Abstract
Spontan CD4
+ T-celle responser til tumorspesifikt antigen NY-ESO-1 (ESO) er ofte funnet hos pasienter med ovarialcancer (EOC). Dersom disse reaksjonene er av effektor- eller /og treg typen har imidlertid forblitt uklart. Her har vi brukt funksjonelle tilnærminger sammen med nyutviklede MHC klasse II /ESO tetramers å vurdere frekvens, fenotype og funksjon av ESO-spesifikke celler i sirkulerende lymfocytter fra EOC pasienter. Vi fant at sirkulerende ESO-spesifikke CD4
+ T-celler i EOC pasienter med spontane immunresponser mot antigenet er prevalently T
H1 typeceller utskiller IFN-γ men ingen IL-17 eller IL-10, og er ikke undertrykkende . Vi oppdaget tetramer
+ -celler
ex vivo
, til en gjennomsnittsfrekvens på 1:25000 minneceller, som er betydelig lavere enn i pasienter immunisert med en vaksine ESO. ESO tetramer
+ celler var for det meste effektor minnecellene ved fremskredne stadier av differensiering og ble ikke oppdaget i sirkulerende CD25
+ foxp3
+ treg. Dermed spontan CD4
+ T-celle responser til ESO hos kreftpasienter er prevalently av T
H1 type og ikke treg. Deres relativt lav frekvens og avansert differensiering scenen, men kan begrense deres effekt, som kan bli styrket av immunogene ESO vaksiner
Citation. Redjimi N, Duperrier-Amouriaux K, Raimbaud jeg, Luescher jeg, Dojcinovic D, Classe JM et al. (2011) NY-ESO-1-Specific Sirkulasjons CD4
+ T celler i eggstokkreft pasienter er fremherskende T
H1 type celler Registreres ikke i CD25
+ foxp3
+ treg huset. PLoS ONE 6 (7): e22845. doi: 10,1371 /journal.pone.0022845
Redaktør: George Kassiotis, MRC National Institute for Medical Research, Storbritannia
mottatt: 25 mars 2011; Godkjent: 30 juni 2011; Publisert: 29.07.2011
Copyright: © 2011 Redjimi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Fondation de France, Cancer Research Institute og Ludwig Institute for Cancer Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
CD4
+ T-celle undergrupper spiller viktige og potensielt motsatt rolle i tumor immunosurveillance [1], [2]. Type I hjelper (T
H1) T-celler som utskiller signaturen cytokin IFN-γ, favorisere utviklingen av CD8
+ cytolytiske effektorer (CTL), og medierer effektive antitumorrespons. I kontrast, regulerende /suppressor T-celler (Treg), preget
ex vivo
av høy ekspresjon av IL-2R α-kjede (CD25) og avstamning-spesifikke transkripsjonsfaktor foxp3 og lavt uttrykk for IL -7R α-kjeden (CD127), antas å inhibere antitumorrespons [3], [4], [5], [6], [7]. Treg, som ikke klarer å utskille IFN-γ eller IL-2, har blitt rapportert å være tilstede i høyere mengdeforhold hos kreftpasienter, sammenlignet med friske individer [8], [9]. På grunn av at antigenet spesifisiteten av treg er stort sett ukjent, er det uklart om muligheten for treg til å inhibere antitumorrespons er relatert eller ikke tilstedeværelse /utbredelse blant dem av tumor-antigen-spesifikke CD4
+ T-celler.
NY-ESO-1 (ESO), et tumor-spesifikt antigen av kreft /testikkel gruppe ofte uttrykt i humane tumorer av forskjellig histologiske typer, inkludert eggstokk-kreft, men ikke i normale somatiske vev [10], [11 ], er en kandidat for utvikling av generiske kreftvaksiner [12]. ESO er svært immunogen og utløser spontan humorale, CD4
+ og CD8
+ T-celle-responser hos pasienter som bærer antigen-uttrykkende tumorer [11], [13], [14], [15]. I tillegg kan ESO-spesifikt antistoff, CD4
+ og CD8
+ T-celle responser fremkalles gjennom immunisering med ESO-baserte vaksiner [16]. Vi har tidligere identifiserte immunodominante regioner gjenkjent av ESO-spesifikke CD4
+ og CD8
+ T-celler [16] og har generert løselig fluorescerende MHC klasse I og, nylig, MHC klasse II /ESO-peptid-tetramerer som tillater direkte påvisning , fenotyping og isolering av ESO-spesifikke T-celler [17], [18]. Ved hjelp av MHC klasse II /ESOs peptid tetramers å vurdere spesifikke CD4
+ T celler i pasienter immunisert med rekombinant ESO protein administreres med Montanide ™ ISA 51 og GPG 7909, har vi vist at vaksineindusert ESO-spesifikke CD4
+ T-celler er prevalently T
H1 celler, oppdages
ex vivo
blant minne (CD45RA
-) celler, omfatter både sentrale minne (CCR7
+) og effektor minne (CCR7
-) populasjoner og ikke inkluderer betydelige andeler av treg [16], [17], [18]. Nylige studier har imidlertid antydet at, i motsetning til ESO-spesifikke CD4
+ T-celler primet ved vaksinering kan ESO-spesifikke CD4
+ T-celler i pasienter med spontan immunresponser inneholder betydelige andeler av treg [19 ] og at forhøyede mengder av sirkulerende treg hos kreftpasienter kan svekke deres respons til ESO vaksiner [20]. For å møte disse bekymringene, i denne studien har vi brukt funksjonelle tilnærminger, sammen med MHC klasse II /ESOs peptid tetramers å vurdere ESO-spesifikke celler blant konvensjonelle og treg CD4
+ T-celle undergrupper i sirkulerende lymfocytter av epitelial eggstokkreft (EOC) pasienter med påvisbare spontane immunresponser mot ESO
Resultater
Vurdering av minne konvensjonell CD25
-. og regulatoriske CD25
+ foxp3
+ CD4
+ T-celleundersett av sirkulerende lymfocytter fra friske donorer og EOC pasienter
Blant minne CD4
+ T-celler flere undergrupper kan skilles, basert på ekspresjon av CD25 og CD127. Mens konvensjonelle CD4
+ T-celler er CD25
-CD127
+, treg er CD25
+ CD127
– og foxp3
+ (figur 1A). En tredje befolkningen, CD25
-CD127
-, inneholder nylig aktivert og IL-10-produserende CD4
+ T-celler [21]. Mens CD25
-CD127
+ celler er de fleste av sirkulerende minne CD4
+ T-celler, treg og CD25
-CD127
– populasjoner er til stede i mye lavere og omtrent tilsvarende proporsjoner, som representerer hver ca 5%. Fordi tidligere rapporter har vist at treg populasjoner kan økes på sirkulerende lymfocytter fra cancerpasienter sammenlignet med friske individer, sammenlignet vi andelen av CD4
+ T-celleundergrupper på sirkulerende lymfocytter fra pasienter EOC til friske donorer. Vi klarte imidlertid å oppdage eventuelle signifikante forskjeller i andelen av sirkulerende Treg i pasienter sammenlignet med friske donorer (Figur 1b). Tilsvarende andel av CD25
-CD127
– CD4
+ T celler var ikke signifikant forskjellig mellom pasienter og friske donorer. For ytterligere å karakterisere CD4
+ T-celleundergrupper på sirkulerende lymfocytter fra pasienter EOC, vi isolert dem
ex vivo
, ved strømningscytometri cellesortering, stimulerte dem
in vitro
og vurdert kulturer 12 dager senere for deres evne til å skille forskjellige cytokiner. Som forventet, både hos friske donorer og pasienter, CD25
– populasjoner inneholdt signifikant høyere andeler av celler som utskiller IFN-γ sammenlignet med treg (figur 2). CD127
+ populasjoner inneholdt høyere andeler av IFN-y-sekresjon celler enn CD127
– populasjoner. Interessant, sammenlignet med friske givere, CD25
-CD127
– befolkninger fra kreftpasienter som inneholdt større mengder av IFN-y-sekreterende celler. I motsetning til dette, var andelen av IL-17- eller IL-10-utsondrende celler var ikke signifikant forskjellig mellom friske donorer og pasienter for noen av populasjonene.
A. CD4
+ T-celler ble farget med anti-foxp3, -CD25, -CD45RA og CD127 antistoff og analysert ved flowcytometri. Uttrykk av CD25 og CD127 definerer 3 bestander av minne (CD45RA
-) CD4
+ T-celler: konvensjonell CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– og treg CD25
+ CD127
– (venstre prikkplott, tallene tilsvarer andelen av hver undergruppe blant minne CD4
+ T-celler). Histogrammene viser ekspresjonen av foxp3 i det definerte lager CD4
+ T-celleundergrupper. B. Andelen av konvensjonell CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– og treg CD25
+ CD127
– undergrupper, definert i A, blant minne CD4
+ T-celler av friske givere (HD, n = 27) og pasienter (P, n = 18).
Ex vivo
-sorted minne konvensjonell, CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– og treg, CD25
+ CD127
-, populasjoner fra friske givere (HD, n = 12) og pasienter (P, n = 12) ble stimulert
in vitro
og dag 12 kulturer ble vurdert for IFN-γ, IL-10 og IL-17 produksjon, etter stimulering med PMA og ionomycin, i en 4-timers intracellulær cytokinsekresjon assay og analysert ved strømningscytometri. Prikkplott for en donor er vist i A og data for alle friske donorer og pasienter er oppsummert i B. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av en standard to-tailed
t
-test.
ESO-spesifikke sirkulerende CD4
+ T-celler fra EOC pasienter med spontan immunresponser er funnet i CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– populasjoner men ikke i CD25
+ CD127
-FOXP3
+ treg og skiller IFN-γ men ikke IL-17 eller IL-10
Ifølge tidligere studier, ca 40% av ovarietumorer uttrykke ESO og ca 30% av EOC pasientene bærer ESO-uttrykker svulster utvikle konkrete spontan antistoff (Ab) respons [22]. Vi vurderte Ab svar på ESO i en kohort av 110 EOC pasienter (Tabell 1) i pasientenes sera ved ELISA som beskrevet [14]. Vi har oppdaget at betydelige Ab respons på ESO i 8 (7%) av pasientene (figur 3A) ved titere som varierte mellom 1:500 og 1:50000 (figur 3B). Pasienter med målbart ESO Ab presenteres med høy grad (II, III) svulster i stadium III eller IV og med serøs histologi (tabell 1). For 6 pasienter, PBMC var tilgjengelig for analyse. For å vurdere ESO-spesifikke celler innenfor definerte sirkulerende minne CD4
+ T-celle undergrupper av disse pasientene isolert vi dem
ex vivo
av flowcytometri celle sortering, og stimulert dem med en pool av lange overlappende peptider spenner over ESO-sekvensen, som beskrevet [16]. Tolv dager senere, stimulert vi prøver av kulturene med ESOs peptid bassenget og vurderes konkret cytokin produksjon av intracellulær farging. Vi har oppdaget at betydelige andeler av celler som produserer IFN-γ svar på ESO i kulturer fra sirkulerende CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– CD4
+ T-cellepopulasjoner, men ikke fra treg (figur 4A og 4B). I motsetning til dette, fant vi bare lave andeler av celler som utskiller IL-10 eller IL-17 som respons på ESO i noen av populasjonene. Sammen utgjør disse resultatene indikerte at det store flertallet av sirkulerende ESO-spesifikke CD4
+ T-celler hos disse pasientene var T
H1 typen IFN-γ-sekresjon celler, CD25
– både CD127
+ og CD127
– og var ikke påvises i CD25
+ foxp3
+ treg
A.. Tilstedeværelsen av ESO-spesifikk Ab i pasientenes sera ble bestemt ved ELISA. Sera ble utgangspunktet vurderes på en 1:100 fortynning på Resö belagt eller på kontroll ubestrøket plater. Sera ble bedømt som ESO Ab
+ når den optiske tetthet (OD) verdier oppnådd på reso-belagte plater ble begge minst tre folder høyere enn de som oppnås for den samme prøve på ikke-belagte plater og høyere enn den midlere + 6xSD av OD verdier oppnådd med sera fra friske individer på reso-belagte plater (n = 53, bety + 6xSD = 750, data ikke vist). B. serielle fortynninger av ESO Ab
+ sera ble testet på Resö-belagte plater. Serum titer ble beregnet som serum fortynning som gir 50% av maksimal OD
Minne konvensjonell, CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
-., Og treg, CD25
+ CD127
-, populasjoner ble sortert
ex vivo
fra CD4
+ T-celler av ESO Ab
+ pasienter og stimulert
in vitro
med en pool av lange overlappende peptider som spenner over hele lengden ESO sekvens. A og B. Day 12 Kulturene ble bedømt for IFN-γ, IL-10 og IL-17 produksjon i en 4-timers intracellulær farging cytokin-analyse etter stimulering i fravær eller nærvær av ESO-peptidet bassenget. Prikkplott for en pasient er vist i A og data innhentet for alle pasienter er oppsummert i B. C og D. Day 12 kulturer ble farget med DR52b /ESO
119-143 (NA017, NA093 og NA097) eller DR4 /ESO
119-143 (NA304) tetramers og anti-CD4 mAb og analysert ved flowcytometri. Prikkplott for en pasient er vist i C og data for alle pasienter er oppsummert i D.
Vurdering av ESO-spesifikke T-celler i CD4
+ undergrupper ved hjelp av MHC klasse II /ESO peptid tetramers
en påminnelse av den eksperimentelle innstillingen som ble brukt ovenfor var at, mens ESO-spesifikke celler ble påvist basert på deres evne til å spesifikt skille ut IFN-γ i respons til ESO, treg utskilt litt IFN-γ selv på stimulering med PMA /ionomycin (figur 2). For å overvinne de begrensninger som følger av påvisning av ESO-spesifikke CD4
+ T-celler basert på funksjonelle analyser, har vi nylig utviklet løselig fluorescerende MHC klasse II tetramers som inneholder en immunodominant epitop fra ESO, tilsvarende peptid 119-143 [17 ], [18]. Vi har vist at MHC klasse II /ESO
119-143 tetramers beis ESO-spesifikke CD4
+ T-celler i sirkulerende lymfocytter av pasienter immunisert med en ESO rekombinant vaksine med høy effektivitet og spesifisitet, slik at deres direkte visualisering blant polyspesifikt CD4
+ T-cellekulturer. Fordi 4 pasienter med spontane immunresponser mot ESO uttrykt MHC klasse II alleler for hvilke egnede tetramerer var tilgjengelige (DR52b og DR4), vurderte vi ESO-spesifikke T-celler i disse kulturene ved tetramer farging (figur 4C og 4D). Vi oppdaget betydelige andeler av ESO tetramer
+ celler i kulturer fra CD25
-CD127
+ populasjoner fra alle pasienter, samt i de fra CD25
-CD127
– populasjoner (i tre pasienter med betydelig økt frekvens sammenlignet med CD25
-CD127
+ fraksjoner). Men i alle tilfeller, vi klarte å påvise betydelige andeler av tetramers
+ celler i treg kulturer. I tillegg til CD25
+ CD127
-FOXP3
+ Treg, undertrykkende CD4
+ T celler er også beskrevet i noen studier blant andre populasjoner [21]. For å vurdere om, uavhengig av deres fenotype, ESO-spesifikke CD4
+ -T-celler vises dempende funksjon, vi isolert dem fra kulturene ved tetramer- eller IFN-γ styrt cellesortering og vurderes dem funksjonelt i en undertrykkelse analyse som beskrevet [23], [24]. Som forventet, foxp3
+ Treg bestander samtidig vurdert som interne kontroller effektivt undertrykt veksten av responder celler. I motsetning til ESO-spesifikke celler isolert fra både CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
+ kulturer var foxp3
-. Og var ikke undertrykkende (figur 5)
ESO-spesifikke celler ble isolert fra peptid-stimulert CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– CD4
+ T-cellekulturer (figur 4) ved tetramer- guidet (NA017) eller IFN-γ-guidet (NA114) flowcytometri celle sortering og utvidet
in vitro
. De resulterende polyklonale kulturer inneholdt 80% ESO-spesifikke celler. A. ESO-spesifikke polyklonale kulturer, så vel som polyklonale kulturer fra ESO
– fraksjon og kontrollkulturer av
in vitro
-Utvidet konvensjonelt minne CD4
+ T-celler (M) og hukommelse (treg MTreg), isolert
ex vivo
fra friske personer, ble farget med foxp3 spesifikke mAb og analysert av flowcytometri. Tall i dot plots tilsvarer den midlere fluorescensintensitet (MFI) av foxp3 farging. B. Den undertrykkende aktivitet av ESO-spesifikk og tak polyklonale populasjoner ble bedømt ved ko-kultur med CFSE-merkede CD4 konvensjonell
+ T-celler, ved en responder: suppressor-forhold på 1:01, i nærvær av bestrålte og monocytter PHA. Dot plots viser CFSE-fortynning profil i fravær av testpopulasjonen (til venstre) og i nærvær av de angitte test populasjoner. Tall i histogrammer tilsvarer prosentandelen av udelte celler. Resultater som tilsvarer den beregnede% undertrykkelse vises for alle testede populasjonene.
Ex vivo
vurdering av ESO-spesifikke sirkulerende CD4
+ T-celler ved hjelp av MHC klasse II /ESO tetramers
for å bekrefte fordelingen av ESO-spesifikke celler i CD4
+ T-celle undergrupper hos pasienter med spontan immunresponser og videre vurdere sine proporsjoner og fenotype, vi farget totale sirkulerende CD4
+ T celler fra DR52b
+ pasienter
ex vivo
med ESOs tetramers i kombinasjon med mAb rettet mot markører som kjennetegner ulike differensieringsstadier av CD4
+ T-celler. Som vist tidligere [17], ESO tetramer
+ celler var ikke påvises i CD4
+ T-celler fra friske donorer. I motsetning til dette, ble de tydelig påvist
ex vivo
i sirkulerende hukommelse CD4
+ T-celler fra pasienten (figur 6A). Tetramer
+ celler i sirkulerende CD4
+ T-celler fra pasientene var jevnt CD25
– og ble funnet blant både CD127
+ og CD127
– populasjoner, men var ikke detekterbare blant CD25
+ CD127
– treg (figur 6B). Dermed ligner på det vi tidligere har sett hos pasienter immunisert med rekombinant ESO vaksine, direkte
ex vivo
farging med ESOs tetramers bekreftet mangelen på betydelige andeler av ESO-spesifikke CD4
+ T-celler i sirkulerende treg av pasienter med spontane immunologiske responser til antigen. Hyppigheten av sirkulerende ESO tetramerer
+ celler i pasienter med spontane reaksjoner, var, i gjennomsnitt, av 1:25000, fem folder lavere enn det man finner hos vaksinerte pasienter (figur 6A) [17]. Men ESO tetramer
+ celler hos pasienter med spontan respons inneholdt lavere andeler av CD127
– celler sammenlignet med de av vaksinerte pasienter (Figur 6b). I tillegg, i motsetning til sistnevnte, som inneholdt, i gjennomsnitt, omtrent tilsvarende andeler av CCR7
+ og CCR7
– celler, samt et stort flertall av CD27
+ celler, ESO tetramer
+ celler hos pasienter med spontan respons var for det meste CCR7
– og inneholdt økte andeler av CD27
– celler, i samsvar med en mer differensiert fenotype (figur 6C). Til slutt, for å utelukke at valg av ESOs Ab
+ pasienter kan ha valgt for pasienter med lav eller fraværende ESO-spesifikke treg, vurderte vi
ex vivo
CD4
+ T-celler fra ESO Ab
– DR52b
+ pasienter (n = 23). Men vi klarte å påvise betydelige nivåer av ESO tetramer
+ hos disse pasientene (data ikke vist).
CD4
+ T-celler fra DR52b
+ friske donorer (HD) og pasienter ble farget
ex vivo
med DR52b /ESO
119-143 tetramers og mAb spesifikt for CD45RA, CD25, CD127, CCR7 og CD27 og analysert av flowcytometri. A. Prikkplott for en HD og en EOC pasient vises. Tall i prikkplotter tilsvarer andelen tetramer
+ celler blant CD45RA
– minneceller. Data for alle EOC pasienter med spontane immunresponser mot ESO (S) er vist i forhold til frekvensen (gjennomsnitt ± SD) av ESO tetramer
+ celler i post-vaksineprøver fra pasienter som har mottatt et rekombinant ESO vaksine (V) [17]. B. Prikkplott viser uttrykket av CD25 og CD127 i totale minneceller og i tetramer
+ celler av en EOC pasient. Data som tilsvarer andelen av konvensjonelle, CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– og treg, CD25
+ CD127
-, populasjoner innen tetramer
+ -celler for alle EOC pasienter (S) er oppsummert og sammenlignet med andelen (gjennomsnitt ± SD) av disse populasjoner i vaksine-indusert tetramer
+ -celler (V). C. Prikkplott viser uttrykk for CCR7 og CD27 i totale minneceller og i tetramer
+ celler av en EOC pasient. Data tilsvarende andelen CCR7
+, CCR7
-CD27
+ og CCR7
-CD27
– populasjoner innenfor tetramer
+ celler for alle EOC pasienter (S) er oppsummert og sammenlignet med andelen (gjennomsnitt ± SD) av disse populasjoner i vaksine-indusert tetramer
+ -celler (V). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av en standard to-tailed
t
-test.
Diskusjoner
Sterke immunresponser mot kreft vev er potensielt i stand til å forebygge sykdomsutvikling. Fordi disse reaksjoner, ofte ikke utelukkende rettet mot tumorspesifikke antigener, men også mot differensiering eller annen selv-antigener, har potensial til å betydelig skade normale vev, robuste immunregulerende nettverk er på plass [25]. Spesielt CD4
+ CD25
+ foxp3
+ treg, involvert i å opprettholde vev homeostase og selvtoleranse, antas å spille en viktig rolle i å dempe kreft immunitet. Tidligere studier har rapportert økt andeler av treg i sirkulasjon av minst en del av pasienter med solide tumorer [8], [9] samt opphopning av CD25
+ foxp3
+ treg på kreftsider [8], [26], spesielt ved fremskredne stadier av sykdommen, og har etablert en sammenheng mellom frekvensen og kliniske resultater [3]. På basis av disse funnene, metoder for eliminering av treg har blitt utformet, og er allerede vurdert i kliniske omgivelser, selv om de er forbundet med risiko for å slippe løs auto-reaktivitet [27], [28], [29].
i denne studien, har vi adressert tilstedeværelsen og fordeling av CD4
+ T-celler som er spesifikke for tumorantigenet ESO, av kreft /testikkel gruppe [10], [30], [31], med sirkulerende CD4
+ T-celle undergrupper av EOC pasienter. Vi brukte en kombinasjon av funksjonelle tilnærminger og MHC klasse II tetramers inkorporerer en immunodominant peptid, ESO
119-143, som vi nylig har utviklet [17], [18]. Vi fant ingen signifikante forskjeller i andelen Treg blant sirkulerende lymfocytter av EOC pasienter sammenlignet med friske donorer. Tilsvarende fant vi ingen signifikant økning i andelen av totale sirkulerende CD4
+ CD25
-CD127
– T-celler, en populasjon som inneholder nylig aktiverte CD4
+ T-celler og har blitt foreslått å inneholde IL-10-sekresjon TR1 celler hos friske donorer [21], men hadde ikke vært vurdert i kreftpasienter før denne studien. Dermed, mens endringer i sirkulerende Treg rommet kan faktisk forekomme hos noen kreftpasienter, fant vi ingen store endringer i vår gruppe av EOC pasienter. Det er bemerkelsesverdig, men at pasientene vurdert i denne studien hadde mottatt kjemoterapi første linje, noe som kan midlertidig redusere Treg [32], selv om de ble vurdert ved forskjellige tidspunkter, men minst en måned etter avslutning av behandlingen. Men vurderingen av immunstatus for denne pasientgruppen, med hensyn til anti-tumorrespons, er mest relevant for utformingen av immunbaserte behandlinger.
Ved å vurdere ESOs spesifikke tiltak i sirkulerende CD4
+ T-celle undergrupper fra EOC pasienter med spontan immunresponser, sortert
ex vivo Hotell og stimulert
in vitro
med ESO peptider, vi har oppdaget betydelige andeler av cellene som produserer IFN-γ i respons til ESO, men ingen IL-10- eller IL-17-utskillende celler, noe som indikerer at de fleste av ESO-spesifikke CD4
+ T-celler var T
H1 effektorer. Fordi denne studien spesielt adressert T
H1-celler og treg i EOC, begrenset vi analysen til de mest relevante cytokiner, nemlig IFN-γ, IL-10, og på grunn av de rapporterte forhold mellom Treg og T
H17-celler IL-17. Det vil imidlertid være av interesse, i fremtidige studier, for å ta opp produksjonen av ytterligere cytokiner, slik som IL-4 eller IL-13, av ESO spesifikke CD4
+ T-celler. I tråd med den konklusjon at ESO-spesifikke CD4
+ T-celler isolert fra kulturer er effektorceller, gjorde de ikke viser signifikante undertrykkende funksjoner. I tillegg gjorde vi ikke oppdage ESO-spesifikke celler i sirkulerende Treg av pasienter med spontane immunresponser til antigen ved farging med MHC klasse II /ESO tetramers, av definerte konvensjonell og treg CD4
+ T-celle subpopulasjoner isolert
ex vivo
ved strømningscytometri cellesortering, samt ved direkte
ex vivo
farging med tetramers. I strid med våre data, har tidligere studier rapportert isolering av ESO-spesifikke CD4
+ T-celler med suppressive funksjoner fra sirkulerende lymfocytter hos pasienter med avansert melanom [19], [33]. Således, mens våre data ikke utelukker eksistensen av ESO-spesifikke treg, de innebærer at sistnevnte ikke blir ofte funnet i sirkulerende CD4
+ T-celler fra pasienter EOC. Det er også bemerkelsesverdig at, i samsvar med våre resultater, studier i musemodeller har undersøkt nærvær av treg i antigen-spesifikke T-celler med tetramerer og mislyktes i å detektere tetramer-bindende Treg [34], [35].
ved hjelp av MHC klasse II /ESO
119-143 tetramers
ex vivo
, kunne vi direkte sammenligne ESO-spesifikke CD4
+ T-celler spontant oppstår hos pasienter med de som fremkalles gjennom vaksinering med en rekombinant ESO protein (RESO) gis med Montanide ™ og CpG [16]. Det er bemerkelsesverdig at inntil den siste utviklingen av MHC klasse II /peptid-tetramerer, har det vært vanskelig å vurdere antigen-spesifikke CD4
+ T-celler
ex vivo
på grunn av deres generelt lave frekvens. Dette er faktisk den første rapport som karakteriserer CD4
+ T-celler spesifikke for et kreft /testikkel antigen hos kreftpasienter med spontane immunresponser
ex vivo.
Vi fant at frekvensen av CD4
+ T-cellene spesifikk for ESO var signifikant lavere hos pasienter med spontane immunresponser i forhold til det som finnes i vaksinerte pasienter. I tillegg fenotypen til naturlig oppstår ESO tetramer
+ -celler var mer differensiert, i forhold til sine vaksineinduserte motstykker, som inneholder økte mengder av CCR7
– og CD27
– celler. Tidligere studier som undersøker sammenhengen mellom kvaliteten på minne CD4
+ T-celle responser utløst av patogener eller vaksiner og deres fenotype, har antydet at en beskyttende minne respons bør omfatte ikke bare effektorer (CCR7
-), men minneceller på tidligere differensiering stadier, nemlig sentral minne (CCR7
+) og overgangs minne (CCR7
-CD27
+) T-celler [36], [37]. Basert på dette konsept, våre resultater tyder på at ESO-spesifikke CD4
+ T-celler indusert ved immunisering av kreftpasienter med den reso-vaksine er sannsynlig å være ikke bare kvantitativt, men også kvalitativt bedre enn dem som oppstår i løpet av spontane immunreaksjoner, noe som ytterligere oppfordrer til bruk av ESO-baserte vaksiner hos pasienter som bærer ESO-uttrykker svulster.
Sammen utgjør disse resultatene understreker potensialet av MHC klasse II /ESOs tetramers for entydig påvisning, kvantifisering og fenotyping av ESO-spesifikke CD4
+ T-celler, ikke bare etter vaksinasjon, men også for å vurdere immunresponsen som naturlig oppstår i pasienter som bærer antigen-uttrykkende tumorer. Den videre anvendelse av denne metode for karakterisering av CD4
+ T-celler som er spesifikke for ESO og andre tumorantigener i kretsløpet og ved tumor områder av kreftpasienter, både langs det naturlige forløp av sykdommen og under behandling, vil sannsynligvis bidra til betydelig øke vår forståelse av sine roller og bidrag i immunitet mot kreft.
Materialer og metoder
Pasient og sunn donorprøver og vurdering av ESO-spesifikk antistoffrespons
Sera og perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble samlet inn fra EOC pasienter sett på CLCC René Gauducheau og fra friske individer på skriftlig informert samtykke og godkjenning av Institutional Review Board (Comité de Protection des Personnes Ouest IV – Nantes). -Antistoff (Ab) responser til ESO ble undersøkt ved hjelp av ELISA, som beskrevet tidligere [14], [16], ved anvendelse av rekombinant protein ESO (reso) produsert i E. coli.
Ex vivo
fenotypiske vurdering av CD4
+ T-celleundergrupper og flowcytometri cellesortering
CD4
+ T-celler ble anriket ved positiv seleksjon fra PBMC fra friske individer og pasienter EOC ved magnetisk cellesortering (Miltenyi Biotec ), farget med monoklonale antistoffer (mAb) spesifikke for CD4 (BD Biosciences), CD8 (BD Biosciences), CD45RA (BD Biosciences), CD25 (Beckman Coulter), CD127 (eBioscience) og foxp3 (eBioscience), som vist, og analysert ved strømningscytometri ved anvendelse av en LSRII (BD Biosciences). For
ex vivo
flowcytometri celle sortering, ble beriket CD4
+ T-celler farget med anti-CD4, -CD8, -CD45RA, -CD25 og -CD127 mAb. Etter gating på CD4
+ CD8
-CD45RA
– lymfocytter, celler ble separert i minnet CD25
-CD127
+, CD25
-CD127
– og CD25
+ CD127
-Treg populasjoner til høy renhet ( 97%). ved hjelp av en FACSAria (BD Biosciences)
In vitro
stimulering og funksjonell vurdering av CD4
+ T-celle undergrupper
Totalt CD4
+ T-celler eller
ex vivo
sorterte minne konvensjonell og treg CD4
+ T-celle populasjoner ble stimulert
in vitro
med enten et basseng av lange overlappende peptider som dekker ESO-sekvensen [16] eller med anti-CD2 /3/28-belagte mikrokuler (Miltenyi Biotec) i nærvær av bestrålte autologe APC og ble dyrket i nærvær av rekombinant humant IL- 2 (Chiron). Dag 12 til 14 Kulturene ble vurdert i en 4-timers intracellulær cytokin fargings analyse ved bruk av mAb spesifikk for IFN-γ (BD Biosciences), IL-10 (BD Biosciences) og IL-17 (eBioscience), etter stimulering med enten ESO peptid basseng eller PMA (100 ng /ml, Sigma Aldrich) og ionomycin (1 pg /ml, Sigma Aldrich), som angitt, og analysert ved flowcytometri (LSRII).
MHC klasse II /ESO peptid tetramer farging
Fluorescent HLA-DR52b /og HLA-DR4 /ESO
119-143 tetramers ble generert som tidligere beskrevet [17], [18]. ESO-stimulerte CD4
+ T-cellekulturer ble inkubert med tetramerer ved en endelig konsentrasjon på 3 ug /ml i 1 time ved 37 ° C og deretter farget med CD4-spesifikt mAb og analysert ved flowcytometri (LSRII). For
ex vivo
telling og fenotyping av spesifikke celler, CD4 total
+ T-celler anriket fra PBMC ved magnetisk cellesortering ble hvilt over natten, inkubert med tetramerer (3 ug /ml) i 2 timer ved 37 °
