Abstract
Innledning
Fysiologisk relevant preklinisk
ex vivo
modeller recapitulating CNS tumor mikromiljø kompleksitet vil hjelpe utviklingen av biologisk målrettede midler. Vi presenterer omfattende karakterisering av tumor aggregater generert ved hjelp av 3D Rotary Cell Culture System (RCC).
Metoder
CNS kreftcellelinjer ble dyrket i konvensjonelle 2D kulturer og RCC og sammenligning med en kohort 53 pediatriske høy klasse hjernesvulst utført av genom bredt genuttrykk og mikroRNA arrays, kombinert med immunhistokjemi,
ex vivo
magnetisk resonans spektroskopi og narkotika følsomhet evaluering ved hjelp av histondeacetylase inhibitor, Vorinostat.
Resultater
Makroskopisk RCC aggregater rekapitulert den heterogene morfologi av hjernesvulster med en distinkt prolifererende rim, nekrotisk kjerne og oksygen spenning gradient. Genekspresjon og mikroRNA analyser viste signifikante forskjeller med 3D uttrykk middels til 2D kulturer og primære hjernesvulster. Metabolsk profilering viste differensial profiler, med en økning i tumorspesifikke metabolitter i 3D. For å vurdere potensialet i RCC som et stoff testverktøy, bestemt vi effekten av Vorinostat mot aggregater av U87 og KNS42 glioblastom celler. Begge linjene demonstrert kraftig redusert følsomhet når analysering i 3D kultur forhold sammenlignet med klassiske 2D narkotika skjermen tilnærminger.
Konklusjoner
Vårt omfattende karakterisering viser at 3D RCC kultur av høy klasse hjernekreftceller har dyptgripende virkninger på de genetiske, epigenetiske og metabolske profiler av dyrkede celler, med disse cellene bosatt som en mellom fenotype mellom den for 2D kulturer og primære svulster. Det er et avvik mellom 2D kultur og kreft molekylære profiler, og RCC delvis gjen kapitulerer vev spesifikke funksjoner, slik at narkotika testing i en mer relevant
ex vivo
system
Citation. Smith SJ, Wilson M, Ward JH, Rahman CV, Peet AC, Macarthur DC, et al. (2012) gjentagelse av Tumor Heterogenitet og molekylær signaturer i et 3D Brain Cancer Modell med redusert følsomhet til histondeacetylase Hemming. PLoS ONE 7 (12): e52335. doi: 10,1371 /journal.pone.0052335
Redaktør: Daniel Monleon, Instituto de INVESTIGACION Sanitaria INCLIVA, Spania
mottatt: 16 juli 2012; Godkjent: 16 november 2012; Publisert: 18.12.2012
Copyright: © 2012 Smith et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Samantha Dickson hjernesvulst Trust, Gentleman Night Out Charity og Joseph Foote hjernesvulst Trust. RR er en Nottingham Advanced Research Fellow og SJS er et nasjonalt institutt for Helse /UIN Clinical Fellow. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hjernesvulster svulster~~POS=HEADCOMP er den ledende årsak til kreft dødsfall hos barn og voksne opp til 40 år, sto for 10.000 tapte års forventet levetid årlig i Storbritannia. Høy grad av invasiv hjernekreftformer gjenta seg til tross for multimodal terapi; dermed er det et presserende behov for å utvikle nye behandlingsstrategier for å bedre resultatet. Ubalansen i sammensatte efficacies mellom
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter har betydelig hemmet oppdagelsen og utviklingen av en mer effektiv og variert bevæpning av kjemoterapeutika [1]. Som et resultat, vil bare ~ 5% av kreftlegemiddelkandidater som angir kliniske forsøk noensinne får godkjenning fra USA Food and Drug Administration, som representerer en stor økonomisk og klinisk byrden [2], [3]. Mangelen på pediatriske hjernetumormodeller i særdeleshet, har ført til at kjemoterapi medikamenter som for tiden er foreskrevet hadde vært opprinnelig utviklet for behandling av voksne sentralnervesystem (CNS) og andre faste tumorer. Dette ignorerer akkumulere bevis for at barn og voksne hjernesvulster, men histologisk lignende er molecularly distinkt [4] og dermed havna distinkte onkogene mutasjoner som kan gi nye terapeutiske mål. Som neste generasjons terapi beveger seg mot spesifikke biologiske og sti-relaterte mål, evaluering av legemidlets effekt og forbedret behandling vil oppnås ikke bare gjennom romanen medisiner, men også gjennom bedre pre-kliniske
ex vivo
modeller som bedre recapitulate mikro-miljø kompleksitet [5]. Det er en økende forståelse for intratumoral heterogenitet av hjernetumorer høy grad med eksistensen av forskjellige cellepopulasjoner i den samme tumor at hver vise forskjellige molekylære endringer [6]. Nåværende prekliniske narkotika testing modeller ikke gjenskape disse viktige funksjonene.
To-dimensjonale (2D) monocellekulturer representerer en svært reduksjonistisk modell av kreft på grunn av tap av fysiologisk ekstracellulære matrix (ECM) på kunstig plast flater. Følgelig celler under disse betingelser tilpasses ved å endre genuttrykksmønster og signaleringsnettverk, mister relevante egenskaper slik som differensiering, polarisering og celle-celle-kommunikasjon, og kunstig fremme hyper-proliferasjon [1], [7]. Den enkle narkotika opptak til en homogen cellepopulasjon på heft 2D overflater, også sannsynlig resulterer i en overvurdering av effekt bestemmes fra
in vitro
cytotoksiske skjermer, noe som fører til ineffektivitet av kandidatmidler
in vivo
[8]. Videre 2D kulturer mangler komplekse 3D vev struktur og dermed hemme arbeidet med å teste effektiviteten av visse kandidat forbindelser som anti-angiogene /vaskulær agenter før
in vivo
strategier [8]. Faktisk 2D cytotoksiske skjermer nesten utelukkende identifiserer anti-proliferativ kandidatmidler [9], [10].
Det er en økende erkjennelse konseptuelt at tre-dimensjonale (3D) kultur teknologier kan mer nøyaktig gjenspeile svulst patofysiologi og rekapitulere den
in vivo
svulstens mikromiljø
in vitro
. Som farmakologiske responser i xenograft studiene ikke konsekvent korrelerer med klinisk respons, er det viktig at bedre menneske-spesifikke prediktive modeller er utviklet på et preklinisk stadium. Derfor bør disse modellene bedre informere xenograft studier og tidlige kliniske studier når det gjelder å forutsi den farmakologiske responsen på kjemoterapeutiske stoffer [11], [12], [13] og dermed også redusere behovet for betydelig antall dyr for anti-kreft narkotika testing .
Multicellulære kulene er små
in vitro
aggregater som strekker seg fra 100-1000 mikrometer i diameter og vanlig dyrket i suspensjon ved hjelp av spinnerflasker, kollagen gel og væske-overlegg [14]. Størrelsen av den dyrkede sfæroide er begrenset til mindre enn 1 mm ved skjærkrefter i dyrkningssystemet og mangel på indre samhold /ECM innenfor den sfæroide. Geometrien av den sfæroide bidrar til dannelsen av heterogene cellepopulasjoner: det ytre lag prolifererer forhold til monolagskulturer; det indre lag av celler kan bli hvilende; og kjernen av sfæroider kan utvikle nekrose [15]. Proliferasjonen av tumorceller dyrket i 3D-kuler er vanligvis langsommere enn for monolagskulturer, oppviser forskjellige metabolske profiler og vanligvis viser redusert sensitivitet overfor kjemoterapi og radioterapi [7], [16], [17], [18], [19] , [20]. For eksempel cytosinarabinosid (Ara-C) og Taxol som hemmer spredning av glioblastom cellelinjer i 2D kulturer, men har ikke klart kliniske studier viser betydelig lavere sensitivitet i 3D kulturer; en Ara-C doser 10 ganger høyere enn den effektive dose i 2D kulturer var nødvendig for å redusere tumorcelle-proliferasjon [21], [22], [23]. En nyere 3D spheroid kultursystem fra Eccles og kollegaer har gitt automatisert, kvantitativ bildekapasitet som er potensielt kompatibel med høy gjennomstrømming prekliniske rettet mot studier og kan redusere kravet til dyreforsøk. Videre funksjonelle analyser av tumor migrering og invasjon er tillatt i dette systemet, noe som letter legemiddelscreening som dekker et bredt område av forbindelser [24]. Konsekvent, er genekspresjonssignaturer av primære cellekulturer holdes i sfæroide kulturer slik som glioblastoma [25], [26].
Biologiske geler som Matrigel har også vært brukt som et substrat for vekst sfæroide. Matrigel er en basalmembran ekstrakt avledet fra Engelbreth-Holm-sverm mus sarkom som inneholder et variert utvalg av komponenter, inkludert kollagen type IV, laminin og andre ECM-molekyler, i tillegg til løselige signaler slik som cytokiner og vekstfaktorer [27]. LaBarbera og kolleger vist at kreftrelaterte fenomener som epitelial-mesenchymale overgang med metastatisk brystkreft svulster kan rekapitulert i 3D matrigel baserte spheroid kultur, et system i tillegg brukes som en high-throughput screening verktøy for små molekyl hemmere for brystkreft [28 ]. Men som Matrigel er en stor grad udefinert og variabel blanding av proteiner, det har ikke blitt brukt mye for narkotika screening formål. Porøse kollagen /hyaluronic stillaser gi en mer fysiologisk relevant
in vitro
modell som tillater samspillet mellom ulike celletyper og ECM som beskrevet nylig for mammary epitelceller og adipocyte co-kulturer [29]. Andre bryst kreft 3D-modeller har nylig blitt beskrevet hvor ondartet brystkreft celler er innebygd i rekonstituert basalmembran med direkte co-kultur av endotelceller, slik undersøkelse av stimulerende effekten av den sistnevnte celletype [30]. Suspensjonskulturer som spinnerflasker har blitt undersøkt, men er ofte hindret av skjærspenning og turbulens [31] effekter oppleves av cellene.
En fremgangsmåte for generering av 3D-aggregater i et ikke-turbulent miljø og hvor celler utskiller endogent ECM og vekstfaktorer er Rotary Cell Culture System (RCC ™), opprinnelig utviklet av National Aeronautics and Space Administration (NASA) for å studere effekter av mikrogravitasjon på celler og vev [32]. Systemet har blitt brukt i tissue engineering [33], utviklingsbiologi [34] og mikrobiologi [35]. Den RCC metoden har blitt utvidet til tumorcelle forplantning (f.eks i prostata kreft [36] og endetarmskreft [37]) hvor minimal skjærkraft og kontinuerlig suspendert «fritt fall» kultur oppmuntrer celle aggregering. Dette tillater biologiske /biokjemiske prosesser for å utvikle seg under nøye overvåket miljø- og driftsforhold og oppmuntrer celler til å danne 3D vev-lignende aggregater som oppviser fysiologisk relevante fenotyper som for eksempel lavere formeringshastigheten, hypoksiske områder og blodkar [1]. Ingen tidligere utgivelser har spesielt undersøkt hjernetumorvekst i RCC eller gjort sammenligning mellom 2D kultur, 3D kultur og faktiske hjernesvulst prøver. Analyse av genuttrykk, mikroRNA og metabolske profiler viser at våre RCC aggregater (i forhold til 2D monolagkulturer) vise en genotype betydelig mer lik selve hjernesvulster og kan dermed gjenskape tumor atferd (f.eks respons til terapeutiske midler) mer trofast. I tillegg kan aggregater 3D være dyrket i minst opp til 4 uker, sammenlignet med ca. en uke i 2D monolagskultur (på grunn av celle konfluens), som gir et middel for å vurdere medikament-effektivitet og gjentatt dosering over en lengre tidsperiode. Ingen kunstige matrise eller ECM komponenter er innført, slik at cellene til å produsere sine egne strukturer og uten kunstige barrierer mot diffusjon medikament. Den økte størrelse og heterogeniteten til RCC aggregater i forhold til andre dyrkningsmetoder, f.eks Neurosfærene eller flercellede kuler, øker deres fysiologiske relevans, slik at narkotika testing mot en simulering av en hel svulst snarere en valgt cellelinje sub-klone som i 2D eller neurosfærer. Kritisk, aggregater RCC skjermen merket intern heterogenitet med separate bestander av proliferative, senescent og nekrotiske celler, påvirket delvis av skiftende oksygenkonsentrasjonen fra kant til kjerne av samlet. Dette sammenfatter unikt utvalg av
in vivo
miljø nisjer innen hvilke kreftceller bor og som nå tenkt kritisk til tumorutvikling og progresjon.
I denne studien har vi søkt å sammenligne neoplastisk histologi , morfologi, sprednings priser, gen og mikroRNA ekspresjon, metabolske profiler og histone deacetylase inhibitor følsomhet mellom 2D-monolagskulturer og 3D-tumorcelleaggregater som genereres ved hjelp av RCC ™, for å evaluere deres relevans for grunnleggende kreft i hjernen sykdom modellering og pre-klinisk medikament oppdagelse. Så vidt vi vet, er dette den første omfattende molekylær karakterisering av hjernesvulst aggregater dyrket ved hjelp av RCC, viser betydelig likhet i uttrykket nivåer av viktige neoplastiske gener til faktiske svulster og den første rapporten fra RCC narkotika følsomhet i forhold til 2D kulturer.
Materialer og Metoder
Cell Lines – to og tredimensjonal Kultur
følgende etablerte cellelinjer ble benyttet i studien – KNS42 (pediatrisk GBM, en slags gave fra C. Jones , institutt for kreftforskning, London [38], [39]), U87MG (voksen GBM) [40], [41], PFSK-en (pediatrisk sentralnervesystemet primitive nevro-ectodermal svulst, kjøpt fra ATCC [42]) , DAOY (pediatrisk medulloblastoma, kjøpt fra ATCC [42], [43]), GB1 (in-house avledet pediatrisk høygradig gliom [42]), SF188 (pediatrisk glioblastom, [44], [45]) og HBMEC (human hjerne mikrovaskulær endotelceller, en slags gave fra Naveed Khan, University of Nottingham, [46], [47]). KNS42 ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) /F12, U87MG, DAOY, C6 og GB1 i DMEM, PFSK-en og HBMEC i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mellom 1640. Alle medier ble supplert med 10% (
v /v
) føtalt bovint serum (unntatt HBMEC som var i 20% (
v /v
) føtalt bovint serum), 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. De samme medium ble anvendt for hver cellelinje i 2D og 3D-kultur og alle kultur fant sted i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2 atmosfære, med unntak av hypoksiske kontrollene for Hypoxyprobe studie som ble foretatt i en hypoksisk kammer i en 1% O
2 miljø. 3D kultur utnyttet Rotary Cell Culture System (RCC) (Synthecon, Luxembourg) ligger i en cellekultur inkubator. Kultur ble igangsatt ved innføring av en 10 x
6-celler som en enkelt cellesuspensjon inn i en 10 ml kultur kar og innledningsvis rotert med 15 omdreininger per minutt (rpm). Når en synlig aggregat dannet, ble omdreiningshastigheten justert for å balansere Coriolis kraften mot tyngdekraften for å opprettholde aggregatet i stasjonær fritt fall. Aggregater ble høstet på tre uker med media blir endret to ganger per uke (50:50). Når de er høstet, ble aggregater enten fiksert i 4% (
w /v
) PFA eller lagringstid ved -80 ° C inntil nødvendig for videre analyse.
Utarbeidelse av RNA og Real Time PCR
Total RNA ble isolert fra celle pellets eller aggregater med
mir
Vana RNA isolering kit (Ambion, Austin, Tx). Revers transkripsjon til cDNA (inkludert genomisk DNA eliminering) ble utført ved hjelp av RT
2 First Strand Kit (SA biovitenskap, Frederick, MD). Array sanntid PCR ble utført ved anvendelse av SA Biosciences ekstracellulære matriks og adhesjonsmolekyler PCR-array (PAH-013A), å analysere 84 ECM relaterte gener, 5 kontrollpunkt gener og positive og negative kontrollbrønner (tabell S1), ved hjelp av en CFX96 real-time PCR maskin (BioRad, Hercules, CA). Validering real-time PCR for genomet brede data ble utført mot genene er oppført i tabell S2. Primer effektivitet ble beregnet, og ekspresjon av hvert gen beregnet i forhold til normal voksen hjerne-RNA (Firstchoice, Ambion) ved anvendelse av den modifiserte Pfaffl ligningen R = E
target ΔCT (CT målgenet kontroll-CT målgenet prøve) /E
kontroll ΔCT (CT kontroll genet kontroll- CT kontroll genet prøve) med GAPDH som kontroll genet.
Pasienter og vevsprøver
kohort av pasientprøver (n = 53) analysert i genuttrykk rekke var en gruppe tidligere utgitt [4] med data tilgjengelig på nettet (GEO tiltredelse antall GSE19578). Alle prøvene var
de novo
pediatriske høygradige gliomer innhentet
ante mortem
i Storbritannia Nevrokirurgisk sentre med alle diagnoser bekreftet av sentrale patologisk vurdering. Den kohort av prøvene analysert for mikroRNA uttrykk (n = 77, 72 personer) besto av 21 prøver også analysert i genuttrykket årsklasse, med de andre prøvene også anmeldt sentralt og alle primære pediatriske høy klasse hjernesvulst. Full samtykke og etisk godkjenning er innhentet for deres bruk i denne studien fra Storbritannia Barnas kreft og leukemi Group og lokal etisk og Trent MREC godkjenning (06 /MRE04 /86).
Gene Expression Array og mikroRNA Array
Gene uttrykk analyse ble utført på Affymetrix U133 plus2 plattform, med tredoble eksperimentelle gjentar for 3D-kulturer. MikroRNA analyse ble utført ved hjelp av Nanostring plattform (Nanostring Technologies, Seattle, Washington) mot 747 mennesker og virus mikroRNA arter (fullstendig liste over sonder og mål i tabell S3).
Magnetic Resonance spektroskopi (MRS)
tre ukers tumor aggregater ble høstet, vasket med PBS og flash-frosset i flytende nitrogen sikre ingen spor av PBS eller medium forble. Før NMR-analyse, ble celleaggregater tint ved romtemperatur, før den ble plassert inn i 4 mm zirkonia rotorer med 12 eller 50 ul innsatser, avhengig av prøvevolumet. Enhver gjenværende volum i rotoren var fylt med D
2O inneholdende spor av trimethylsilylproprionate-d4 for å hjelpe til kjemisk skift kalibrering. NMR-analyse ble utført på et Bruker HCD hr-MAS-probe med pulsede gradienter som er tilgjengelige i z-retningen. Sonden drevet ved en magnetisk feltstyrke på 500 MHz som genereres av en aktivt skjermet Oxford Instruments magnet med en 3-kanal Bruker Avance II konsollen. Eksempelspinne ble satt ved en hastighet på 4800 Hz og sonde temperaturen ble satt til 278 Kelvin for å minimalisere metabolsk aktivitet. Den NOESY-presat sekvensen ble brukt til å undertrykke vannsignalet og 16K datapunkter ble kjøpt til en spektral bredde på 16 sider i minuttet etter en 90 graders puls. Signal gjennomsnitt (256 eller 512) ble anskaffet, avhengig av signal til støyforhold i prøven, idet det 14 eller 28 minutter henholdsvis. Raw NMR data ble behandlet ved hjelp av Tarquin algoritme [48] for å hente ut mengder for følgende metabolitter: acetat (Ace); alanin (Ala); kolin (Cho); kreatin (Cr); glutation (Glth); glutamin (Gin); glutamat (Glu); glycin (Gly); guanidinoacetate (Gua); glycerophosphocholine (GPC); hypotaurin (h-Tau); myo-inositol (m-Ins); laktat (Lac); lipider (Lip); n-acetylaspartate (NAA); phosphocholine (PCH); scyllo-inositol (s-Ins); succinate (Suc) og taurin (Tau). Lac ble fjernet fra etterfølgende analyse på grunn av dens høye avhengighet av cellekulturmedier tilbaketrekning. Metabolittprofiler ble normalisert til deres sum og mengder ble skalert for å gi lik varians. En heatmap tomten ble generert med dendrogrammer på begge aksene beregnes ved hjelp av hele sammenhengen metoden.
Drug Testing og Alamar blå levedyktighet analysen
For 2D enkeltlag spredning analyser, U87 og KNS42 celler ble sådd ut på brønner av en 24-brønns plate ved en densitet på 5 x 10
4 celler per brønn. Alamar Blå proliferasjonsanalyse ble først foretatt 24 timer etter såing (betegnet dag 1) og gjennomført på tre påfølgende dager deretter. I korthet medium ble fjernet fra brønnene og cellene ble vasket to ganger med PBS for å sikre at ingen spor av fenolrødt var tilbake. Fersk PBS (1 ml) ble tilsatt til hver brønn inneholdende tumorceller etterfulgt av tilsetning av 100 ul Alamar blå indikatorfarge (Invitrogen, UK). Etter inkubering i 2 timer ved 37 ° C, ble 100 ul alikvoter overført til enkeltbrønner i en 96-brønns sort-bunnplaten i triplikat og fluorescensemisjonen målt ved 585 nm ved bruk av en plateleser (Tecan, Sveits). Brønner inneholdende 2D-celler ble erstattet med friskt medium, og denne fremgangsmåten gjentatt på dagene 2, 3 og 4 for å overvåke proliferasjon av hver cellepopulasjonen i løpet av tre dager. For 3D kultur spredning analyser, U87 og KNS42 celler ble dyrket som RCC tilslag på 10-15 rpm i 1 uke. Dagen etter ble utpekt Dag 1 av spredning analyse og alle påfølgende spredning målinger (vilkårlig fluorescens enheter) ble beregnet i forhold til dag 1 baseline lesing, og dermed sto for variasjoner i samlet størrelse etter en uke kultur. 3D-aggregater ble fjernet fra RCC fartøy og anbringes i enkeltbrønner i en 24-brønners vevkulturplate og vasket to ganger med PBS. Som ovenfor, ble 1 ml frisk PBS tilsatt til hver brønn inneholdende et aggregat, etterfulgt av tilsetning av 100 ul Alamar blå indikatorfarge (Invitrogen, UK). Etter inkubering i 2 timer ved 37 ° C, ble 100 ul alikvoter overført til enkeltbrønner i en 96-brønns sort-bunnplaten i triplikat og fluorescensemisjonen målt ved 585 nm ved bruk av en plateleser (Tecan, Sveits). Tumor aggregater ble senere returnert til UV-bestrålt RCC fartøy og 3D kultur gjenopptatt. Denne prosedyren ble gjentatt på dagene 2, 3 og 4 for å overvåke i sanntid spredning av aggregater i løpet av tre dager. Data for all proliferasjon analyser er presentert som gjennomsnittlig prosent cellelevedyktigheten av tre uavhengige eksperimenter med feilstolper indikerer standardavvik av gjennomsnittet (SEM). For cytotoksisitet analyser av 2D-monolagene ble celler sådd 24 timer før behandling i et konsentrasjonsområde på 0-10 uM og Alamar blå analyse utført etter 72 timers medikamenteksponering. For cytotoksisitet analyser av 3D-kulturer, ble celler dyrket i RCC i 1 uke for å tillate aggregater for dannelse, etterfulgt av fjerning av aggregatene fra RCC fartøy og plassere i enkeltbrønner i en 24-brønns plate. Den Alamar blå-analysen ble utført som tidligere beskrevet og status spredning på dette stadiet betegnes som grunnlinje. Aggregatene ble returnert til UV-steriliseres RCC fartøy og dyrket i media inneholdende Vorinostat (Selleck Chemicals, 5 mM stam) ved et konsentrasjonsområde på 0-30 uM. Spredningsanalyser ble gjentatt etter 72 timer legemiddeleksponering og data normalisert til baseline målinger for å ta hensyn til varierte aggregerte størrelser på grunn av stokastiske variasjonen i RCC 3D kultur.
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry ble utført i henhold til tidligere publiserte protokoller [49]. Aggregater ble formalinfiksert og voks innebygd før seksjonering. Antigen henting ble utført av dampende i citratbuffer i 40 minutter. Anti-Ki67 (Dako, monoklonalt mus anti-human Ki67-antigen, klon MIB-1) ble påført i 30 minutter ved romtemperatur ved 1:50 konsentrasjon. Anti-beta-galaktosidase (Abcam, muse-monoklonalt DC1 4C7) og anti-CDKN2A /p16INK4a (Abcam, mus monoklonalt 2D9A12), ble benyttet ved 1:1000 og 1:800 konsentrasjoner henholdsvis i én time ved romtemperatur. Sekundært antistoff (Dako 100 ul pepperrotperoksidase konjugert kanin anti-mus) ble brukt i tredve minutter ved romtemperatur før påføring av 3,3′-Diaminobenzidin kromogen. Positive kontroll vev var tonsil (Ki67) og colon carcinoma (beta-galaktosidase og p16). Immunhistokjemi for Ki67, p16 og beta-galaktosidase ble scoret av å telle positive kjerner som andel av totale kjerner innenfor flere høy drevet felt (minst tre for hver prøve). For vevsprøver på microarray, ble det mest positive området ( «hot-spot») for hver kjerne scoret. For cellekulturer som gjennomgår hypoxyprobe (Hypoxyprobe Inc., Burlington, MA) analyse ble hypoxyprobe reagens (pimonidazole) påført to timer før høsting på 200 uM konsentrasjon. Prøvene ble så løst som standard og immunhistokjemi utført ved hjelp av primære antistoff som følger med hypoxyprobe kit på 1:200 konsentrasjon. Positive kontroller ble utført under anvendelse av 2D-cellekulturer dyrket i et hypoksisk kammer ved 1% atmosfærisk oksygen. Negative kontroller ble utført ved å utelate det primære antistoff og også med monolayer celler dyrket i 21% oksygen, 5% CO
2 atmosfæriske forhold.
immunfluorescens
Ettlagskulturer celler eller 3D RCC aggregater var fiksert i 0,4% paraformaldehyd og blokkert i 5% normalt geiteserum /0,1% Triton-X i 1 time ved romtemperatur. For immunomerking, ble celler inkubert med anti-beta-galactosidase (Abcam, muse-monoklonalt DC1 4C7) ved hjelp av en 1:1000 fortynning over natten ved 4 ° C i et fuktet kammer. Cellene ble vasket og inkubert med anti-muse-fluor Alexa 555 (Dako) under anvendelse av en 1:300 fortynning i mørket ved romtemperatur. Kjerner ble visualisert ved hjelp av DAPI og fluorescens signalene ble registrert med en Leica DMRB oppreist fluorescerende mikroskop.
Scanning elektronmikroskopi
Tre dimensjonal kreft aggregater ble vasket tre ganger i frisk PBS og fiksert i 3% glutaraldehyd i 12 timer. Faste prøver ble deretter vasket tre ganger i PBS og dehydrert i ytterligere 12 timer etter eksponering overfor luft ved romtemperatur. Faste og dehydrert aggregater ble montert på aluminiums stubber og ble frese-belagt med gull på en argon dagens sats på 30 mA i 3 minutter. Cell morfologi og organisasjon i aggregatene ble visualisert ved hjelp av en scanning elektronmikroskop (SEM) (JEOL JSM-6060LV) på 10 kV.
biostatistiske Analyse
Analyse av genekspresjon og mikroRNA array-data var utført ved hjelp av Genespring pakken (Agilent, UK) med sammenligning mellom gruppene utført ved anvendelse av uparede to-halet t-test med Hochberg Benjamini-multippel forsøks korreksjon. Analyse av tabellen PCR data ble foretatt ved hjelp av den medfølgende Excel-basert statistikkpakke (SABiosciences). Pathway analyse ble utført ved hjelp av oppfinnsomhet IPA pakken (oppfinnsomhet systemer). SPSS programmet ble brukt til å gjennomføre student t-test og P-verdier ble betraktet som signifikant på mindre enn 0,05 hele.
Resultater
Makroskopiske 3D RCC Aggregater rekapitulere den heterogene Morfologi av primære hjernesvulster
Synlige makroskopiske celleaggregater ble observert etter 24-48 timer med å initiere kultur og oppnådde maksimal størrelse etter en uke med kultur. Diameter av aggregater var i stor grad sams for hver cellelinje anvendes, men varierte mellom forskjellige cellelinjer. De største aggregater ført ved bruk av PFSK-1-cellelinjen med opp til 9 mm diameter og KNS42 (opp til 5 mm). U87 dannet flere (5-10) mindre aggregater hver 1-3 mm i diameter. Helstøpt aggregater ble opprettholdt levedyktig i kultur for opptil seks uker, men ble vanligvis høstet på tre uker for molekylær og cellulær karakterisering.
Aggregater fra alle cellelinjer hadde lignende generelle reproduserbar morfologi med en svært mobil rim (typisk 100 -200 um tykke) av levedyktige celler, en mellomliggende overgangssone av blandet friske og døende celler og en sentral kjerne med lav celledannelse med de fleste av cellene nekrotisk eller apoptotiske (figur 1 A-H). For den utledede GB-1 cellelinjen, sammenlignet var mulig med den opprinnelige primærtumor og dette viste meget lik morfologi og cellulær vekst tetthet med et gjennomsnitt på 424 celler pr høy drevet felt (HPF) for primærtumor og 398 celler pr HPF for 3D-aggregat (ingen statistisk signifikant forskjell; p = 0,452) (figur 1 i-J). 3D-aggregater også lignet svulster i sin re-kapitulasjon av heterogenitet med høy og lav cellularity regioner. Den høye cellularity rim og lav cellularity kjernen ble også visualisert med scanning elektronmikroskopi med utskilling av ekstracellulære matriseelementer observert som 3D-aggregatene begynte å legge ned endogen ECM (figur 1 K-L). I kontrast, GB-en 2D monolagcellene vise en mer homogen morfologi hele kulturen fartøyet uten forskjellige regioner romlig (figur 1 m).
A-D -Lav kraft utsikt over deler av formalinfiksert parafin innebygd GB1, U87, DAOY og PFSK-1 aggregater henholdsvis demonstrerer lav cellularity nekrotisk kjerne og tett cellulær proliferativ rim. E-H – Høy effekt utsikt over GB1, U87, KNS42 og PFSK-1 henholdsvis demonstrere mobil heterogenitet på felgen /core grensesnitt og nekrotisk vev med apoptotiske tall i kjernen. I J – GB1 aggregat, og prøve av primærtumor fra hvilken cellelinje ble avledet henholdsvis viser likheten i cellulær morfologi og veksttetthet. K L – Scanning elektronmikroskopi av GB-en RCC aggregater med tett rim og utsatt kjernen i K og høy drevet overflaten visning i L. M – Morfologi av GB-1 2D monolagcellene. Skala barer 100 mikrometer i A-D og 25 mikrometer i E-J og M. Forstørrelse × 500 i K og × 2000 i L.
RCC Aggregater Vis Cellular Heterogenitet og Reduserte Formerinasanalyse priser
Immunhistokjemi for Ki67 viste det store flertall av proliferative celler i 3D-tilslag for å være innenfor felgen eller overgangssone, med ingen eller svært få positive celler i den sentrale kjerne (figur 2 A-C). Den nøyaktige mønster av flekker variert litt mellom cellelinjene, men alle linjene utstilt disse generelle karakteristikker. Beising for p16 og beta-galaktosidase, markører for cellulær senescens, viste tilsvarende resultater, idet begge antistoffene farget en mye høyere andel av cellene i kjernen i forhold til felgen. For KNS42 linje, P16 farget 90% av cellene i kjernen, og 40% av cellene i felgen, mens beta-galaktosidase farget 47% i kjernen og 1% i felgen. Dette mønsteret ble gjentatt for alle de andre cellelinjer (data ikke vist). Både P16 og beta-galaktosidase viste en tilsvarende andel av positiv farging i kjernen av primære tumorer sammenliknet med kjernen av 3D-aggregater (figur 2 D-I). Immunhistokjemi for disse målene ble også utført mot vår kohort (n = 150) av de pediatriske høy klasse gliom arkiv eksemplarer på microarray. Vi fant en statistisk signifikant sammenheng mellom Ki67 flekker i perivaskulær områder og pasientoverlevelse som tidligere rapportert [49].
