Abstract
Bakgrunn
Resveratrol, en naturlig forekommende phytopolyphenol sammensatte, har vakt stor interesse i de senere år på grunn av dens mangfoldige farmakologiske egenskapene. Selv om resveratrol besitter kjemopreventive egenskaper mot flere kreftformer, de molekylære mekanismer som den hemmer cellevekst og induserer apoptose er ikke klart forstått. Denne studien ble gjennomført for å undersøke om PI3K /AKT /FOXO sti medierer de biologiske effektene av resveratrol.
metodikk /hovedfunnene
Resveratrol hemmet fosforylering av PI3K, AKT og mTOR. Resveratrol, PI3K hemmere (LY294002 og Wortmannin) og AKT-hemmer alene litt indusert apoptose i LNCaP celler. Disse hemmere ytterligere forbedret apoptose-induserende potensialet av resveratrol. Overekspresjon av vill type PTEN litt indusert apoptose. Villtype PTEN og PTEN-G129E forbedret resveratrol-indusert apoptose, mens PTEN-G129R hadde ingen effekt på proapoptotiske effektene av resveratrol. Videre ble apoptose-induserende potensial på resveratrol forsterkes av dominant negativ AKT, og inhiberes av villtype AKT og konstitutivt aktiv AKT. Resveratrol har ingen effekt på uttrykk for FKHR, FKHRL1 og AFX gener. Hemming av FOXO fosforylering av resveratrol resulterte i sitt atomtrans, DNA-binding og transkripsjonen aktivitet. Hemming av PI3K /AKT sti indusert FOXO transkripsjonen aktivitet resulterer i induksjon av Bim, TRAIL, p27
/KIP1, DR4 og DR5, og hemming av cyclin D1. Tilsvarende resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet ble ytterligere forsterket da aktivering av PI3K /AKT veien ble blokkert. Over-uttrykk for fosforylering mangel mutanter av FOXO proteiner (FOXO1-TM, FOXO3A-TM og FOXO4-TM) indusert FOXO transkripsjonen aktivitet, som ble ytterligere forsterket av resveratrol. Hemming av FOXO transkripsjonsfaktorer ved shRNA blokkert resveratrol-indusert oppregulering av Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27
/KIP1 og apoptose, og hemming av cyclin D1 av resveratrol.
Konklusjon /Betydning
Disse dataene tyder på at FOXO transkripsjonsfaktorer mekle anti-proliferative og pro-apoptotiske effektene av resveratrol, delvis på grunn av aktivering av ytre apoptose pathway
Citation. Chen Q, Ganapathy S, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) Resveratrol induserer vekst og apoptose gjennom Aktivering av FOXO transkripsjonsfaktorer i prostata kreft celler. PLoS ONE 5 (12): e15288. doi: 10,1371 /journal.pone.0015288
Redaktør: Irina Lebedeva, Enzo Livet biovitenskap, USA
mottatt: 01.09.2010; Godkjent: 04.11.2010; Publisert: 14.12.2010
Copyright: © 2010 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektet ble støttet av en bevilgning (NIH R01CA114469 til RKS) fra National Institutes of Health (www.nih.gov). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de mer vanlige neoplasmer i den vestlige verden, oppstår gjennom den gradvise utvikling av en eller flere forhånds neoplastiske lesjoner i adenokarsinom, og deretter til metastatisk sykdom [1]. Nylige fremskritt har identifisert viktige genetiske endringer som kan initiere prostata kreftutvikling, og forbedre sannsynligheten for kreft progresjon. Prostata kreft celler er bare beskjedent responsiv eller ikke svarer til den cytotoksiske effekten av kjemoterapi eller strålebehandling. Økte konsentrasjoner av cytotoksiske medikamenter og høyere doser av bestråling mislykkes i å forbedre responsen på behandlingen, og det fører til resistens mot apoptose i prostatakreftceller. Således er det viktig å identifisere anticancermidler som er ikke-toksisk og meget effektive i indusering av apoptose fortrinnsvis i tumorceller.
Epidemiologiske data understøtter det konsept som kan være fri for toksisitet naturlig forekommende forbindelser i menneskets diett og ha lang varige positive effekter på menneskers helse. Resveratrol har vist seg å oppvise flere potensielle chemoprotective aktivitet i celle- og dyremodeller [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], inkludert hemming av PI3K /AKT sti [2], [6], [8], [10]. Vi har nylig vist at Resveratol forbedrer terapeutiske potensialet i TRAIL ved oppregulering dødsreseptorer (TRAIL /DR4 og TRAIL-R2 /DR5) og også engasjere mitokondrie vei av apoptose [2], [3]. Sletting eller mutasjon av PTEN har vært den viktigste årsaken til konstitutivt aktiv AKT fører til prostata kreftutvikling hos mennesker [11], [12]. Således kan resveratrol være potensiell kandidat til målceller med PTEN delesjon eller inaktivering og forbedret AKT-aktivitet i forstadier prostatavev.
PI3K signalering spiller en sentral rolle i intracellulære signaltransduksjonsveier som er involvert i cellulær transformasjon, cellevekst, og tumorigenesis. Inaktivering av AKT resultater i defosforylering og aktivering av FOXO transkripsjonsfaktorer, rapporteres å megle cellesyklus arrest, DNA-reparasjon, og apoptose [13], [14]. Disse transkripsjonsfaktorer, tilhører den «O» undergruppe av bevingede-helix /gaffelhodetranskripsjonsfaktor familie, består i hovedsak av fire medlemmer FOXO1, FOXO3a, FOXO4, og FOXO6 [15]. FOXO proteiner er evolusjonært konservert transkripsjonsfaktorer involvert i flere grunnleggende cellulære prosesser, som virker som endepunktet for transkripsjonelle programmer som er involvert i apoptose, stressrespons og lang levetid [16], [17], [18], [19], [20]. Oppheving av FOXO funksjonen er ofte observert i menneskelige kreft [17], [21], derfor mekanismene for regulering av de FOXO proteiner får økende oppmerksomhet i kreftforskning. De FOXO proteinene integrere innganger regulatoriske fra en rekke oppstrøms signalveier, viktigst som respons på vekstfaktor og stress signalering [17], [21]. Nylig har FOXO faktorer er etablert som tumor suppressors, fremme transkripsjon av pro-apoptotiske molekyler som Fasl og Bim når PI3K /AKT veien er nedregulert grunn av næringsstoff eller serum sult og cellulært stress [22], [23], [24 ]. Triple knockout musemodeller viste tumorsupressorproteinene egenskaper FOXOs, som mus samtidig mangler de viktigste medlemmene av pattedyr FOXO underfamilien, FOXO1, FOXO3a og FOXO4, er utsatt for å utvikle hemangiomer og lymfoproliferative sykdommer [25]. Omvendt, den enkelte eller sammen inaktivering av FOXO1, FOXO3a eller FOXO4 resulterte i en mindre alvorlig fenotype, som støtter ideen om funksjonell redundans av disse FOXO faktorer [25]. Videre har tvunget ekspresjon av FOXO blitt vist å hemme tumorgenese i xenograft-modeller i nakne mus [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Derfor er reaktivering av FOXO basert på dens tumorsupressorproteinene egenskaper ansett som en meget attraktiv anti-kreft-strategi. Siden FOXO proteiner ble rapportert å være kritiske mediatorer av apoptose indusert av kreft narkotika, postulerte vi at FOXO uttrykk eller transkripsjonen aktivitet kan være viktig begivenhet i formidling effektene av resveratrol.
Formålet med studien var å undersøke effekter PI3K /AKT sti på regulering av FOXO transkripsjonsfaktorer og deres mål genprodukter, og vurdere om PI3K /AKT /FOXO pathway regulerer anti-proliferative effektene av resveratrol i prostata kreft celler. Våre data viser at inhibering av PI3K /AKT sti forbedret FOXO DNA-bindende og transkripsjonen aktivitet, noe som resulterer i regulering av dets genprodukter (TRAIL, DR4, DR5, Bim, p27
/KIP1 og syklin D1). Hemming av PI3K /AKT sti eller overekspresjon av FKHR, FKHRL1 og AFX forbedret resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet. I kontrast, hemming av FKHR, FKHRL1 eller AFX blokkert resveratrol-indusert uttrykk for TRAIL, DR4, DR5, Bim og p27, og hemmet uttrykk for cyclin D1. Disse dataene antyder at resveratrol induserer apoptose og vekst arrest gjennom aktivering av FOXO transkripsjonsfaktorer, og hemming av PI3K /AKT sti aktiverer FOXO transkripsjonsfaktorer og ytterligere forbedrer antiproliferative og proapoptotiske effektene av resveratrol.
Resultater
hemming av PI3K /AKT sti forbedrer resveratrol-indusert apoptose i prostatakreftceller
Vi først undersøkt effekten av farmakologisk hemming av AKT av LY294002, Wortmannin eller AKT inhibitor på resveratrol-indusert apoptose i LNCaP celler (fig. 1A). Resveratrol indusert apoptose i LNCaP celler. Tilsvarende LY294002, Wortmannin eller AKT-hemmer litt, men betydelig indusert apoptose. Forbehandling av LNCaP-celler med LY294002, Wortmannin eller AKT-inhibitor betydelig forbedret resveratrol-indusert apoptose i 48 timer. Disse data tyder på at inhibering av PI3K /AKT-aktivitet ved farmakologisk tilnærming forbedret resveratrol-indusert apoptose.
(A), ble LNCaP-celler forbehandlet med LY294002 (1 uM), Wortmannin (1 uM) eller AKT-inhibitor (100 nM) i 2 timer, etterfulgt av behandling med resveratrol (20 uM) i 48 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden ble cellene høstet og apoptose ble målt ved TUNEL assay. Data representerer gjennomsnitt ± SE. *, # Og ** = signifikant forskjellig fra respektive kontroll (P 0,05). (B), LNCaP celler ble transient transfektert med tom vektor, PTEN-WT, PTEN-G129E eller PTEN-G129R. Dyrkningsmediet ble forandret, og cellene ble behandlet med eller uten resveratrol (20 uM) i 48 timer, og apoptose ble målt ved TUNEL assay. Data representerer gjennomsnitt ± SE. *, **,% Og $ = signifikant forskjellig fra respektive kontroll (P 0,05). (C), ble LNCaP-celler transient transfektert med tom vektor, WT-AKT, CA-AKT eller DN-AKT. Dyrkningsmediet ble forandret, og cellene ble behandlet med eller uten resveratrol (20 uM) i 48 timer, og apoptose ble målt ved TUNEL assay. Data representerer gjennomsnitt ± SE. *, **, # Og% = signifikant forskjellig fra respektive kontroll (P 0,05). (D), Effekter av resveratrol på ekspresjon av PI3K, AKT og mTOR pathway. LNCaP-celler ble behandlet med resveratrol (20 uM) til forskjellige tidspunkter. Western blot ble utført med anti-fosfo-PI3K, fosfo-AKT, anti-AKT og fosfo-mTOR-antistoffer. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Dataene er representative for tre forsøk.
tumorsuppressorgenet PTEN er ganske ofte inaktivert i menneskelige prostata kreft. Den inaktivering av PTEN kan føre til konstitutiv fosforylering og aktivering av AKT, som fører til forbedret cellevekst og tumorprogresjon. Siden LNCaP celler uttrykker konstitutivt aktiv AKT, forsøkte vi å undersøke hvilken rolle PI3K /AKT sti på resveratrol-indusert apoptose. LNCaP-celler ble transfektert med tom vektor eller plasmid som uttrykker villtype PTEN, PTEN-G129E, eller PTEN-G129R og inkubert i nærvær eller fravær av resveratrol (Fig. 1B). Resveratrol indusert apoptose i LNCaP-celler transfektert med tom vektor. Transfeksjon av LNCaP celler med villtype PTEN betydelig forbedret resveratrol-indusert apoptose. Overekspresjon av PTEN-G129E eller PTEN-G129R i LNCaP celler betydelig hemmet resveratrol indusert apoptose enn de transfektert med villtype PTEN. Disse dataene antyder at hemming av AKT aktivitet ved overekspresjon av PTEN forbedrer apoptose-induserende potensiale av resveratrol.
Siden overekspresjon av PTEN forbedrer resveratrol-indusert apoptose, vi regulert AKT uttrykk av villtype AKT (WT-AKT), konstitutivt aktiv AKT (CA-AKT) og dominant negativ AKT (DN-AKT). LNCaP-celler ble transient transfektert med tom vektor, WT-AKT, CA-AKT eller DN-AKT og behandlet med eller uten resveratrol (20 uM). Transfeksjon av LNCaP-celler med tom vektor, WT-AKT eller CA-AKT hadde ingen effekt på apoptose (Fig. 1C). Resveratrol indusert apoptose i tomme vektor transfekterte celler. Overekspresjon av WT-AKT eller CA-AKT i LNCaP celler hemmet resveratrol-indusert apoptose. Overekspresjon av DN-AKT alene betydelig indusert apoptose. Interessant, overekspresjon av DN-AKT forbedret resveratrol-indusert apoptose. Samlet er disse data tyder på at hemming av PI3K /AKT sti av genetiske og farmakologiske midler forbedre resveratrol-indusert apoptose i prostatakreftceller.
Resveratrol hemmer fosforylering av PI3K og AKT
Siden PI3K /AKT pathway hemmer resveratrol-indusert apoptose, vi søkt å undersøke effektene av resveratrol på fosforylering av PI3K og AKT (fig. 1 D). LNCaP celler ble behandlet med resveratrol og fosforylering av PI3K og AKT ble undersøkt ved Western blot analyse. Resveratrol hemmet fosforylering av PI3K og AKT på en tidsavhengig måte. Fosforyleringen av disse kinaser ble opphevet etter 48 timer. Resveratrol hadde ingen effekt på uttrykk for total AKT.
Siden mTOR er en ned-stream fra AKT, vi neste søkt å undersøke om resveratrol regulerer også fosforylering av mTOR. Som vist på fig. 1D, resveratrol hemmet fosforylering av mTOR. Disse dataene antyder at resveratrol kan hemme fosforyleringen av begge PI3K /AKT og mTOR proteiner, og dermed spille en viktig rolle som formidler anti-apoptotiske effektene av resveratrol.
Resveratrol har ingen effekt på uttrykk for FKHR, FKHRL1 og AFX, men inhiberer fosforylering av proteiner FOXO
PI3K /AKT-reaksjonsveien er blitt vist å regulere fosforylering av proteiner FOXO [33]. Vi målte således ekspresjonen av gener FOXO ved hjelp av RT-PCR, og fosforylering av FOXO proteiner ved Western blot-analyse. Resveratrol hadde ingen effekt på ekspresjonen av FKHR, FKHRL1 og AFX som målt ved hjelp av RT-PCR (fig. 2A). Vi neste søkt å undersøke om resveratrol regulerer fosforylering av FOXO proteiner. Som vist på fig. 2B, resveratrol hemmet fosforylering av FKHR, FKHRL1 og AFX. Disse data tyder på at resveratrol kan hemme fosforyleringen av FOXO proteiner, som er nedstrøms av AKT, og defosforylering av FOXO ved resveratrol kan resultere i sin aktivering gjennom kjernetranslokasjon.
(A), Effekter av resveratrol på uttrykk for FKHR, FKHRL1 og AFX. LNCaP-celler ble behandlet med resveratrol (10 eller 20 uM) for 6, 12 eller 24 timer. Total RNA ble isolert og RT-PCR-analyse ble utført for å måle uttrykket av FKHR, FKHRL1 og AFX. (B), Effekter av resveratrol på fosforylering av FOXO proteiner. LNCaP-celler ble behandlet med resveratrol (20 uM) i 0-48 timer, og Western blot analyser ble utført for å måle ekspresjonen av fosfo-FKHR, fosfo-FKHRL1 og fosfor-AFX. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C), induserer resveratrol translokasjon av FKHR til kjernen. LNCaP celler ble sådd i kamret lysbilder og transfektert med GFP-FKHR eller GFP-FKHR-TM (fosforylering mangel trippel mutant). Dyrkningsmediet ble forandret, og cellene ble behandlet med eller uten resveratrol (20 uM) i 24 timer. Celler ble fikset, permeabilized, og farget med DAPI og visualisert under en fluorescens mikroskop. grønn farge = FKHR, rød farge = kjerne (for klarhet fargen på kjernen ble endret fra blå til rød), gul = colocalization av FKHR til kjernen. (D), venstre panel, ble LNCaP-celler ble behandlet med resveratrol (20 uM) for forskjellige tidspunkter (0-24 h). Nukleære ekstrakter ble fremstilt og gelshift eksperiment ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder. Lane 1 = sonde bare, baner 2-9 = resveratrol behandlede prøver, lane 10 = kald sonde (50 ×), og kjørefelt 11 = kaldt SP1 probe. Dataene er representative for tre eksperimenter. Høyre panel, LNCaP-celler var ubehandlet eller behandlet med resveratrol (20 uM) i nærvær eller fravær av LY (1 uM) eller AKT-inhibitor (100 nM) i 24 timer. Nukleære ekstrakter ble fremstilt og gelshift eksperiment ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder. Lane 1 = sonde bare, kjørefelt 2 = kald sonde (50 ×), spor 3 = kaldt SP1, kjørefelt 4 = kontroll, spor 5 = resveratrol, spor 6 = LY, spor 7 = AKT-hemmer, lane 8 = resveratrol pluss LY, kjørefelt 9 = resveratrol + AKT inhibitor. Dataene er representative for tre forsøk.
Resveratrol øker translokasjon av villtype og mutant FKHR til Nucleus og forbedrer FOXO-DNA interaksjon
Vi neste undersøkte kjernefysisk translokasjon av FKHR av resveratrol ved hjelp av villtype og mutante GFP-FKHR konstruksjoner. LNCaP-celler ble transfektert med enten GFP-FKHR eller GFP-FKHR-TM (trippel mutant) og behandlet med resveratrol for (2c Fig.) 24 timer. Translokasjon av villtype og fosforylering mangelfull mutant FKHR ble observert ved fluorescens mikroskopi. Resveratrol indusert atomtranslokasjon av både villtype og mutant FKHR. Men atomtranslokasjon av FKHR-TM var mye høyere enn villtype FKHR.
Vi neste undersøkte FOXO-DNA interaksjon med elektromobilitet shift analyse (EMSA). En elektroforetiske mobilitet skift analyse (EMSA) er en vanlig affinitets elektroforese teknikk som brukes for å undersøke protein-DNA interaksjon. Behandling av LNCaP celler med resveratrol resultert i forbedret FOXO-DNA interaksjon (fig. 2D, venstre panel). Inkubering av kald probe med atom ekstrakt resulterte i redusert FOXO-DNA-bindingsaktivitet. Til sammenligning var inkubering av ikke-spesifikk kald SP1 probe hadde ingen virkning på FOXO-DNA-binding. Kombinasjonen av LY294002 eller AKT-hemmer med resveratrol forbedret litt den FOXO-DNA bindingsaktivitet, enn monoterapi alene (Fig. 2D, panel til høyre). Samlet er disse dataene antyder at resveratrol kan forbedre FOXO kjernefysisk translokasjon og DNA-bindende aktivitet.
hemming av PI3K /AKT sti og fosforylering mangel mutanter av FOXO proteiner forbedre resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet
neste undersøkt om hemming av PI3K /AKT sti forbedrer resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet i en luciferasereportergenet assay som måler FOXO funksjon (fig. 3A-C). Vi har først tatt en farmakologisk tilnærming til å hemme PI3K /AKT aktivitet ved hjelp Wortmannin, LY-294002, og AKT inhibitor IV. Wortmannin, LY-294002, AKT inhibitor IV og resveratrol alene indusert FOXO transkripsjonen aktivitet. Videre kombinasjonsbehandling av Wortmannin, LY-294002 eller AKT hemmer IV med resveratrol forbedret FOXO aktivitet videre. Disse dataene antyder at hemming av PI3K /AKT vei virker synergistisk med resveratrol å indusere FOXO transkripsjonen aktivitet.
(A), Farmakologisk hemming av PI3K /AKT sti forbedret resveratrol-indusert FOXO aktivitet i LNCaP celler. LNCaP celler ble transient transfektert med 6X DBE-luciferase og PRL-TK plasmider i 24 timer som vi beskrevet andre steder. Etter transfeksjon ble celler forbehandlet med Wortmannin (10 uM), LY-294002 (10 uM) eller AKT-inhibitor IV (1 uM) i 2 timer, etterfulgt av behandling med eller uten resveratrol (20 uM) i 24 timer. Cellene ble høstet for ildflue /Renilla luciferase analyser ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega). Luciferasepreparater tellinger ble normalisert ved hjelp av
Renilla
luciferase transfeksjon kontroll. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. *, #, ** = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (B), Overuttrykte dominant negativ AKT forbedret resveratrol-indusert FOXO aktivitet. LNCaP-celler ble transient transfektert med 6X DBE-luciferase plus PRL-TK plasmider med WT-AKT, CA-AKT eller DN-AKT i 24 timer. Etter transfeksjon ble celler forbehandlet med resveratrol (20 uM) i 24 timer. Cellene ble høstet for ildflue /Renilla luciferase analyser ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega). Luciferasepreparater tellinger ble normalisert ved hjelp av
Renilla
luciferase transfeksjon kontroll. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. *, # Og ** = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (C), Regulering av resveratrol-indusert FOXO aktivitet ved villtype eller mutant PTEN. LNCaP celler ble transient transfektert med 6X DBE-luciferase pluss PRL-TK plasmider med PTEN-WT, PTEN-G129E eller PTEN-G129R i 24 timer. Etter transfeksjon ble celler forbehandlet med resveratrol (20 uM) i 24 timer. Cellene ble høstet for ildflue /Renilla luciferase analyser ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega). Luciferasepreparater tellinger ble normalisert ved hjelp av
Renilla
luciferase transfeksjon kontroll. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. *, , $ og ** = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (D), fosforylering mangel mutanter av FOXO forbedre resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet. LNCaP-celler ble transient transfektert med tom vektor eller konstrukter som koder for FOXO1-TM, TM-FOXO3a, eller FOXO4-TM sammen med 6X DBE-luciferase og PRL-TK plasmider i 24 timer. Etter transfeksjon ble cellene vasket, behandlet med resveratrol (20 uM) i 24 timer og høstet for ildflue /Renilla luciferase-analyser ved anvendelse av dobbel-luciferase reporter Assay System (Promega). Luciferasepreparater tellinger ble normalisert ved hjelp av
Renilla
luciferase transfeksjon kontroll. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. * Og ** = signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
Vi neste undersøkte effekten av AKT på resveratrol-indusert FOXO aktivitet i LNCaP celler (figur 3B.). Den AKT aktivitet ble regulert av villtype AKT (WT-AKT), konstitutivt aktiv AKT (CA-AKT) og dominant negativ AKT (DN-AKT). LNCaP-celler ble transient transfektert med tom vektor, WT-AKT, CA-AKT eller DN-AKT og behandlet med eller uten resveratrol (20 uM). Transfeksjon av LNCaP-celler med tom vektor, WT-AKT, eller CA-AKT hadde ingen effekt på FOXO transkripsjonen aktivitet. Til sammenligning transfeksjon av celler med DN-AKT induserte signifikant FOXO transkripsjonen aktivitet. Resveratrol indusert FOXO transkripsjonen aktivitet i celler transfektert med tom vektor. Overekspresjon av WT-AKT eller CA-AKT i LNCaP celler hemmet resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet. Interessant, overekspresjon av DN-AKT forbedret resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet. Samlet er disse data tyder på at hemming av AKT aktivitet ved genetisk tilnærming forbedrer resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet i prostatakreftceller.
Siden LNCaP celler uttrykker mutant PTEN resulterer i konstitutiv aktivering av AKT, vi søkt å undersøke rollen av PTEN på resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet (fig. 3C). LNCaP celler ble transfektert med tom vektor eller plasmid som uttrykker villtype PTEN, PTEN-G129E, eller PTEN-G129R og behandlet med eller uten resveratrol. PTEN-WT litt indusert FOXO transkripsjonen aktivitet. Resveratrol indusert FOXO transkripsjonen aktivitet i LNCaP celler transfektert med tom vektor. Transfeksjon av LNCaP celler med villtype PTEN eller PTEN-G129E forbedret resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet betydelig. Til sammenligning overekspresjon av PTEN-G129R i LNCaP-celler hadde FOXO transkripsjonen aktivitet lik den til resveratrol behandlet LNCaP /tomme vektor-celler. Disse data tyder på at inhibering av AKT-aktivitet ved overekspresjon av PTEN øker FOXO transkripsjonen aktivitet.
neste undersøkt hvorvidt resveratrol induserer transkripsjonen aktivering av FOXO i nærvær eller fravær av FOXO1-TM, TM-FOXO3a, eller FOXO4- TM (fosforylering mangelfull trippel mutant) (fig. 3D). LNCaP-celler ble transfektert med p6xDBE-luciferase reporter-konstruksjonen i nærvær eller fravær av plasmider som uttrykker FOXO1-TM, TM-FOXO3a, eller FOXO4-TM. Etter transfeksjon ble cellene behandlet med resveratrol i 24 timer, og luciferaseaktivitet ble målt. Transfeksjon av celler med plasmider som uttrykker FOXO1-TM, TM-FOXO3a, eller FOXO4-TM indusert FOXO transkripsjonen aktivitet sammenlignet med tom vektor (kontroll). Resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet ble ytterligere forsterket i nærvær av fosforylering mangel mutanter av FOXO1, FOXO3a, og FOXO4. Disse dataene indikerer at aktivering av FOXO transkripsjonsfaktorene ytterligere forbedrer resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet.
Hemming av PI3K /AKT pathway regulerer Bim, p27
/Kip1, cyclin D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5
Vi neste undersøkt effekten av å hemme PI3K /AKT sti på uttrykk for Bim, p27
/Kip1, cyclin D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5. Disse genene er direkte mål av FOXO transkripsjonsfaktor. LNCaP-celler ble forbehandlet med LY-294002 eller AKT-inhibitor IV, etterfulgt av behandling med resveratrol i 24 timer, og ekspresjon av Bim, p27, cyklin D1, TRAIL, DR4 og DR5 ble målt ved Western blotting (fig. 4). LY-294002 og AKT inhibitor IV indusert uttrykk for Bim, p27
/Kip1, TRAIL, DR4 og DR5, og hemmet uttrykk for cyclin D1. Behandling av celle med resveratrol ytterligere forsterket effekten av LY-294002 eller AKT inhibitor IV på uttrykk for Bim, TRAIL, DR4 og DR5. Imidlertid er kombinasjonen av LY-294002 eller AKT-inhibitor IV med resveratrol hadde ingen ytterligere virkning på ekspresjon av p27
/KIP1 og cyklin D1. Disse dataene antyder at hemming av PI3K /AKT sti kan regulere uttrykket av Bim, p27
/Kip1, cyclin D1, TRAIL, DR4 og DR5, som er transkripsjons mål for FOXO. Resverarol kan også regulere ekspresjonen av disse FOXO transkripsjons målene.
LNCaP-celler ble forbehandlet med LY294002 (10 uM) eller AKT-inhibitor (AKT-I, 1 uM) i 2 timer og behandlet med eller uten resveratrol (20 uM) i 48 timer. Cellene ble høstet for å måle uttrykket av Bim, p27
/KIP1, cyclin D1, TRAIL, DR4 og DR5 av theWestern blot analyse. β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
Hemming av FOXO uttrykk ved shRNA hemmer antiproliferative effektene av resveratrol og blokkerte resveratrol-indusert caspase-3-aktivitet og apoptose
Hvis resveratrol induserer apoptose ved å aktivere FOXO transkripsjonsfaktor, bør inhibering av FOXO proteinene blokkerer anti-proliferative effekter av resveratrol. LNCaP celler ble transfektert med shRNA uttrykker FKHR, FKHRL1 eller AFX og behandlet med resveratrol (Fig. 5). Resveratrol indusert apoptose i LNCaP /FKHR scrambled, LNCaP /FKHRL1 kryptert og LNCaP /AFX scrambled-celler på en doseavhengig måte (fig. 5A). Hemming av FKHR, FKHRL1 eller AFX av shRNA blokkert anti-proliferative effektene av resveratrol. Disse dataene tyder på at resveratrol inhiberer cellelevedyktigheten ved regulering av FOXO transkripsjonsfaktorer.
(A) Inhibering av FOXO transkripsjonsfaktor med shRNA blokkerer anti-proliferative effekter av resveratrol. LNCaP-celler ble transient transfektert med plasmider som uttrykker FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA, AFX shRNA eller respektive omkastede kontroll og behandlet med resveratrol (20 uM) i 48 timer, og cellenes levedyktighet ble målt. (B) Inhibering av FOXO transkripsjonsfaktorer eller ROS (reaktive oksygenarter) med NAC blokker resveratrol-indusert apoptose. LNCaP-celler ble transfektert med en blanding av plasmider som uttrykker FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA pluss AFX shRNA eller kryptert kontroll. Etter transfeksjon, ble kulturmediet skiftet og cellene ble forbehandlet med NAC i 2 timer, og behandlet med resveratrol (20 uM) i 48 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble apoptose målt ved TUNEL assay. (C) Inhibering av FOXO transkripsjonsfaktorer eller ROS av NAC blokkene resveratrol-indusert caspase-3 aktivitet. LNCaP-celler ble transfektert med en blanding av plasmider som uttrykker FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA pluss AFX shRNA eller kryptert kontroll. Etter transfeksjon, ble kulturmediet skiftet og cellene ble forbehandlet med NAC i 2 timer, og behandlet med resveratrol (20 uM) i 48 timer. Ved slutten av inkubasjonstiden, ble caspase-3-aktivitet målt i henhold til produsentens instruksjoner.
neste søkt å undersøke om hemming av FOXO uttrykk effekt resveratrol-indusert caspase-3-aktivitet og apoptose (fig . 5B og C). Resveratrol indusert caspase-3-aktivitet og apoptose i LNCaP /egge celler. Forbehandling av LNCaP /egge celler med NAC hemmet resveratrol-indusert caspase-3-aktivitet og apoptose. Hemming av FOXO uttrykk ved shRNA hemmet resveratrol indusert caspase-3-aktivitet og apoptose. Interessant, forbehandling av LNCaP /FOXO shRNA celler med NAC blokkert resveratrol-indusert caspase-3-aktivitet og apoptose. Disse dataene antyder at resveratrol indusert caspase-3-aktivitet og apoptose gjennom generering av ROS, og hemming av FOXO (FKHR, FKHRL1 og AFX) hemmer caspase-3-aktivitet og apoptose.
Regulering av Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27
/Kip1 og cyclin D1 ved FOXO gener (FKHR, FKHRL1 og AFX)
FOXO transkripsjonsfaktorer har vist seg å regulere apoptose og cellesyklusrelaterte gener [14], [34]. Siden resveratrol regulert uttrykk for Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27
/Kip1 og cyclin D1, forsøkte vi å undersøke om disse effektene av resveratrol formidles gjennom FOXO transkripsjonsfaktorer som ble hemmet av shRNA (Fig. 6). Resveratrol indusert uttrykk for Bim (Bim
EL, Bim
L og Bim
S), TRAIL, DR4, DR5 og p27
/Kip1, og hemmet uttrykk for cyclin D1 i LNCaP /egge celler. Hemming av FKHR, FKHRL1 eller AFX av shRNA dempes resveratrol-indusert Bim, TRAIL, DR4, DR5 og p27
/Kip1 uttrykk. Til sammenligning hemming av FKHR, FKHRL1 eller AFX av shRNA litt svekket de hemmende effektene av resveratrol på cyclin D1 uttrykk. Disse dataene antyder at resveratrol kan regulere apoptose (Bim, TRAIL, DR4, og DR5) og cellesyklusrelaterte gener (p27
/Kip1, og cyclin D1) gjennom FOXO transkripsjonsfaktorer. Interessant nok, vil induksjon av TRAIL og dets reseptorer DR4 og DR5 ved resveratrol resultere i aktivering av ytre vei av apoptose.
(A), ble LNCaP-celler transfektert med plasmider som uttrykker FKHR shRNA eller kryptert kontroll. Etter transfeksjon, ble kulturmediet skiftet og cellene ble behandlet med resveratrol (0-20 uM) i 48 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden ble cellene høstet for å måle ekspresjonen av Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27 og cyklin D1 ved Western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B), ble LNCaP celler transfektert med plasmider som uttrykker FKHRL1 shRNA eller egge kontroll. Etter transfeksjon, ble kulturmediet skiftet og cellene ble behandlet med resveratrol (0-20 uM) i 48 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden ble cellene høstet for å måle ekspresjonen av Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27 og cyklin D1 ved Western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C), ble LNCaP-celler transfektert med plasmider som uttrykker AFX shRNA eller kryptert kontroll. Etter transfeksjon, ble kulturmediet skiftet og cellene ble behandlet med resveratrol (0-20 uM) i 48 timer.
