Abstract
PTEN tap og konstitutiv aktivering av PI3K signalveien har vært forbundet med avansert androgen-uavhengig prostatacancer. PTEN-mangelprostatakreft C42Luc celler overleve i serum-fritt medium og viser relativ resistens mot apoptose, selv i nærvær av PI3K inhibitor ZSTK474. Likevel, når ZSTK474 er kombinert med oversettelse inhibitor cykloheksimid, C42Luc celler gjennomgår apoptose i løpet av 6 timer. Vi identifiserte defosforylering av BAD (BCL2-assosiert død promoter) som hoved apoptose regulerende molekyl nedstrøms fra PI3K, og tap av MCL-en (myelogen celle leukemi -1) som et viktig mål for cycloheximide. Kombinasjonen av MCL-1 knockdown og ekspresjon av fosforylering-manglende mutant BAD2SA er tilstrekkelig til å utløse hurtig apoptose i prostatakreftceller. Disse resultatene etablere mekanismen for synergistisk induksjon av apoptose ved kombinasjonen av et PI3K-inhibitor og av en proteinsynteseinhibitor i PTEN-manglende prostatakreftceller
relasjon:. Yancey D, Nelson KC, Baiz D, Hassan S, Flores A, Pullikuth A, et al. (2013) BAD Defosforylering og Redusert uttrykk av MCL-1 Frem Rapid apoptose i prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (9): e74561. doi: 10,1371 /journal.pone.0074561
Redaktør: Aamir Ahmed, University College London, Storbritannia
mottatt: 19 november 2012; Godkjent: 05.08.2013; Publisert: 05.09.2013
Copyright: © 2013 Yancey et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av R01CA118329 stipend fra National Cancer Institute til George Kulik. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Bakgrunn
Flere studier har identifisert den fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) svei som en av de viktigste faktorer i prostata kreftutvikling og progresjon til terapeutisk motstand [1] – [3]. PI3K fungerer som en formidler av intracellulær signaloverføring ved å generere phosphatidylinositol (3-5) -triphosphate (PIP3) gjennom fosforylering av phosphatidylinositol (4,5) -biphosphate (PIP2). Når generert, rekrutterer PIP3 proteiner inneholder pleckstrin homologi (PH) domene (inkludert AKT kinase) til cellemembranen, hvor de gjennomgår en konformasjonsendring. I Akt, dette konformasjonsendring resulterer i en grunning fosforylering på treonin 308 av phosphoinositide-avhengig kinase 1 (PDK1) etterfulgt av en aktive fosforylering på serin 473 av mammalian target of rapamycin kompleks 2 (mTORC2) [4]. Aktivert Akt translocates til cytoplasma og cellekjernen til å fosforylere et antall nedstrøms mål som er involvert i celleoverlevelse, vekst, proliferasjon, og cellesyklusprogresjon [5]. Den lipid fosfatase og tumor suppressor PTEN (fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10) fungerer som en negativ regulator av Akt og PI3K veien ved dephosphorylating PIP3 og konvertere den tilbake til PIP2. I prostata cancer, den primære mekanismen for PI3K dysregulering er det tap av funksjon av PTEN gjennom homozygot delesjoner, tap av heterozygositet eller inaktiverende mutasjoner [6], [7], som fører til konstitutiv aktivering av Akt.
androgen ablasjon induserer apoptose i prostata epitelceller [8]. Ennå PTEN-negative prostatakreftceller ikke gjennomgår apoptose i fravær av androgener [9]. Tilsvarende har mus med prostata-begrenset PTEN knockout reduserte nivåer av apoptose og redusert prostata involusjon ved kastrering [10]. Disse resultatene tyder på at konstitutiv aktivering av PI3K veien i PTEN-null avanserte prostatakreft bidrar til androgen uavhengighet ved å hemme apoptose.
Proteiner av BCL-2 familien spiller en sentral rolle i apoptose ved å regulere mitokondrie ytre membran permeabilization (MOMP) og frigjøring av apoptose-induserende proteiner så som cytokrom c, SMAC, og apoptose-induserende faktor (AIF) sekvestrert i mitokondriene [11]. Den BCL-2 protein familien er delt inn i tre grupper basert på funksjonalitet og tilstedeværelse av konservert BCL-2 homologienheter (BH1-4) domener: multidomain anti-apoptotiske proteiner, multidomain pro-apoptotiske proteiner og BH3-bare proteiner. Interaksjoner mellom disse gruppene av BCL-2 proteiner diktere om en celle lever eller dør. Multi-domene anti-apoptotiske proteiner som BCL-2, BCL-XL, og MCL-en forhindre MOMP ved å samhandle med og avsette de multidomain pro-apoptotiske Bcl proteiner BAK og BAX [12]. BAK og BAX har BH1-3 domener som tillater oligomerisering på mitokondrie ytre membran og påfølgende MOMP gjennom pore formasjon [13]. BH3-bare proteiner, slik som dårlig, NOXA, og PUMA [14] – [16], konkurransedyktig binder og nøytraliserer anti-apoptotiske proteiner, slik at BAX /BAK oligomerisering og fremme celledød, mens Bud og Bim kan også samhandle med og aktivere BAX og BAK, tilrettelegging membraninnføyelse og MOMP [11].
BH3-bare proteiner av BCL-2 familie funksjon som voktere som regulerer apoptose og overlevelse som respons på ekstracellulære stimuli ved å binde seg til den hydrofobe spor av deres anti-apoptotiske partnere. Hver BH3-bare proteinet har en unik profil for bindingspartnere. Således BAD er blitt vist å binde til og nøytralisere BCL-2, BCL-XL, og BCL-W [14], [17], fortrenge BAK og BAX og fremme poredannelse. Imidlertid er andre anti-apoptotiske proteiner som MCL-1 og A1 ikke er nøytralisert av dårlig, men i stedet er bundet og nøytralisert ved NOXA og henholdsvis Puma, [15], [17], [18].
tidligere viste vi at økt ekspresjon BAD fremmer prostatacancer celleproliferasjon [19]. På samme tid, spiller BAD fosforylering status en viktig rolle i reguleringen av apoptose ved å tjene som et konvergenspunkt av flere anti-apoptotiske signalveier, inkludert konstitutivt aktiv PI3K [20]. BAD fosforylering på seriner 112 og 136 (basert på mus sekvens) [21], [22] letter samhandling med 14-3-3 anstand, mens fosforylering på S155 i BH3 domene forstyrrer binding til BCL-XL eller BCL-2 [23 ]. Som et resultat, inaktiverer fosforylering den pro-apoptotiske funksjon av BAD ved å forhindre interaksjon med BCL-2 og BCL-XL. Disse tidligere resultater antydet at PI3K hemming og påfølgende dårlig defosforylering ville utløse apoptose i PTEN-negative prostatakreftceller. Men vi fant ut at til tross for rask BAD defosforylering, PI3K hemming med ZSTK474 induserer apoptose i C42Luc prostatakreftceller ved relativt sene tidspunkt (mellom 12-24 timer).
Vi oppdaget at MCL-1 uttrykk gir resistens mot behandlinger med PI3K hemmere og BAD defosforylering. Motsatt, kombinasjonen av MCL-1 tap (indusert av cycloheximide eller shRNA knockdown) og BAD defosforylering utløser rask apoptose. Disse resultatene identifisere BAD og MCL-en som hovedvakt av pro-apoptotisk signalering i PTEN-mangelprostatakreftceller studert.
Resultater
Kombinasjonen av PI3K inhibitor ZSTK474 og protein syntese inhibitor cycloheximide induserer hurtig apoptose i C42Luc prostatakreftceller
PI3K signalveien er konstitutivt aktivert i C42Luc prostatakreftceller på grunn av en sletting av en allel av lipid fosfatase PTEN og et rammeskifte mutasjon i andre allelet [ ,,,0],24]. Som et resultat av disse prostata kreftceller er ikke avhengig av androgen eller andre eksterne faktorer overlevelse. Når PI3K reaksjonsveien blir inhibert av ZSTK474, C42Luc celler gjennomgår apoptose, som det fremgår av overvåkning av celler med time-lapse mikroskopi (figur 1A, rutete barer).
A) C42Luc celler ble behandlet med enten 5 uM ZSTK474, 100 mikrogram /ml cycloheximide, eller en kombinasjon, og apoptose innspilt i 24 timer ved hjelp av time-lapse mikroskopi. Den kumulative prosentandelen av celler inn apoptose (avrunding og membran blebbing), vises på bestemte tidspunkter i løpet av 24 timer. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser standardavvik fra gjennomsnittet av fire tilfeldig utvalgte felt. *,
p
0,05. B) Caspase-3 aktiveringstest i C42Luc-celler ble behandlet med 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml cykloheksimid, eller kombinasjonen. Etter 6 timers behandling ble cellene lysert, og caspase-3 aktivitet i cellelysatene ble målt med et fluorogent substrat (DEVD-AFC). Data er presentert som fold-induksjon av fluorescensintensitet normalisert til kontroll (DMSO). *,
p
0,0001. C) Immunfluorescens farging av spaltet kaspase 3 (rød) og TUNEL (grønn) i C42Luc celler behandlet med DMSO, 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml cykloheksimid, eller kombinasjonen. DAPI ble brukt for å visualisere kjerner. Hver rad av plater representerer den samme synsfelt. D) Western blot av C42Luc celler behandlet med enten 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml cykloheksimid, eller kombinasjonen. Helcellelysater var samlet på de angitte tider og analysert for pBAD (Ser112) og total BAD.
Sammenligning av apoptose dynamikken i C42Luc celler behandlet med PI3K inhibitor ZSTK474 alene og i kombinasjon med oversettelsen inhibitor cykloheksimid har vist at kombinasjonen induserer apoptose hurtigere, med et betydelig antall celler som dør etter 6 timer. Etter behandling med ZSTK474 eller cycloheximide alene, apoptose ble bare synlig på 12 timer, med et betydelig antall celler som dør 24 timer etter behandlingene (figur 1A). Induksjon av apoptose ved kombinasjonsbehandling ble bekreftet ved å måle caspase aktivitet med det fluorogene substrat DEVD-AMC, påvisning av kløyvde aktive formen av caspase 3, og tunel analyser (figur 1B, C).
Tidligere publikasjoner fra flere laboratorier, inkludert våre, viste at fosforylering av BH3-eneste protein BAD spiller en sentral rolle i apoptose regulering nedstrøms i forhold til PI3K signalveien i forskjellige cellelinjer, inkludert prostata kreftcellelinjer LnCap og C42 [20], [25] [26]. Imidlertid gjorde BAD defosforylering ikke skiller mellom celler behandlet med ZSTK474 alene eller med en kombinasjon av ZSTK474 og cykloheksimid (figur 1D). Disse resultater antyder at BAD defosforylering er enten irrelevant eller utilstrekkelig for rask induksjon av apoptose i prostatakreftceller C42Luc.
Tap av MCL-1 sensitizes prostatakreftceller til apoptose indusert av PI3K inhibitor ZSTK474
for å belyse mekanismen av den raske apoptose indusert ved cykloheksimid i kombinasjon med ZSTK474, viste vi oppmerksomheten mot andre BCL-2-familieproteiner. Siden defosforylert BAD kan binde BCL-XL, BCL-2, og BCL-W, men kan ikke kommunisere med MCL-en, hypotese vi at MCL-en kan være ansvarlig for forsinket apoptose i celler med defosforylert BAD. En annen linje av bevis som støtter en rolle av MCL-1 i apoptose regulering er dens relativt korte halveringstid, som tillater dynamisk regulering av MCL-1-nivåer av ekstracellulære stimuli [27] og gjør MCL-en spesielt følsomme for hemming av translasjon av cycloheximide
prostata kreft celler vanligvis uttrykker tre anti-apoptotiske Bcl proteiner:. BCL-XL, BCL-2, og MCL-1 [28], [29]. Analyse av anti-apoptotiske BCL2 familien protein uttrykk nivåer i C42Luc celler behandlet med pro-apoptotiske midler viste at MCL-1-ekspresjonen er vesentlig redusert i celler behandlet med cykloheksimid i 6 timer, og i celler behandlet med kombinasjonen av ZSTK474 og cykloheksimid (figur 2A). I motsetning til dette ble ingen signifikant reduksjon i BCL-2 og BCL-XL ekspresjon påvist i celler behandlet med en kombinasjon av inhibitorer. Likevel, det korrelerende bevis later åpne muligheten for at andre kortvarige proteiner kan bidra til økt apoptose i celler behandlet med ZSTK474 og cykloheksimid.
A) Western blot-analyse av C42Luc celler behandlet med enten 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml cykloheksimid, eller en kombinasjon i 6 timer. Helcellelysater ble probet for MCL-1, BCL-2, og BCL-XL for å sammenligne effektene av proteinsynteseinhibitor og probet for pBAD (S112) og pakt (S473 og T308) for å kontrollere virkningene av PI3K inhibitor. B) Analyse av apoptose av time-lapse mikroskopi. C42Luc celler ble transient transfektert med lentiviral vektor som koder GFP og MCL-1-spesifikk shRNA eller kryptert kontroll shRNA, og behandlet med 5 uM ZSTK474 48 timer etter transfeksjon. Prosentandelen av apoptotiske celler ved angitte tidspunkter etter behandlinger ble bestemt som i figur 1A. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser standardavvik fra gjennomsnittet av fire tilfeldig utvalgte felt. *,
p
0,005; #
p
0,001 Inset viser Western blot av endogen MCL-1 og β-aktin (lasting kontroll) nivåer i C42Luc celler 48 timer etter infeksjon med lentiviral vektor uttrykker MCL-en spesifikk eller forvrengt shRNA. C) Caspase-3-aktivering analyse av C42Luc celler transfektert med shRNA targeting MCL-en eller egge kontroll shRNA. Caspaseaktivering ble målt 6 timer etter at cellene ble behandlet med enten DMSO eller 5 uM ZSTK474. Behandlinger ble tilsatt 48 timer etter transfeksjon. *,
p
0,01; **,
p
0,05. D) Analyse av apoptose av time-lapse mikroskopi i C42Luc celler transfektert med MCL-en-spesifikke shRNA (stripete søyler) eller egge shRNA (rutete barer) og doksycyklin-induserbar Flag-MCL-en. Den kumulative prosentandelen av apoptotiske celler ved angitte tidspunkter ble bestemt som i figur 1A 24 timer etter behandling doksycyklin. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser standardavvik fra gjennomsnittet av fire tilfeldig utvalgte felt. *,
p
0,01 #
p
0,05. Inset viser Western blot av Flag-merket MCL-en immunopresipitert med anti-FLAG harpiks og analysert for MCL-1 uttrykk.
For å teste direkte rolle MCL-en som den primære formidler av cycloheximide- indusert apoptose i C42Luc celler, redusert vi MCL-1 protein uttrykk ved hjelp shRNA knockdown. Analyse av apoptose av caspase analysen og time-lapse mikroskopi i celler infisert med en lentiviral vektor som uttrykker enten Mcl1 spesifikke shRNA eller egge kontroll shRNA viste at ZSTK474 indusert apoptose mer effektivt i celler med knockdown av MCL-en (figur 2B, C) . Omvendt, ektopisk ekspresjon av et doksycyklin-induserbar Flag-MCL-1-konstruksjonen ble redusert apoptose i celler transfektert med MCL-1 shRNA til sammenlignbare nivåer som de som er i celler transfektert med egge shRNA (figur 2D). Økt Apoptose ble også observert i ZSTK474 behandlede celler hvori MCL-1-ekspresjon ble slått ned ved hjelp av en andre MCL-1-spesifikke shRNA konstruksjon som målrettet 3′-UTR (figur S1). Til sammen resultatene fra disse forsøkene tyder på at MCL-1 tap bidrar til cycloheximide-indusert allergi til apoptose indusert av ZSTK474.
BIM er involvert i apoptose regulering i C42Luc celler
BIM og NOXA , BH3-bare proteiner av BCL2 familie, har blitt identifisert som bindende partnere av MCL-en. NOXA binder seg hovedsakelig til MCL1, mens BIM kan også binde andre anti-apoptotiske proteiner av BCL2 familien, så vel som binder seg til og aktiverer BAX [15], [30]. NOXA, men ikke BIM, er angivelig involvert i proteinkompleks som er rettet mot MCL-en for degradering [31]. Faktisk, i C42Luc celler behandlet med sykloheksimid, ble NOXA nedbrutt mens BIM ekspresjon forble konstant (fig. 3A). Derfor fokuserte vi på analyse av BIM. I samsvar med tidligere rapporter, ble BIM oppdaget i immunutfelninger med FLAG perler fra C42Luc celler som uttrykker FLAG-MCL-1 (fig. 3B). For å teste om BIM er involvert i apoptose induksjon av kombinasjonen av cycloheximide og ZSTK474, brukte vi to BIM-spesifikke shRNAs å slå ned uttrykket av endogen BIM protein. Betydelig reduksjon av kaspase-aktivitet, så vel som redusert apoptose i begge C42Luc-shBIM1 og C42Luc-shBIM2-celler sammenlignet med kontroll C42Luc-celler ble påvist etter behandling med cykloheksimid og ZSTK474 (fig. 3C, D), noe som bekrefter rollen til BIM i apoptose av C42Luc celler. Videre ble redusert apoptose observeres i både C42Luc-shBIM1 og C42Luc-shBIM2-celler sammenlignet med C42Luc celler transfektert med en konstruksjon som uttrykte MCL-1-spesifikke shRNA, noe som viser at BIM er involvert i apoptose initiering «nedstrøms» fra MCL-en tap.
A) NOXA uttrykk er redusert i C42Luc celler behandlet med kombinasjonen av ZSTK474 og cykloheksimid. Western blot-analyse av MCL-1, NOXA, BIM og β-aktin (lasting kontroll) i celler behandlet i 4 og 6 timer med cykloheksimid. B) Samtidig immunoprecipitation av MCL-en og BIM fra celler som uttrykte doksycyklin-induserbar FLAG-MCL-en. C) Apoptose i C42Luc celler som uttrykker to BIM-spesifikk shRNA og i foreldre celler ble vurdert av tid forfalle mikroskopi. Celler ble behandlet med vehikkel ((-) DMSO) eller kombinasjon av cykloheksimid og ZSTK474 (+). Mengden av apoptose (%) ble bestemt som i figur 1A. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser standardavvik fra gjennomsnittet av fire tilfeldig utvalgte felt. Data for 6 timer etter behandling er presentert. Forskjeller i% apoptose mellom kontrollceller (som uttrykker egge shRNA) og C42Luc BIM1 eller C42Luc BIM2 celler var statistisk signifikant (p 0,05 og p 0,0001, henholdsvis). Sett viser redusert BIM uttrykk i celler som stabilt uttrykte BIM-spesifikk shRNA. D) Apoptose i C42Luc celler som uttrykte en av to BIM-spesifikk shRNA eller kontroll vektoren ble bestemt ved måling av kaspase-aktivitet. Celler ble behandlet i 6 timer med bærer ((-) DMSO), eller en kombinasjon av cykloheksimid og ZSTK474 (+). Forskjeller i kaspase aktivitet mellom kontrollcellene og C42Luc BIM1 eller C42Luc BIM2 celler var statistisk signifikant (p = 0,002 og p = 0,05, henholdsvis). E) C42Luc celler eller C42LucBIM2 celler som stabilt uttrykker BIM-måls shRNA ble transfektert med lentiviral vektor som uttrykker GFP og enten egge (SCR) eller MCL-en-spesifikke shRNA2. Prosent av apoptose i GFP-positive celler ble bestemt av time-lapse mikroskopi. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser gjennomsnitt og standardavvik av fire synsfelt. Kvalitativt lignende resultater ble oppnådd i C42LucBIM1 celler. Beta aktin ble brukt som en lasting kontroll i (A) og (C).
BAD defosforylering er ansvarlig for den raske apoptose indusert av PI3K inhibitor ZSTK474 pluss cycloheximide
Tidligere, vi vist at behandling med en PI3K hemmer utløser BAD defosforylering på S112 og S136; Vi har også brukt shRNA knockdown for å vise at BAD er nødvendig for apoptoseinduksjon av PI3K hemmere i prostatakreftceller [20]. Likevel ble flere mål av PI3K signal foruten BAD innblandet i hemming av apoptose [32]. For å bestemme hvorvidt BAD defosforylering er tilstrekkelig til å indusere apoptose hurtig i nærvær av cykloheksimid, ble C42Luc-celler transfektert med en doksycyklin-induserbar fosforylering-manglende mutant BAD, hvor Ser112 og Ser136 ble erstattet med alaniner (BAD2SA). Ved cycloheximide behandling, viste celler transfektert med BAD2SA betydelig økt apoptose sammenlignet med celler transfektert med vill-type BAD (WT-BAD) (figur 4A og B). I samsvar med en sentral rolle BAD i apoptose regulering, behandling av prostata celler med en BAD-mimetiske ABT-737 (basert på BH3 domenet BAD) indusert økt apoptose når kombinert med cycloheximide, lik den kombinasjonen av cycloheximide med PI3K inhibitor ZSTK474 (Figur 4C).
A) Caspase 3 aktivering i C42Luc og C42LucBAD2SA celler som uttrykte en fosforylering-mangel BAD mutant. Celler ble behandlet med 100 ug /ml cykloheksimid i 6 timer før analysen. *,
p
0,01. B) Analyse av apoptose av time-lapse mikroskopi. C42Luc celler ble transient transfektert med en doksycyklin-induserbar HA-BAD2SA eller villtype-HA-BAD, og behandlet med doksycyklin (Dox) 48 timer etter transfeksjon. Etter 18 timer med Dox behandling ble cellene behandlet med 100 ug /ml sykloheksimid, og den kumulative prosentandelen av apoptotiske celler ble bestemt ved tidsforløp mikroskopi. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser standardavvik fra gjennomsnittet av fire tilfeldig utvalgte felt. *,
p
0,01 #
p
0,03. Inset viser Western blot analyse av fosforylert BAD (pBAD112) og total BAD uttrykk i C42Luc celler samles 18 timer etter Dox behandling. Lavere band tilsvarer endogent protein, mens de øvre båndene tilsvarer å indusere uttrykt HA-BAD konstruksjoner. C) C42Luc-celler ble behandlet med 100 ug /ml cykloheksimid i kombinasjon med 10 uM ABT-737, et BH3 mimetiske basert på den BH domenet av BAD eller ZSTK474. Apoptose ble analysert ved time-lapse mikroskopi. Akkumulert celledød på angitte tidspunkter vises. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser standardavvik fra gjennomsnittet av fire tilfeldig utvalgte felt. *,
p
0,01 **,
p
0,05 #
p
0,001 ##,
p
0,002 .
Samtidig BAD defosforylering og MCL-1 tap er tilstrekkelig til å indusere rask apoptose i C42 celler
for å bekrefte at BAD defosforylering og MCL-1 tap er tilstrekkelig til å indusere rask apoptose, C42Luc celler ble ko-transfektert med BAD2SA og MCL-1shRNA, og apoptose ble evaluert av time-lapse mikroskopi. Celler co-transfektert med BAD2SA og MCL-en shRNA viste signifikant mer apoptose i forhold til celler transfektert med kombinasjonen av WT-BAD og MCL-en shRNA eller BAD2SA og egge shRNA (figur 5). Disse resultatene identifisere BAD og MCL-en som sentrale aktører i å regulere apoptose i C42Luc prostatakreftceller.
C42Luc celler ble ko-transfektert med enten MCL-1-spesifikk shRNA eller egge shRNA i kombinasjon med enten BAD2SA eller WT-BAD konstruere. 48 timer etter transfeksjon, ble apoptose analysert av time-lapse mikroskopi. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser standardavvik fra gjennomsnittet av fire tilfeldig utvalgte felt. *,
p
0,05 **,
p
0,005 ***,
p
. 0,001
Å ta det generelle apoptoseinduksjon av kombinasjonen av cycloheximide og ZSTK474 i prostatakreftceller, vurdert vi apoptose i WFU3, PC3 og DU145 cellene ved time-lapse mikroskopi og caspase-3 fluorometriske analyser. PTEN
– /- mus WFU3 prostata epitelceller viste induksjon av apoptose kan sammenlignes med C42Luc celler (figur S2). I motsetning til dette, induksjon av apoptose i PC3 og DU145-celler ved kombinasjon av cykloheksimid og ZSTK474 var vesentlig mindre i forhold til C42Luc celler (sammenlign figur 1A og 6C), til tross for defosforylering av BAD og tap av MCL-1-ekspresjon i behandlede celler (figur 6A, B, C). Men når disse cellelinjene ble ko-transfektert med ekspresjonsvektorer som koder for MCL-1 shRNA og BAD2SA med muterte fosforyleringsseter, ble betydelig induksjon av apoptose observeres i alle cellelinjer (figur 6D, figur 5). Dette resultatet førte oss til hypoteser som forskjellig følsomhet for apoptose i cellelinjer kan avhenge uttrykk profiler av BCL2 familien i disse cellene.
A) Behandling med kombinasjon av cycloheximide og ZSTK474 utløser MCL-1 tap i PC3, C42Luc og DU145 cellene, samt BAD defosforylering i PTEN-mangel PC3 og C42Luc celler. Cellelysater forberedt 6 timer etter behandling ble analysert for pS112BAD, totalt DÅRLIG, og MCL-en, ved hjelp av β-actin som en lasting kontroll. Apoptose i C42Luc, PC3, DU145 og celler ble bestemt ved (B) å måle kaspase 3 aktivitet med fluorogent substrat eller (C) ved tidsforløp mikroskopi. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser standardavvik fra gjennomsnittet av fire tilfeldig utvalgte felt. D) knockdown av MCL-1 og ektopisk ekspresjon av fosforyleringen-manglende BAD var tilstrekkelig til å indusere apoptose i prostatakreftceller. PC3 eller DU145 cellene ble ko-transfektert med MCL-1-spesifikk shRNA eller egge kontroll shRNA i kombinasjon med enten en BAD2SA eller WT-BAD uttrykk konstruere. 48 timer etter transfeksjon, ble apoptose analysert av time-lapse mikroskopi. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser standardavvik fra gjennomsnittet av fire tilfeldig utvalgte felt.
Ja, det har vært tidligere rapportert at PC3 celler uttrykker høyere nivåer av BCL-XL, mens DU145 cellene viser redusert uttrykk av BAX ( fig. 7A) [33], [34]. Siden det er blitt vist at knockdown av BCL-XL sensitizes celler til apoptose [35], vi fokusert på å teste rolle BAX-ekspresjon i apoptotisk respons av DU145-celler. DU145-celler ble transfektert med GFP-BAX eller GFP ekspresjonsvektorer, og apoptose i GFP-positive celler ble etterfulgt av time-lapse mikroskopi. DU145-celler transfektert med GFP-BAX viste økt apoptose ved behandling med en kombinasjon av ZSTK474 og cykloheksimid. Dermed gjenoppretter BAX ekspresjon følsomheten DU145 prostatakreftceller til apoptose indusert av kombinasjonsbehandlinger (figur 7).
A) Western blot-analyse av BAX-ekspresjon i PC3, C42Luc, og DU145-celler. Cellelysater fremstilt 6 timer etter behandlingene ble probet med antistoffer mot BAX og β-aktin. B) Western blot-analyse av celler transfektert med grønt fluorescerende protein (GFP) eller GFP-BAX-kimer. C) Uttrykk for GFP-BAX akselererer apoptose i DU145 cellene. Cellene ble transfektert med GFP eller GFP-BAX og apoptose ble analysert ved time-lapse mikroskopi. Minst 100 celler ble tellet for hver behandling. Feilsøylene viser standardavvik fra gjennomsnittet av fire tilfeldig utvalgte felt.
Diskusjoner
mekanistisk forståelse av induksjon av apoptose er nødvendig for å forbedre effektiviteten av PI3K hemmere
feilregulering av PI3K veien har blitt godt dokumentert i en rekke krefttyper, med ca 40% endret PI3K signaliserer at primær prostata svulst områder [36], [37] og 100% endrede signal ved metastaser [38]. I prostata cancer, de primære mekanismer for PI3K feilregulering er tap av funksjon av PTEN gjennom homozygot delesjoner, tap av heterozygositet eller inaktiverende mutasjoner, som fører til konstitutiv aktivering av PI3K /Akt signalering. Den funksjonelle tap av PTEN er assosiert med fremskreden kreft progresjon, høy Gleason grad, og generelt dårlig prognose, som understreker behovet for kjemoterapeutiske alternativer for svulster med aktiv PI3K /Akt signaliserer [39] -. [41]
Flere små molekyl hemmere av PI3K veien, inkludert de pan-PI3K hemmere ZSTK474 (Zenyaku Kogyo Co) og BKM120 (Novartis), og den doble PI3K /mTOR-hemmer BEZ235 (Novartis) har allerede inngått en tidlig fase kliniske forsøk for behandling av solide maligne , inkludert prostata kreft [42] – [44]. Imidlertid har tidligere forsøk ikke rapporterer betydelige forbedringer i kliniske resultater [45], [46].
En bedre forståelse av mekanismene for kreftcelle motstand til PI3K inhibering er nødvendig for å velge optimale terapeutiske regimer for tumorer med aktive PI3K signalering. Spesielt vil informasjon om proteiner som styrer apoptose i PTEN-mangelprostatakreftceller veilede valg av midler for å øke følsomheten av prostata kreft celler til apoptose.
BAD og MCL-en er kritiske apoptose regulerende molekyler i prostata kreftceller
Vårt tidligere arbeid beskrevet et signal nettverk av konvergente signalveier som styrer BAD fosforylering og dermed apoptose i prostatakreftceller [20]. Vi viste også at BAD knockdown gjør PTEN-mangelprostatakreft LNCaP celler ufølsomme til apoptose indusert av PI3K hemmere. Disse tidligere data, sammen med resultatene som presenteres her viser økt apoptose i celler som uttrykker fosforylering-mangel mutant BAD2SA, tyder på at BAD er en kritisk regulator av apoptose målrettet av PI3K signalering. Således synes dårlig fosforylering å være et nyttig biomarkør for å forutsi anti-tumor effekt av PI3K-inhibitorer. Analyse av BAD fosforylering er spesielt relevant med tanke på at andre signalveier aktivert av reseptor tyrosin kinaser og G-protein koblede reseptorer kan fosforylere BAD selv når PI3K veien er inaktiv. Således, til tross for Akt defosforylering (rutinemessig brukt som en markør av PI3K sti-aktivitet), cellene kan ikke gjennomgå apoptose dersom BAD fosforyleres av andre signalveier.
Våre data viser at dårlig defosforylering i seg selv er utilstrekkelig til å fremkalle hurtig apoptose i prostatakreftceller. Analyse av mekanismene for hurtig apoptose indusert ved en kombinasjon av PI3K-inhibitorer og oversettelses inhibitorer identifiserte MCL-en som en kritisk apoptose regulerende molekyl. Dens uttrykk, da redusert, samarbeider med BAD i indusere apoptose. Både BAD og MCL-en er allestedsnærværende uttrykt i prostatakreft [28] og kan dynamisk regulert av fosforylering [20] (i tilfelle dårlig), og begge fosforylering og ubiquitylation (i tilfelle av MCL-1) [47].
Overuttrykte MCL-en har vært forbundet med avansert prostatakreft, inkludert høy Gleason grad primærsvulster og metastatiske svulster, og blodkreft maligniteter [28], [48]. MCL-en har blitt identifisert som en kritisk regulator av celle overlevelse, og er gjenstand for flere nivåer av regulering. Transkripsjonelt, blir MCL-1 mRNA-nivåer hurtig indusert av en rekke signaloverføringsveier, inklusive MAP /ERK, PI3K /akt, og JAK /STAT veier, med avvikende aktivering i en rekke forskjellige maligniteter [49]. MCL-1 mRNA er også strengt regulert av mir29 b [50]. MCL-1 protein har en høy omløpshastighet gjennom ubiquitin-avhengige protein nedbrytning av 26 S proteosom. Hos friske celler, BH3 domenet til MULE E3 ligase binder seg til den hydrofobe sporet av MCL-en spesielt og fortrenger sin interaksjon med BAK og BH3-bare voktere [51]. MCL-1 er fosforylert av glykogen syntase kinase-3β (GSK3P) i stressede celler hvor det PI3K /Akt veien er inaktiv, og primet for ubiquitinering av E3-ligase β-TrCP [27], [47]. Den høye omsetningen av MCL-en tillater dynamisk regulering av MCL-1 uttrykk på nivåene av transkripsjon, oversettelse, og degradering. Disse flere nivåer av regulering markere rollen MCL-en som en kritisk apoptose regulator og attraktivt terapeutisk mål, så vel som en potensiell biomarkør.
Tidligere MCL-1 er implisert i anti-apoptotiske signalering av IL-
