulerer LRP6 uttrykk ved transkripsjon nivå også, vi undersøkte LRP6 mRNA nivåer ved real-time RT-PCR. Som vist i figur 4B, ble LRP6 mRNA-nivåene ikke signifikant endret etter niclosamide behandling i PC-3 og MDA-MB-231-celler. Derfor er niclosamide-indusert undertrykkelse LRP6 hovedsakelig på grunn av den forbedrede LRP6 degradering.
(A) PC-3-celler ble inkubert med 10 ug /ml cykloheksimid i nærvær av Niclosamide (1,2 pM) eller bærer for 0, 3, 6, 10 eller 24 timer. Cellene ble deretter høstet, og nivået av endogent LRP6 ble undersøkt ved Western blotting. Prøvene ble også probet med anti-actin-antistoff for å bekrefte lik belastning. Pikslene for hvert band ble målt, normalisert og plottet. Data er gjennomsnittsverdier for tre uavhengige eksperimenter med SD-verdier som er angitt av feilfelt. * P 0,05, ** P 0,01 kontra tilsvarende kontrollverdi. (B) PC-3 og MDA-MB-231 celler i 6-brønners plater ble behandlet med niclosamide i 24 timer. Cellene ble deretter høstet og LRP6 mRNA-nivåer ble bestemt ved sanntids RT-PCR og normalisert til meldings nivåer av GAPDH mRNA. Alle verdier er gjennomsnittet av tredoble bestemmelser med S.D. angitt med feilfelt.
Niclosamide har ingen effekt på Dishevelled-2 (Dvl2) Expression i prostata og brystkreft celler
Det har blitt rapportert at niclosamide nedregulerer komponenter av Wnt veien , spesielt cytosolisk Dvl2 uttrykk, noe som resulterer i redusert nedstrøms Wnt /β-catenin signalisering i kolorektal kreft [23]. For å teste om Dvl2 er også involvert i niclosamide-indusert Wnt /β-catenin signal hemming i prostata og bryst kreft celler, vi undersøkte både totale cellulære og cytosoliske nivåer av Dvl2 uttrykk. Uventet, fant vi at niclosamide hadde ingen effekt på både totalt cellulært og cytosolic Dvl2 uttrykk i menneskelig prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D kreftceller (figur 3), mens LRP6 uttrykk ble sterkt undertrykt på den samme behandling (figur 3A). Disse resultatene indikerer at LRP6 nedregulering er nøkkelen mekanisme som ligger til grunn niclosamide-indusert Wnt /β-catenin signale inhibering i human prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D kreftceller.
Niclosamide induserer prostata og brystkreft Cell apoptose og hemmer kreftcelle spredning
Wnt /β-catenin veien er viktig for kreftcelle apoptose [35], [36]. Etter å ha fastslått at niclosamide er en potent hemmer av Wnt /β-catenin signalisering i prostata og bryst kreft celler, vi deretter testet om niclosamide er i stand til å indusere apoptose. Som vist i figur 5A, for å eksponering niclosamide ved 1,2 og 2,4 pM i 24 timer vesentlig indusert apoptotisk DNA-fragmentering i prostata PC-3 og DU145 og bryst MDA-MB-231 og T-47D kreftceller.
( A) Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP ble behandlet med niclosamide ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. Flytende og festede celler ble kombinert for apoptose påvisning av celledød ELISA-sett fra Roche Diagnostics Corporation for histon-assosiert DNA-fragmenter som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) Kreftceller i 96-brønners plater ble behandlet med niclosamide i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av Cell Titer Glo Assay system. Alle verdier er gjennomsnittet av målinger in triplo med S.D. angitt med feilfelt. ** P. 0,01 kontra tilsvarende kontrollverdi
Gitt at niclosamide kan blokkere Wnt /β-catenin signalisering i kreftceller og kan indusere apoptose, vi undersøkte neste effekten av niclosamide på kreftcelle spredning. Som vist i figur 5B, niclosamide hemmet cancer celleproliferasjon med IC
50-verdier mindre enn 1 um for alle fire testede cellelinjer. IC
50 verdiene er sammenlignbare med de som er vist å undertrykke aktiviteter Wnt /β-catenin signalisering i prostata og brystkreft celler.
Diskusjoner
bevisende bevis indikerer at det er en unormale oppregulering av Wnt /β-catenin bane i tumorgenese av mange typer kreft. Mens genetiske mutasjoner av visse komponenter av Wnt /β-catenin veien, for eksempel
APC Hotell og
CTNNB1
, er betydelige medvirkende faktorer for kolorektal kreft, de er vanligvis ikke den dominerende mekanismen forbundet med mange andre typer kreft som brystkreft og prostatakreft. Isteden viser det seg at dysregulering av Wnt /β-catenin signalering på celleoverflaten som fører til avvikende aktivering av denne reaksjonsvei i disse typer kreft [3] – [5], [37]. Derfor er rettet mot hemming av Wnt /β-catenin signalering på celleoverflaten en rasjonell og lovende ny metode for behandling av kreft.
Wnt /β-catenin signalisering spiller en viktig rolle i utvikling av brystkjertelen og carcinogenese [ ,,,0],4]. Trippel negativ brystkreft (TNBC, ER, PR, og HER2-negative brystkreft) er en av de vanskeligste subtyper av brystkreft å behandle på grunn av mangel på en målrettet terapi. Studier har vist at Wnt /β-catenin signale aktivering er fortrinnsvis finnes i TNBC og er assosiert med en dårlig klinisk resultat [38]. Basale-lignende brystkreft (BLBC) deler mange overlappende funksjoner med BLBC. Flere studier har vist at LRP6 er oppregulert på humane TNBC eller BLBC [14] – [16]. Hos mus, ble brystkjertel utvikling og MMTV-Wnt1-indusert bryst tumorigenesis forsinket i LRP6
+/- mus [14], mens MMTV-LRP6 transgene mus utviklet hyperplasia i sine melkekjertler på grunn av LRP6-mediert Wnt /β- catenin signalering [39]. Transcriptional knockdown av LRP6 i TNBC MDA-MB-231 celler betydelig redusert Wnt /β-catenin signalering, celleproliferasjon, og tumorvekst
in vivo product: [15]. I tillegg har det blitt demonstrert at spesifikke LRP6 antistoffer var i stand til å blokkere MMTV-Wnt1 eller MMTV-Wnt3 xenotransplantater
in vivo product: [17], [18], og at rekombinant Mesd protein, en LRP6 antagonist, markert undertrykket tumorvekst i MMTV-Wnt1 xenograft-modeller [15]. Videre salinomycin, en brystkreft stamcelle drapsmann [40], ble nylig vist å være en hemmer av Wnt /β-catenin signal ved å fremkalle LRP6 degradering [41]. I denne studien, viste vi at niclosamide trykt LRP6 uttrykk i TNBC MDA-MB-231 celler og ER-positiv brystkreft T-47D-celler, og hemmet brystkreft celleproliferasjon med IC
50-verdier mindre enn 1 mikrometer. Våre resultater støtter ideen om at LRP6 er et lovende terapeutisk mål for brystkreft blant TNBC.
Akkumulert bevis har vist en betydelig rolle for Wnt /β-catenin signal i utvikling og progresjon av menneskelig prostatakreft [3] . Selv om det er uklart om LRP6 er oppregulert i prostatakreft, har vi nylig vist at LRP6 antagonist Mesd markert hemmet Wnt /β-catenin signalisering i prostatakreft PC-3 celler, og undertrykt PC-tre celleproliferasjon
i vitro Hotell og tumorvekst
in vivo product: [42], [43]. I denne studien fant vi niclosamide hemmet spredning av prostatakreft PC-3 og DU145 cellene med IC
50-verdier mindre enn 1 mikrometer, noe som kan sammenlignes med de som er vist å undertrykke LRP6 uttrykk og aktiviteter av Wnt /β- catenin signal i prostatakreftceller. Sammen utgjør disse funnene tyder på at LRP6 er en potensiell terapeutisk mål for prostatakreft.
Mutasjoner i
APC Hotell og
CTNNB1
er to viktige faktorer for Wnt /β-catenin signal aktivering i kolorektal kreft, men senere studier tyder på at nivåene av Wnt /β-catenin signalisering i kolorektal kreftceller kan bli modulert på celleoverflaten [44] – [48]. Spesielt Ueno
et al.
Vist at Wnt reseptor frizzled-7 aktiverer Wnt /β-catenin banen i kolorektal kreftceller til tross for tilstedeværelsen av
APC
eller
CTNNB1
mutasjon og at frizzled-7-siRNA kan anvendes som et terapeutisk reagens for kolorektal kreft [48]. Shi
et al
. rapportert at siRNA stanse av Wnt-2, som er godt kjent for sin overuttrykk i tykktarmskreft, hemmet Wnt /β-catenin signal og indusert apoptose i menneskelige kolorektal kreft celler som inneholder nedstrøms mutasjoner [47]. Det skilles frizzled relaterte protein (SFRP) familie og Wnt hemmende faktor-1 (WIF-1) er utskilt Wnt /β-catenin signaliserer antagonister som binder seg til Wnt ligander, og forstyrre Wnt-reseptor interaksjon. Det har blitt rapportert at tap av SFRP familie ekspresjon ble forbundet med promoteren hypermethylation i kolorektal cancer [44], og at gjenopprettelse av SFRP funksjon i kolorektal kreftceller dempes Wnt /β-catenin signalering til og med i nærvær av nedstrøms mutasjoner [45]. Tilsvarende Han
et al.
Rapportert at tap av WIF-1 uttrykk var assosiert med arrangøren hypermethylation i tykktarmskreft, og at restaurering av WIF-en funksjon, Wnt-en siRNA, eller et monoklonalt anti-Wnt- 1 antistoff induserer betydelig apoptose i kolorektal kreft celler som inneholder nedstrøms mutasjoner og uttrykker Wnt-1 [46]. Ganske nylig er det blitt rapportert at niclosamide var i stand til å inhibere Wnt /β-catenin signalisering i kolorektale cancerceller, inhiberte kolorektal cancer vekst og S100A4-mediert metastatisk kolorektal kreft [23], [24]. Den kalsiumbindende protein S100A4 er et målgen av Wnt /β-catenin veien [49]. Fremtidige studier er nødvendig for å ta opp betydningen av LRP6 i kolorektal kreftutvikling og progresjon.
Utviklingen av FDA godkjente legemidler som brukes for andre indikasjoner er en attraktiv strategi for å utvikle nye legemidler mot kreft chemoprevention eller terapi gitt sin bevist sikkerhet posten. Forstyrrelse av Wnt /β-catenin signal representerer en stor mulighet til å avgjøre om FDA godkjente legemidler kan ha potensial kreft effekt [6] – [8]. Niclosamide er en salicyclamide derivat og stoffet for behandling av mest bendelorm infeksjon. Niclosamide utøver sin antiparasittiske aktivitet i tarmlumen og blir dårlig absorbert fra mage-tarmkanalen [19] – [21]. Men i mus implantert med menneskelige kolorektal kreft xenografter, oralt administrert niclosamide ble godt tolerert, oppnådde plasma og tumor nivåer assosiert med biologisk aktivitet og førte til tumorkontroll [23]. Videre har niclosamide ingen signifikant toksisitet mot ikke-kreft celler
in vitro Hotell og viser ingen åpenbare bivirkninger i niclosamide-behandlede mus [23]. Vi viser her at niclosamide er en potent Wnt /β-catenin signal inhibitor ved å fremkalle LRP6 degradering i kreftceller, og viser en utmerket anticancer aktivitet
in vitro
. Derfor, som en FDA godkjent antihelminthic narkotika, vil niclosamide være et interessant comoound å være optimalisert for å øke biotilgjengeligheten og å bli testet for sine
in vivo
kreft forebyggende og terapeutiske roller i fremtiden.
Materialer og metoder
Material
Niclosamide ble kjøpt fra Sigma. Polyklonale anti-fosfor-LRP6 (Ser1490) og anti-Dvl2 og monoklonale anti-Axin2 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Monoklonale anti-LRP6 var fra Santa Cruz Biotechnology. Polyklonalt kanin anti-Cyclin D1 ble fra Chemicon International. Monoklonale anti-β-catenin var fra BD Biosciences. Monoklonale anti-aktin var fra Sigma. Peroksidase merket anti-mus antistoff og ECL-systemet ble kjøpt fra Amersham Life Science. Plasmid PCS-Myc-hLRP6 inneholder full-lengde human LRP6 cDNA var fra Dr. Christof Niehrs (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Tyskland). Plasmid glutation S-transferase (GST) -E-cadherin ble vennlig levert av Dr. Gail Johnson (University of Rochester, New York). Den TOPFlash luciferase konstruksjonen var fra Upstate bioteknologi. Den β-galaktosidase-uttrykkende vektor, luciferase-analysesystemet og den β-galaktosidase-assay-system ble innkjøpt fra Promega. Vevskulturmedia, føtalt bovint serum (FBS), og plast-ware ble erholdt fra Life Technologies, Inc. ble proteinase inhibitor cocktail Complete ™ erholdt fra Boehringer Mannheim. Alle cellelinjer ble oppnådd fra ATCC og dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble dyrket i antibiotika-fritt medium for celle proliferasjonsanalyser. Cell Titer Glo analysesystemer var fra Promega. Celledød deteksjon ELISA-kit ble innkjøpt fra Roche Diagnostics Corporation.
Western blotting
Celler i 6-brønners plater ble lysert i 0,5 ml lyseringsbuffer (fosfat-buffret saltvann inneholdende 1% Triton X -100 og 1 mM PMSF) ved 4 ° C i 10 min. Like mengder protein, ble underkastet SDS-PAGE under reduserende betingelser. Etter overføring til Immobilon-P-membran overføring, suksessive inkuberinger med et primært antistoff, og et pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff ble utført i 60-120 min ved romtemperatur. De immunreaktive proteiner ble deretter påvist ved anvendelse av ECL-systemet. Filmer som viser immunreaktive bånd ble skannet av HP ScanJet 5590.
cytosolic gratis β-catenin analyse med GST-E-cadherin bindingsanalysen
GST-E-cadherin bindingsanalysen ble utført nøyaktig som tidligere beskrevet [50]. Ukomplekserte cytosol-fri β-catenin til stede i 100 ug av total cellelysat ble underkastet SDS-PAGE og detektert ved bruk av det monoklonale antistoff til p-catenin.
Sanntids RT-PCR
Total RNA ble isolert fra cellekulturer ved hjelp av RNA-Bee (Tel-Test), og første-tråd cDNA syntese ble utført ved hjelp ProSTARTM Ultro HF RT-PCR Kit (Strategene) primet med oligo (dT) primer i et 20 ul reaksjonsblanding som inneholder en ug total RNA. For analyse av LRP6 mRNA nivåer, ble real-time RT-PCR utført med de spesifikke LRP6 og GAPDH primere kjøpt fra SABioscience /Qiagene. Den LRP6 mRNA-nivået var normalisert til GAPDH-mRNA-nivå.
Analysisof cytosoliske Dvl2 uttrykk
cytosoliske Dvl2 ekspresjon ble undersøkt med metoden som er beskrevet for andre steder [23]. I korthet ble cellene lysert med hypoton lyseringsbuffer (bestående av 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 og 0,2 mM MgCl2, supplementert med proteasehemmere, inkubert på is i 10 min, og homogenisert ved hjelp av en tettsittende glass Dounce. Sukrose og EDTA ble tilsatt til sluttkonsentrasjoner på 0,25 M og 1 mM, ble respektivt. Lysatene ble deretter sentrifugert ved 20 000 x g i 1 time ved 4 ° C. Supernatanten som representerer cytosoliske cellefraksjon ble deretter fortynnet i SDS-prøvebuffer, og Dvl2 ekspresjon ble deretter undersøkt ved hjelp av Western blotting.
luciferase reporter-analyse
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP ble sådd ut i 24-brønners plater. Etter dyrking over natten ble cellene ble transient transfektert med 0,1 ug av den TOPFlash luciferase-konstruksjonen (Upstate Biotechnology) og 0,1 ug av β-galaktosidase-uttrykkende vektor (Promega, Madison, WI). Etter 24 timers inkubering ble cellene behandlet med niclosamide. cellene ble deretter lysert 24 timer senere og begge luciferase og β-galaktosidase-aktivitet ble bestemt. luciferaseaktiviteten ble normalisert til β-galaktosidase aktivitet.
apoptose evaluering
Apoptose ble vurdert med celledød deteksjon ELISA kit kjøpt fra Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis. Denne analysen påviser oligonucleosomes ut etter forsiktig lysering av cellen. Celler ble dyrket i T25-kolber for den ønskede varighet. Det brukte medium som inneholder flytende celler ble reddet og holdt på is. De adherente celler ble samlet opp ved mild trypsinisering og ble kombinert med flytere for pelletering ved sentrifugering. Etter forsiktig lysis av cellene med bufferen er forsynt med deteksjonssett ble cellelysatet anvendt for ELISA-test. Resultatene ble normalisert ved proteininnhold oppnådd fra parallelle kolber med cellene blir lysert ved bruk av buffer som beskrevet ovenfor for Western blotting.
celleproliferasjonsanalyse
Celler ble sådd ut i 96-brønn vev kultur behandlet mikrotiterplater ved en tetthet på 5000 celler /brønn i et totalvolum på 50 ul. Etter inkubering over natten, ble cellene behandlet med niclosamide i 72 timer ved tilsetning av 50 ul av 2X forrådsoppløsninger til egnede brønner som allerede inneholder 50 ul celler og medium for å eksponere cellene til de endelige konsentrasjoner av niclosamide nødvendig. Celleviabilitet ble målt ved hjelp av Cell Titer Glo Assay (Promega).
statistikker
statistiske analysene ble utført ved hjelp av Student uparet t-test. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Forskjeller på P. 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Takk
Vi takker Meredith S. Plaxco og Tommie A. Gamble for å kjøre celleproliferasjonsprosesser analyser og Dr. Gail Johnson (University of Rochester) for gi GST-E cadherin cDNA.
