Abstract
Målet
Utvikling av robuste prognostiske og /eller prediktive biomarkører hos pasienter med tykktarmskreft (CRC) er avgjørende for å fremme behandlingsstrategier for denne sykdommen. Vi forsøkte å finne ut om uttrykk status av visse miRNAs kan ha prognostisk /prediktiv verdi i CRC pasienter som behandles med konvensjonelle cytotoksiske chemotherapies.
Metoder
Vi studerte en kohort av 273 CRC prøver fra stadium II /pasienter III behandlet med 5-fluorouracil-basert adjuvant kjemoterapi og stadium IV pasienter utsatt for 5-fluorouracil og oksaliplatin kjemoterapi. I en screening sett (n = 44), ble 13 av 21 kandidat mirnas hell kvantifisert ved multipleks kvantitativ RT-PCR. I valideringssettet bestående av hele pasienten kohorten ble MIR-148a uttrykk status vurderes av kvantitativ RT-PCR, og dens promoter metylering ble kvantifisert ved bisulfit pyrosekvensering. Til slutt, analyserte vi assosiasjoner mellom MIR-148a uttrykk og pasient overlevelse.
Resultater
Blant søker mirnas studert, MIR-148a uttrykk var mest signifikant nedregulert i avanserte CRC vev. I fase III og IV CRC, var lav MIR-148a uttrykk forbundet med betydelig kortere sykdomsfri overlevelse (DFS), en dårligere terapeutisk respons, og dårlig total overlevelse (OS). Videre MIR-148a metylering status korrelert omvendt med sitt uttrykk, og var assosiert med dårligere overlevelse i stadium IV CRC. I multivariat analyse, MIR-148a uttrykk var en uavhengig prognostisk /prediktiv biomarkør for avanserte CRC pasienter (DFS i stadium III, lav kontra høy uttrykk, HR 2,11; OS i stadium IV, HR 1,93)
Diskusjon.
MiR-148a status har en prognostisk /prediktiv verdi i avanserte CRC pasienter behandlet med konvensjonell kjemoterapi, som har viktige kliniske implikasjoner i bedre terapeutiske strategier og tilpasset forvaltning av denne malignitet
Citation. Takahashi M, Cuatrecasas M, Balaguer F, Hur K, Toiyama Y, Castells A, et al. (2012) Den kliniske betydningen av MiR-148a som en prediktiv Biomarker hos pasienter med avansert tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (10): e46684. doi: 10,1371 /journal.pone.0046684
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 18 juni 2012; Akseptert: 3. september 2012; Publisert: 03.10.2012
Copyright: © Takahashi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den nåværende arbeidet ble støttet med tilskudd R01 CA72851 og CA129286 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, med midler fra Baylor Research Institute (CRB og AG), og med tilskudd fra Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2010-19273), Agência de GESTIO d’Ajuts Universitaris i de Recerca (2009 SGR 849, AC), og Fundación Mutua Madrileña (AP7901-2010, MC), XBTC, BT, Biobanc. MT ble delvis støttet av en bevilgning fra Cell Science Research Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
for tiden er kolorektal kreft (CRC) pasienter med lymfeknutemetastaser (TNM stadium III) behandles med hjelpekjemoterapi som inkluderer cytotoksiske medikamenter slik som 5-fluoruracil (5-FU) og oksaliplatin, etter kirurgisk reseksjon av kreft. Tilsvarende er pasienter med fjern metastatisk CRC (stadium IV) behandles med ulike kombinasjoner av cellegifter og molekylært målrettede legemidler som inneholder anti-VEGF og anti-EGFR antistoffer. Selv om disse behandlingsregimer har forbedret utfall hos pasienter med avansert CRC, en betydelig andel av individer ikke klarer å utlede noen nytte av slik behandling, og noe erfaring verre utfall som følge av narkotikarelatert toksisitet. Det er et viktig behov for å utvikle prediktive biomarkører som kan velge den gruppen av pasienter som vil ha nytte av konvensjonelle cellegifter, slik at pasienter som ikke vil dra nytte av behandlingen kan bli spart fra legemiddeltoksisitet og tilbudt alternative behandlinger.
Mutasjoner i
KRAS
er de eneste etablerte prediktive markører for å velge behandlingsstrategier i CRC. Pasienter med svulster mutasjoner i kodon 12 eller 13 av
KRAS
genet ikke dra nytte av anti-EGFR-baserte legemiddelbehandling [1], [2], og dermed screening for denne mutasjonen er anbefalt for alle stadium IV pasienter som er kandidater for anti-EGFR-antistoff-basert medikamentell behandling. I tillegg har mikrosatelitt ustabile (MSI), en fenotype til stede i ~15% av CRC, har vært vist å assosiere med forbedret total overlevelse (OS), uavhengig av adjuvant kjemoterapi, så vel som en manglende fordel fra 5-FU-kjemoterapi i trinn II pasienter [3], [4]. Men om MSI har prediktiv verdi i stadium III pasienter behandlet med kjemoterapi fortsatt usikkert [5], [6]. Selv om noen studier har antydet at andre molekylære markører, slik som CpG øy methylator fenotype eller ekspresjon status av gener involvert i DNA-reparasjon eller legemiddelmetabolisme (for eksempel
ERCC1
og
TYMS
) kan ha potensial som prognostiske /prediktive markører, det er for lite konsistente data som støtter nytten av disse markørene [7] – [11]. Tatt sammen, til tross for fremskritt gjort i genomisk og epigenomic karakterisering av CRC, det er ingen
etablert
biomarkører som kan sikkert forutsi terapeutiske resultater fra konvensjonell cytotoksisk kjemoterapi hos pasienter med stadium III eller IV CRC.
feilregulering av mikroRNA (miRNA) uttrykk er innblandet i tidlig tumorigenesis samt sykdomsutvikling i ulike maligniteter [12], [13]. mirnas utøve deres onkogene og /eller tumorundertrykkende effekter ved binding til de 3′-utranslaterte regioner av mRNA, som fører til undertrykkelse av translasjon eller forsterket degradering av den tilsvarende melding. I CRC, feilregulert uttrykk for flere miRNAs, inkludert MIR-17~92, MIR-21, MIR-31, MIR-34b /c, MIR-143, MIR-145, og MIR-203 har tidligere blitt rapportert [14] – [17]. Siden mirnas spille en sentral rolle i menneskelig carcinogenesen, er det økende interesse for identifisering av prognostiske eller prediktive mirnas hos pasienter med CRC.
Men har bare en håndfull av rapporter undersøkt muligheten av miRNA (e) som prognostiske /prediktive biomarkører i CRC. I en banebrytende studie, SCHETTER
et al.
Vist at Mir-21 kan være en lovende prognostisk /prediktiv markør i stadium II /III CRC behandlet med 5-FU-basert kjemoterapi [17]. Tilsvarende har en annen gruppe vist at scenen II pasienter med forhøyet uttrykk av MIR-320 eller MIR-498 hadde bedre tilbakefall-fri overlevelse [18]. Men utvalgsstørrelsene analysert i disse studiene var relativt små, har resultatene ikke validert i andre studier, og det har ikke vært noe forsøk på å fastslå den prediktive nytten av noen miRNA i stadium IV CRC. Vi antok at uttrykket profiler av spesifikk miRNA (e) kan ha prognostisk og /eller prediktiv verdi hos pasienter med stadium IV CRC så vel som de med tidligere stadier. Heri, i en innledende screening skritt som er involvert analyse av 21candidate miRNAs, oppdaget vi at Mir-148a er ofte nedregulert i avansert CRC. Deretter ved å analysere et stort validering kohort av 273 CRC, vi gir romanen bevis for at MIR-148a er ofte nedregulert i denne sykdommen, og dette i hovedsak skjer gjennom hypermethylation av sin antatte promoter regionen. I tillegg viser vi at lav MIR-148a uttrykk er signifikant assosiert med et ugunstig utfall hos pasienter med stadium III CRC behandlet med 5-FU-basert kjemoterapi og med et dårligere behandlingsrespons og overlevelse hos pasienter med stadium IV CRC behandlet med 5- FU og oxaliplatin.
Pasienter og metoder
Etikk erklæringen
studiet ble godkjent av Institutional Review Boards (IRB) fra Hospital Clinic, Barcelona, Spania, og en skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
pasienter
formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev fra en kohort av 273 pasienter med CRC (primære svulster fra 76 trinn II, 125 stadium III og 72 stadium IV CRC) og 20 vevsprøver fra normal tarmslimhinnen av friske personer ble hentet fra patologi Department of the Hospital Clinic, Barcelona, Spania. Pasientene inkludert i denne studien ble registrert mellom 1996 og 2008. Alle stadium II og III pasienter ble behandlet med 5-FU-basert adjuvant kjemoterapi for 6 måneder etter tumor reseksjon, og alle stadium IV pasienter ble behandlet med 5-FU og oxaliplatin før behandlingen mislyktes. De Stage II og III pasienter ble fulgt opp hver tredje måned for de to første årene, og hvert halvår for de påfølgende tre årene. Både lokoregionalt tilbakefall og /eller fjernmetastaser ble definert som tumor tilbakefall, mens metachronous colorectal lesjoner ikke ble ansett som gjentakelse. Median oppfølging klokkeslett er 52,2 måneder (variasjon; 2.9-173 måneder) i stadium II og III pasienter og 19,1 måneder (range; 3.7-83.7 måneder) i stadium IV pasienter. Blant stadium II og III pasienter, 70 pasienter (35%) hadde svulst tilbakefall (median, 17,8 måneder, range: 5.5-144 måneder), og median DFS av ikke-tilbakefall pasientene var 40,5 måneder (range; 7.5-155 måneder) . Oppfølging av pasienter ble ferdig i november 2009. kjemoterapeutiske respons i stadium IV pasienter ble evaluert i henhold til de Response evalueringskriterier i solide svulster (RECIST) retningslinjer [19] hver måned. MSI status av tumorer ble bestemt ved å analysere fem mononukleotid markører (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21 og NR-24; MSI Analysis System, Promega, Madison, Wisconsin, USA). De clinicopathological karakteristika for pasientene er vist i tabell 1.
DNA og RNA-ekstraksjon
DNA ble ekstrahert fra 10 um tykke FFPE vev ved hjelp av QIAmp DNA FFPE vev kit (Qiagen , Valencia, California, USA). Total RNA inkludert miRNA fraksjonen ble hentet fra FFPE- vev ved hjelp av RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion, Inc., Austin, Texas, USA).
Multiplex kvantitativ RT-PCR
I en screening sett som inkluderte normal colonic slimhinne fra friske forsøkspersoner og 44 CRC vev (16 stage II og III hver og 12 stadium IV pasienter), uttrykket status av 21 kandidat mirnas (MIR-9, MIR-10b, MIR-19a, MIR -21, MIR-31, MIR-34a, MIR-34C, MIR-101, MIR-103, MIR-137, MIR-143, MIR-145, MIR-148a, MIR-148b, MIR-152, MIR-155 , MIR-194, MIR-320, MIR-335, MIR-373 og MIR-519c) ble kvantifisert ved hjelp av high-throughput Fluidigm MicroFluidics dynamiske matriser [20]. Hver Taqman miRNA analysen (. Delenummer 4427975, Applied Biosystems, Foster City, California, USA) ble brukt i multipleks RT-PCR-analyse som følger: assay ID, 000583, 002218, 000395, 000397, 002279, 000426, 000428, 002253 , 000439, 001129, 002249, 002278, 000470, 000471, 000475, 002623, 000493, 002277, 000546, 000561, og 001163 respektivt. Disse kandidat mirnas har tidligere vist seg å være involvert i CRC og /eller andre menneskelige kreftformer [16], [18], [21] -. [35]
Kvantifisering av miRNA uttrykk ved real-time RT- PCR
i valideringssettet som inkluderte hele pasienten årsklasse, miRNA uttrykket ble kvantifisert ved Taqman revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR) med en ABI 7000 sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems). Ekspresjonen av MIR-148a ble beregnet ved delta Ct metoden, ved hjelp av MIR-16 ekspresjon som en normaliser [36], [37]. For å holde konsekvente målinger gjennom alle platene ble tre uavhengige RNA prøver lastet som interne kontroller i hver PCR-kjøring, og resultatene fra hver plate ble normalisert ifølge data innhentet fra interne kontroller.
DNA metylering analyse
DNA var bisulfite endres ved hjelp av EZ DNA metylering Gold Kit (Zymo Research, Irvine, California, USA). Metylering av antatte MIR-148a promoter regionen ble kvantifisert ved bisulfit pyrosekvensering (PSQ HS 96A pyrosekvensering system, Qiagen). De følgende primere ble anvendt; MIR-148a fremover, 5′-biotin-TAGGAAGGAAGGAGAGTG, MIR-148a omvendt, 5′-CCCAACAAAAATAATATTTTAACA, og MIR-148a sekvensering, 5′-CAAAAATAATATTTTAACAACC. Metyleringen nivåene av tre CpG områder ble analysert og metylering nivået for hver tumor er representert som middelverdien av metylering nivåer av de tre CpG-områder. De følgende PCR-syklusbetingelser ble benyttet: innledende denaturering ved 94 ° C i 7 minutter, fulgt av 45 sykluser ved 94 ° C i 30 sek, 52 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 30 sek
In situ
hybridisering for MIR-148a
In situ
hybridisering (ISH) ble utført som beskrevet av Navarro et al. [38] med mindre justeringer. En fluorescein (FITC) 5′-merket låst nukleinsyre-innlemmet miRNA probe (miRCURY LNA deteksjon sonde, Exiqon, Woburn, Massachusetts, USA) ble brukt for visualisering av MIR-148a på 3 mikrometer tykke FFPE- vevssnitt. En kryptert og en RNU6b sonde ble tatt med som negative og positive kontroller, henholdsvis (Exiqon). Platene ble plassert i en ovn ved 59 ° C over natten. Snittene ble deparaffinized med xylen, rehydrert med etanol, og behandlet med dietylpyrokarbonat vann i 1 min. Kromogen ISH ble utført i en automatisert plattform Bond Max (Vision Biosystems, Norwell, Massachusetts, USA). Objektglassene ble forbehandlet med protease 1 til 4 minutter ved 37 ° C. En total på 300 ul 25 nM-probe ble hybridisert i natriumklorid, natriumcitrat hybridiseringsbuffer ved 45 ° C over natten. Immunologisk påvisning ble utført med et mus-anti-FITC-antistoff ved 37 ° C i 60 minutter etterfulgt av en biotin-fri, polymer pepperrotperoksydase binder antistoff-konjugat system (Spesifisert deteksjonssystem, Vision BioSystems). DAB ble brukt som kromogen og hematoksylin ble brukt som en counterstain.
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA) eller MedCalc v12 (MedCalc programvare, Belgia). Forskjellene mellom to gruppene ble analysert ved hjelp av Mann-Whitney U-test. Korrelasjonsanalyser ble utført med Spearmans rang korrelasjon metode. CRC svulster ble kategorisert i høye og lave Mir-148 uttrykk grupper som bruker Receiver Operating Karakteristisk kurve analyse (stadium II /III) eller median uttrykk verdier (stadium IV). Kaplan-Meier analyse ble utført for å beregne fordelingen av sykdomsfri overlevelse (DFS) og kreftspesifikk total overlevelse (OS) i stadium II og III pasienter, og progresjonsfri overlevelse (PFS) og OS i stadium IV pasienter. En log-rank test ble benyttet for å analysere statistiske forskjeller i overlevelse som utledes fra Kaplan-Meier-kurver. Cox proporsjonal-hazard regresjonsanalyse ble utført for å beregne HR og 95% KI for hver covariable. Den endelige multivariate modellen var basert på en trinnvis metode for kliniske faktorer assosiert med god eller dårlig overlevelse (p 0,1) i univariate modeller. For overlevelsesanalyse ble enslig MSI svulst utelukkes fra stadium IV-gruppen. Alle forskjeller ble ansett som statistisk signifikant når p. 0,05
Resultater
MIR-148a er en kandidat miRNA som er ofte nedregulert i stadium III og IV CRC
i en screening-apparatet, vi først screenet 21 kandidat mirnas som har blitt implisert i tumorgenese, ved hjelp av Fluidigm Microfluidics dynamiske arrays (n = 44; Tilsetnings tabell S1). Blant de 21 mirnas analysert, 13 miRNA hell gitt uttrykk resultater i multipleks RT-PCR. Syv mirnas demonstrerte signifikant endret uttrykk mellom normale og CRC vev. Blant alle, bare MIR-148a avslørte en betydelig nedregulering i tumorer med lymfeknute (trinn III) eller fjernmetastaser (IV) sammenlignet med tumorer uten (II), noe som understreker betydningen av dette miRNA i CRC progresjon /metastasering. Basert på disse resultatene, vi senere fastslått om en MIR-148a uttrykk endring i en større kohort av CRC har noen prognostisk /prediktiv verdi.
I vår hele kullet (n = 273), MIR-148a uttrykk i scenen III /IV tumorer var betydelig lavere enn i normale kolon mukosa (p 0,001; figur 1A). Vi har også observert en trend mot gradvis senking av MIR-148a uttrykk med stigende fasen av CRC (Figur 1a). Nærmere bestemt MIR-148a-ekspresjon i stadium III og IV tumorer var betydelig lavere enn i normale kolon mukosa (p 0,001), mens det ikke var signifikant forskjellig mellom scene II svulstene, og de normale slimhinneprøver (p = 0,41; figur 1A) .
A. MIR-148a uttrykk i colonic slimhinnen fra friske kontroller (NC), og i stadium II, III og IV CRC; det antall pasienter (n) og median uttrykket (median) er listet under grafen. B.
In situ
hybridisering for MIR-148a i CRC svulster og normal slimhinne, der kromogen flekker røde, og counterstain blå. Representative mikrofotografier vises fra en normal colonic slimhinne (toppfeltene), en svulst med lav MIR-148a uttrykk (midterste paneler), og en svulst med høy MIR-148a uttrykk (nedre paneler) på angitte forstørrelser. En mikrofotografiet er vist fra en svulst med høy MIR-148a uttrykk ved hjelp av en rykke sonde som en negativ kontroll (nederst, venstre panel). C. MIR-148a metylering nivåer i scenen IV svulster. Den antatte promotor-regionen i MIR-148a, og posisjonen av pyrosekvensering av primere er vist i toppanelet. Den spredningsplott av MIR-148a uttrykk og metylering nivåer er vist i bunnpanelet. D. MIR-148a uttrykk nivåer er vist for denaturert og ikke-denaturert CRC i toppanelet. MIR-148a metylering nivåer er vist for tumorer med høy og lav MIR-148a-ekspresjon i bunnfeltet. En avvikende verdi (metylering nivå, 48%). Er utelukket fra denaturert gruppen i bunnen grafen
Neste, for å bekrefte tumorspesifikt uttrykk mønster for MIR-148a, utførte vi ISH analyse i en undergruppe av scene IV svulster med høy og lav MIR-148a uttrykk. Vi observerte at uttrykket i normal tarmslimhinnen for stadium II svulster var høy, bekrefter resultatene de QRT-PCR (Figur 1b). CRC med høy MIR-148a ekspresjon ved QRT-PCR også uttrykkes dette miRNA primært innenfor cytoplasma av neoplastiske celler (figur 1 B), men ikke i de ikke-epiteliale stromale celler, med unntak av farging av noen inflammatoriske celler i lamina propria, spesielt plasmaceller. Videre CRC med lav MIR-148a uttrykk konstatert ved QRT-PCR avslørte også svært lav eller fraværende uttrykk for dette miRNA på ISH nivå (figur 1B). Disse resultatene indikerer at våre QRT-PCR resultater nøyaktig reflektert den endogene uttrykk for MIR-148a innenfor kreftceller hentet fra CRC vevsprøver.
Uttrykk av MIR-148a er omvendt korrelert med sin promoter metylering status
Den antatte promoter-regionen i MIR-148a steder innenfor en CpG island, og metylering av disse CpG nettsteder har blitt foreslått som en mulig mekanisme for MIR-148a inaktivering i CRC og brystkreft [39] – [41]. Imidlertid har ingen av tidligere studier har grundig undersøkt i direkte sammenheng mellom MIR-148a Uttrykket og metylering status i et stort kohort av kreft prøver. Derved var vi interessert i å belyse om nedregulering av MIR-148a observert i vår kohort var en konsekvens av arrangøren hypermethylation. Siden MIR-148a ble hyppigst nedregulert i stadium IV CRC, vi fokusert vår metylering analyse på disse svulstene. Kvantitativ bisulfite pyrosekvensering avdekket at enkelte stadium IV CRC demonstrert MIR-148a hypermethylation. Metyleringen nivåene varierte mellom 4-26% (median, 10%), og når den metylering status av hver tumor ble sammenlignet med sin QRT-PCR-avledede uttrykk status, ble en signifikant korrelasjon observert (Spearmans koeffisient, R «sup> 2 = -0,43, p 0,001; figur 1C). I tillegg, når vi kategorisert alle svulster i et ikke-metylert (metylering nivå 15%) og denaturert grupper (≥15% metylering), observerte vi at denaturert svulster hadde gjennomgående lavere Mir-148a uttrykk (0,068 g 0,088, p = 0,029; figur 1D, øverst). Videre CRC med lavere MIR-148a ekspresjon ble oftere metylert i forhold til tumorer med høyere uttrykk (median, 11% mot 8%, p = 0,001, Mann-Whitney U-test; figur 1D, nederst). Disse resultatene markere at hypermethylation av den antatte MIR-148a promoter-regionen er en viktig reguleringsmekanisme for dens uttrykk i CRC.
Lav MIR-148a uttrykket er assosiert med dårlig utfall hos pasienter med stadium II og III CRC
siden forsøkte å finne ut om MIR-148a uttrykk status hadde en innvirkning på prognose hos pasienter med stadium II og III CRC behandlet med 5-FU-baserte adjuvant kjemoterapi. For disse analysene, sammenlignet vi forskjellene i DFS og OS mellom høy ekspresjon (stadium II = 58, III = 80) og lav ekspresjon (II = 18, III = 45) grupper. Vi fant ikke signifikante sammenhenger mellom MIR-148a uttrykk og noen av clinicopathological faktorer som alder, kjønn, tumor sted eller MSI status (tabell 1). Imidlertid lav MIR-148a-ekspresjon ble signifikant assosiert med kortere DFS (5-års DFS, lav vs høy, 54% vs. 71%, p = 0,023; figur 2A), og viste en trend mot dårligere OS (5-års OS, 78% vs. 85%, p = 0,12; figur 2B). Vi evaluerte neste den prognostiske /prediktiv verdi av MIR-148a uttrykk i en Cox proporsjonal hazard regresjonsmodell. I univariat analyse, høyere TNM stadium (III vs. II, HR 2,06, 95% KI 1,21 til 3,52, p = 0,008) og lavere Mir-148a uttrykk (HR 1,74, 95% KI 1,08 til 2,83, p = 0,025) var signifikant assosiert med kortere DFS, og yngre alder viste en trend mot kortere DFS ( 60, HR 1,57, 95% KI 0,97 til 2,56, p = 0,071, Tabell 2). Videre i multivariate modellen inkludert disse tre faktorene, MIR-148a uttrykk status ble uavhengig assosiert med dårligere overlevelse (HR 1,83, 95% KI 1,12 til 2,99, p = 0,017, Tabell 2).
Kaplan-Meyer kurver for A, Sykdomsfri overlevelse (DFS) og B, total overlevelse (OS) i stadium II /III pasienter i henhold til Mir-148a uttrykk. Kaplan-Meyer kurver for C, DFS i stadium II og D, stadium III DFS avhengig MIR-148a uttrykk.
Vi neste analysert data fra stadium II og III CRC separat for å avgjøre om sammenhengen mellom lav MIR-148a uttrykk og verre utfall var lik i begge trinn, eller hovedsakelig på linje med en scene. Vi fant ut at i stadium II, gjorde MIR-148a uttrykk ikke forbinder med DFS (5-års DFS, høy vs lav, 77% vs. 83%, p = 0,50, figur 2C) eller OS (5-års OS, 89 % vs. 87%, p = 0,94; data ikke vist). Men i fase III, lav MIR-148a-ekspresjon ble signifikant assosiert med dårligere DFS (5-års DFS, 43% vs. 66%, p = 0,0071, figur 2D), men ikke med OS (5-års OS, 75% vs. . 81%, p = 0,16; data ikke vist). Videre lav MIR-148a uttrykk var en eneste faktoren som assosiert med tumorresidiv i fase III (tabell 2). Disse resultatene tyder på at Mir-148a uttrykk status har et potensial som en prognostisk /prediktiv biomarkør for stadium III CRC.
Lav MIR-148a uttrykket er assosiert med dårligere en terapeutisk respons og lavere overlevelse i stadium IV CRC
Vi neste belyst om MIR-148a status hadde et potensial for å forutsi terapeutisk utfall hos pasienter med stadium IV CRC behandlet med 5-FU og oxaliplatin. Alder, kjønn, svulst plassering og ytelse status var ikke signifikant forskjellig mellom de høye og lave uttrykk grupper (tabell 1). Svulster fra ikke-respondere (stabil sykdom og progressiv sykdom) viste en trend mot lavere Mir-148a uttrykk sammenlignet med de fra responders (komplett respons og partiell respons) (median, 0,063 g 0,092, p = 0,10, figur 3A, til venstre) . Likevel, når stadium IV svulster ble delt inn i de lave og høye MIR-148a uttrykk grupper, den lave uttrykk gruppen var signifikant assosiert med en ugunstig terapeutisk respons (responders, 49% vs. 81%, p = 0,006; figur 3A, rett ). På Kaplan-Meyer analyse, den lave uttrykk gruppen viste en trend mot verre PFS (median, 8,1 vs. 10,1 måneder, p = 0,16, figur 3B, til venstre) og betydelig verre OS (16,1 vs. 25,6 måneder, p = 0,024; figur 3B, høyre). I tillegg til uttrykket status, MIR-148a metylering status også forbundet med begge dårligere PFS (metylert vs. ikke-denaturert, 6,9 vs. 9,3 måneder, p = 0,020; figur 3C, til venstre) og OS (10,2 vs. 21,8 måneder, p = 0,0015, figur 3C, til høyre)
A.. Terapeutisk respons ifølge Mir-148a uttrykk. Komplett respons, CR; delvis respons, PR; stabil sykdom, SD; progressiv sykdom; PD. B. Kaplan-Meyer kurver for progresjonsfri overlevelse (PFS, venstre panel) og OS (høyre panel) i stadium IV pasienter i henhold til Mir-148a uttrykk. C. Kaplan-Meyer kurver for PFS (venstre panel) og OS (høyre panel) i stadium IV pasienter i henhold til Mir-148a metylering.
Vi evaluerte også prediktiv verdi av MIR-148a i en Cox proporsjonal-hazard modell. I univariat analyse, verre PS (HR 2,62, 95% KI 1,26 til 5,43, p = 0,010), senke MIR-148a uttrykk (HR 1,79, 95% KI 1,08 til 2,98, p = 0,026) og Mir-148a hypermethylation (HR 2,76 , 95% CI 1,44 til 5,28, p = 0,002) var signifikant assosiert med dårligere overlevelsen (tabell 3). I den endelige multivariate modellen som inkluderte disse tre faktorene, både MIR-148a uttrykk status (HR 1,93, 95% KI 1.15 til 3.23, p = 0,014) og Mir-148a hypermethylation (HR 3,04, 95% KI 1,56 til 5,93, p = 0,0011) dukket opp som uavhengige prediktive faktorer som var assosiert med dårligere utfall (tabell 3).
Diskusjoner
Formålet med denne studien var å belyse hvorvidt MIR-148a uttrykk er dysregulerte i CRC, og dessuten, hvis dette har potensial for å tjene som en prognostisk eller prediktiv biomarkør i denne sykdommen. Heri, gir vi dokumentasjon som synliggjør en betydelig rolle for MIR-148a feilregulering i CRC. Først MIR-148a uttrykk var ofte nedregulert i CRC, spesielt i avansert stadium svulster. For det andre ble MIR-148a-ekspresjon i colon reguleres i det minste delvis gjennom epigenetiske mekanismer basert på invers korrelasjon observert mellom dets ekspresjon og metylering status. Tredje, lav MIR-148a uttrykket ble uavhengig assosiert med dårlig prognose i fase III pasienter behandlet med adjuvant kjemoterapi. Fjerde, lav MIR-148a uttrykk var også assosiert med dårligere behandlingsrespons og dårligere overlevelse i stadium IV pasienter behandlet med kjemoterapi. Endelig metylering status var en uavhengig prediktor for dårligere prognose i stadium IV CRC.
In vitro
studier med ikke-colonic cellelinjer har indikert at Mir-148a utøver en svulst undertrykkende funksjon av målrette flere gener som
PXR
,
TGIF2
,
MSX1
,
CDC25B
,
DNMT1 Hotell og
DNMT3b
[39], [42] – [46]. Den feilregulering av MIR-148a har vært innblandet i CRC [14], [29], [39], [47], men er fortsatt den kliniske betydningen av endret MIR-148a uttrykk i CRC ikke helt klarlagt. I vår studie har vi analysert den største kohort av CRC pasienter hittil (n = 273) og gitt solid dokumentasjon på at Mir-148a uttrykk er ofte nedregulert i avansert CRC og dens reduserte uttrykket er assosiert med dårligere overlevelse i fase III og IV sykdom. Så langt vi kjenner til, har ingen av de tidligere rapportene begitt seg ut på identifisering av miRNAs som biomarkører for å forutsi den terapeutiske responsen i stadium IV CRC pasienter behandlet med cytotoksisk kjemoterapi. Vår mest klinisk viktig observasjon var at scenen IV CRC pasienter med høyt MIR-148a uttrykket var mer sannsynlig å dra nytte av cytostatika, fremhever den potensielt romanen prediktiv verdi av miRNA som et beslutningsverktøy i behandling av pasienter med CRC.
De nøyaktige mekanismene bak MIR-148a nedregulering for å fremme motstanden CRC celler til kjemoterapi krever ytterligere forklaring. Imidlertid har nyere bevis for rollen som denne miRNA i andre kreftformer som tilbys ledetråder for å forstå noen av dens virkninger på cellulær kjemosensitivitet. Fujita
et al.
Rapporterte at Mir-148a rettet direkte
MSK1 Hotell og transfeksjon av sin forløper økt følsomhet for paclitaxel i prostatakreftceller [43]. MIR-148a uttrykket har også vist seg å forbedre responsen til cisplatin og 5-FU i esophageal kreftceller [48]. I tillegg til disse
in vitro
funn hos unge pasienter med akutt myelogen leukemi, høyere
BAALC
genekspresjon korrelerer omvendt med MIR-148a uttrykk, og har vist seg å assosiere med verre utfall i pasienter behandlet med kjemoterapi [49]. Kollektivt, våre observasjoner for potensialet i MIR-148a uttrykk status som en prediktiv markør i stadium IV CRC enig med disse tidligere publikasjoner i andre kreftformer.
Vår studie er også det første forsøket på å bekrefte metylering-mediert stanse av MIR-148a ved direkte sammenligning av uttrykk og metylering nivåer i en stor kohort av godt kommenterte CRC. I tillegg til de innledende studier av Lujambio
et al.
[39], nå nylig ble det vist at Mir-148a ble hypermethylated i 51 av 78 CRC [40]. Men ingen av disse studiene utført MIR-148a ekspresjon analyse og direkte korrelert sine resultater med hypermethylation i vev. Videre er begge studiene analysert MIR-148a metylering status ved hjelp av en ikke-kvantitativ metylering-spesifikke PCR-metoden, som er notorisk ikke-spesifikk for metylering, og gir ikke en terskel for metylering som korrelerer med transkripsjonen inaktivering av genet. Styrken i vår studie er at vi bestemt MIR-148a uttrykk ved QRT-PCR, og korrelert uttrykket data med kvantitative bisulfitt pyrosekvensering resultater, som er en mer robust tilnærming for å demonstrere metylering-mediert feilregulering av enhver genet. Følgelig, observerte vi en signifikant invers sammenheng mellom metylering og uttrykk, forsterke konseptet at MIR-148a nedregulering i CRC skyldes delvis til arrangøren hypermethylation. Vi har også registrert en betydelig og uavhengig sammenheng mellom MIR-148a metylering og dårlig overlevelse i stadium IV pasienter, fremhever at uttrykk og metylering status av MIR-148a kan være nyttig som prognostiske /prediktiv markører i CRC.
