Abstract
Forurensning av normale celler er nesten alltid til stede i tumorprøver og påvirker deres molekylære analyser. DNA-metylering, en stabil epigenetisk modifikasjon, er celletype-avhengige, og forskjellig mellom kreft og normale celler. Her ønsket vi å demonstrere at DNA-metylering kan brukes til å anslå den fraksjon av kreftceller i en tumor-DNA-prøve, ved hjelp av spiserørs karsinomer (ESCC) som et eksempel. Først ved en infinium HumanMethylation450 BeadChip array, isolert vi tre genomiske regioner (
TFAP2B
,
ARHGEF4
, og
RAPGEFL1
) i) høyt metylert i fire ESCC cellelinjer, ii) knapt metylert i en samleprøve av ikke-kreft slimhinner, en samleprøve av normal esophageal slimhinner og perifere leukocytter, og iii) ofte metylert i 28 ESCCs (
TFAP2B
, 24/28;
ARHGEF4
, 20/28, og
RAPGEFL1
, 19/28). For det andre, ved hjelp av åtte par kreft og ikke-cancercelleprøver fremstilt ved hjelp av laser fangst mikrodisseksjon vi bekreftet at minst en av de tre regionene ble nesten helt metylert i ESCC celler, og alle tre regionene var nesten fullstendig unmethylated i ikke-cancer celler. Vi bekreftet også at DNA-kopi antall endringer av de tre regionene i 15 ESCC prøvene var sjeldne, og ikke påvirke estimering av fraksjonen av kreftceller. Deretter ble den fraksjon av kreftceller i en tumor-DNA-prøve er definert som den høyeste metylering nivået av de tre regionene, og vi bekreftet en høy korrelasjon mellom den del vurderes av DNA-metylering fraksjonen markør og fraksjonen som vurdert av en patolog (r = 0,85; p 0,001). Til slutt, observerte vi at, ved korreksjon av kreftcelleinnholdet, ble CpG øyer i promotorområdene av tumor-suppressor-gener nesten fullstendig metylert. Disse resultater viser at DNA-metylering kan brukes til å anslå den fraksjon av kreftceller i en tumor-DNA-prøve.
Citation: Takahashi T, Matsuda Y, Yamashita S, Hattori N, Kushima R, Lee Y-C, et al. (2013) Vurdering av brøkdel av kreftceller i en svulst DNA-prøve ved hjelp av DNA Metylering. PLoS ONE 8 (12): e82302. doi: 10,1371 /journal.pone.0082302
Redaktør: Qian Tao, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 6 juni 2013, Godkjent: 22 oktober 2013; Publisert: 02.12.2013
Copyright: © 2013 Takahashi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den tredje sikt Comprehensive Cancer kontroll strategi fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferdsdirektoratet, Japan (https://www.mhlw.go.jp), og ved Prosjekt for utvikling av innovative kreftforsking Therapeutics (P- DIRECT) fra departementet for utdanning, kultur sport, vitenskap og teknologi, Japan (https://p-direct.mext.go.jp). T.T. og Y.M. er mottakere av en forsknings Resident Fellowship fra Stiftelsen for fremme av Cancer Research (https://www.fpcr.or.jp). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Forurensning av normale celler, så som normale epitelceller, fibroblaster, og perifere leukocytter, er nesten alltid til stede i tumorprøver. En slik forurensning påvirker resultatene av kreft genom analyser [1-4], og RNA-ekspresjon analyse [5,6]. Hvis fraksjonen av kreftceller i en tumor-DNA-prøve lett kan vurderes, kan vi utføre mer nøyaktig analyse ved å utelate prøver med ekstremt lavt tumorcelleinnhold, og ved å normalisere de rå data basert på brøkdel av kreftceller. Tradisjonelt har en brøkdel av kreftceller i en tumorprøve blitt vurdert ved patologisk analyse ved hjelp av naboseksjoner. Imidlertid er fremstillingen av slike seksjoner og til vanskelig eller umulig på grunn av prøven tilgjengelighet, og, fremfor alt, ekspert patologer er nødvendige for slike analyser.
For å overvinne disse problemene, teknologier for å estimere en brøkdel av kreftceller ble nylig utviklet ved hjelp enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) mikromatriser og neste generasjons sekvensering (NGS) [7-10]. Med SNP microarray, kan brøkdel av kreftceller beregnes ved å oppdage genomiske regioner med kopi nummer endringer og måle graden av alleliske ubalanse ved hjelp av SNPs i genomiske regioner [7-9]. Med NGS, kan tumorspesifikke mutasjoner bli identifisert, og fraksjonen av kreftceller kan beregnes basert på det mutante allel frekvens [10]. Siden disse teknologiene som opprinnelig ble utviklet for analyse av SNP eller mutasjoner, lider de av kompliserte beregningsformler, kostbare reagenser, og at det er nødvendig å analysere sammenkoblede normale prøver.
DNA metylering er en stabil epigenetisk modifikasjon, og noen genomiske regioner er metylert i en celletype-avhengig måte [11-13]. Mellom kreft og normale celler, er mange genomiske regioner rapportert å være differensielt metylert i mange typer av kreft, og noen av dem er årsaksmessig involvert i kreftutvikling og progresjon [14-18]. Blant slike differensielt metylerte genomiske regioner, kan noen bestemte genomiske regioner være helt metylert i kreftcellene, men likevel fullstendig unmethylated i normale celler, så som normale epitelceller, fibroblaster, og perifere leukocytter. I så fall kan DNA-metylering nivåer av de spesifikke genomiske regioner reflektere brøkdel av kreftceller i en prøve (figur 1A), og en slik estimering av fraksjonen av kreftceller ved hjelp av DNA-metylering kan bli en nyttig metode for kreft studier.
(A) Konseptet med estimering av den fraksjon av kreftceller i en tumor DNA-prøve ved anvendelse av DNA-metylering. (B) Valg av spesifikke genomiske regioner, som var helt metylert i ESCC celler og helt unmethylated i ulike normale celler, av genom-wide metylering analyse ved hjelp av en infinium HumanMethylation450 BeadChip array. Fjorten CpG nettsider ble til slutt valgt, og de ble utledet fra 11 genomiske regioner. (C) Tre genomiske regioner (TFAP2B,
ARHGEF4
, og
RAPGEFL1
) valgt som komponenter i en brøkdel markør. Genstruktur og plasseringen av et CpG øy er vist øverst, og p-verdiene for de CpG områder analysert ved infinium vulsten matrisen er vist. CPG nettstedet identifiseres av infinium perle matrisen er eske av et rektangel med en stiplet linje. En CpG kartet rundt CpG nettsted (er) identifisert vises nederst. Vertikale linjer (heltrukne og brutte) viser CpG sider og stiplede linjer viser CpG sider hvor β-verdier ble målt ved hjelp av vulsten matrisen. Lukkede pilene viser primere for MS-HRMA.
I denne studien ønsket vi å demonstrere at DNA-metylering kan brukes som en fraksjon markør for estimering av en fraksjon av kreftceller i en tumor-DNA-prøve, ved hjelp av spiserørs karsinomer (ESCC) prøvene som et eksempel. For å oppnå dette, gjennomførte vi et genom-wide metylering analyse for å søke på bestemte genomiske regioner helt denaturert i ESCC celler og helt unmethylated i ulike normale celler.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble gjennomført med godkjenning av Institutional Review Board of National Cancer Center Hospital, Osaka City University Hospital, og National Taiwan University Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle personer.
Prøver og ESCC cellelinjer
En totalt 160 ESCC prøver ble samlet ved National Cancer Center Hospital, Osaka City University Hospital, og National Taiwan University Hospital. De 160 ESCC prøvene besto av 39 biopsiprøver og 121 kirurgiske prøver. De biopsiprøver ble hentet fra 39 pasienter som gjennomgikk endoskopisk biopsi, og ble diagnostisert til å ha en ESCC (33 mannlige og seks kvinnelige; gjennomsnittsalder = 63, range = 30-78). Prøvene ble lagret i RNAlater (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ved -80 ° C. Den kirurgiske prøver ble hentet fra 121 pasienter som ble diagnostisert til å ha en histologisk invasiv ESCC og hadde gjennomgått esophagectomy (98 mannlige og 23 kvinnelige; gjennomsnittsalder = 65, range = 41-82). Blant de 121 kirurgiske prøver, ble 25 prøver oppnådd fra prøvene er innleiret i parafinvoks blokken etter fiksering med formalin eller 70% etanol, og de andre 96 prøver ble oppnådd fra prøver lagret i RNAlater (Applied Biosystems) etter reseksjon. I tillegg ble laser capture mikrodisseksjon (LCM) utført i åtte kirurgiske prøver innebygd i parafinvoks blokken ved hjelp LM200 (Arcturus, Mount View, CA, USA) som beskrevet [19].
Fire ESCC cellelinjer KYSE30, KYSE50, KYSE220, og KYSE270 [20] ble kjøpt fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av fenol /kloroform-metoden.
Genome-wide DNA Metylering Analyse
Genome-wide screening av ulikt denaturert CpG nettsider ble utført ved hjelp av en infinium HumanMethylation450 BeadChip array, som dekket 482,421 CpG nettsteder (Illumina, San Diego, CA, USA ) som tidligere beskrevet [21]. 11,551 CpG nettstedene på kjønnskromosomer ble ekskludert, og de resterende 470,870 CpG nettsteder ble brukt for analyse. Metyleringen nivået for hver CpG område var representert ved en β verdi, som varierte fra 0 (fullstendig unmethylated) til 1 (fullstendig denaturert).
Metylering følsomme High Resolution Smelte Analysis (MS-HRMA)
For MS-HRMA, først, 1 mikrogram av DNA fordøyd med
Bam
HI ble behandlet med natriumbisulfitt og suspendert i 40 ul TE-buffer, som beskrevet [22]. For det andre PCR ble utført ved anvendelse av 1 pl alikvot av natriumbisulfitt-behandlede DNA, primere som er i stand til å forsterke både denaturert og unmethylated DNA (tabell S1) [23], SYBR grønn I (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, MD, USA), og en iCycler termosykler (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). For det tredje, HRMA av PCR-produktet ble utført for å oppnå smelteprofilen av PCR-produktet ved å plotte den negative deriverte av fluorescens høy temperatur (Df /d
T
vs
T
), bruker iCycler termosykler programvare (Bio-Rad Laboratories, Ver. 2.1). Til slutt ble metylering nivået av en prøve bestemt ved sammenligning av dets smelteprofil med de fullt metylerte og unmethylated kontroller, sammen med blandinger av 0, 20, 40, 60, 80, og 100% denaturert kontroller. Som et fullt metylert kontroll, genomisk DNA behandlet med
Sss
I-metylase (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) ble anvendt. Som et fullt unmethylated kontroll ble natriumbisulfitt-modifisert DNA oppnådd fra ikke-kreft esophageal slimhinne uten metylering av de analyserte områdene anvendt.
Genomisk DNA Kopier nummer analyse
Kopier nummer endringer av genomiske regioner ble analysert ved kvantitativ real-time PCR ved hjelp av en iCycler termosykler (Bio-Rad Laboratories) med SYBR grønn jeg (BioWhittaker Molecular programmer). Antallet DNA-molekyler i en prøve ble målt i tre regioner flankekandidatgener og kontrollgener [
ALB plakater (4q13.3),
GAPDH plakater (12p13) og
KCNA1
(12p13.32)] ligger på kromosomale regioner med sjeldne kopitall endringer. Primersekvensene er vist i Tabell S2. Antallet av DNA-molekyler i de tre kandidat gener ble normalisert til de for kontroll gener. Den normaliserte antall DNA-molekyler i en prøve ble sammenlignet med den i human leukocytt-DNA for å oppnå kopitall endringer. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer. Betydelig kopitall endringer (gevinst eller tap) ble definert som mer enn en 1,5 ganger økning eller mindre enn en 0.67-fold nedgang.
Patologisk Analyse av fraksjon av kreftceller
Fra parafininnstøpte kirurgiske prøver, serie slice seksjoner med 3-mikrometer tykkelse ble forberedt. En del ble farvet med hematoksylin-eosin, og de gjenværende delene ble anvendt for DNA-ekstraksjon. En erfaren patolog (R. K.) anslått brøkdel av kreftceller ved mikroskopisk undersøkelse.
Statistiske analyser
Korrelasjonen mellom brøkdel av kreftceller anslått av brøkdel markør og som vurderes av patolog ble analysert ved hjelp av Pearsons produkt-moment korrelasjon koeffisienter. En forskjell i de midlere fraksjoner av kreftceller ble analysert ved Students t test, og forskjellen i variansene av kreft cellefraksjon ble analysert ved Levene test. Alle analysene ble utført ved bruk av PASW statistikk versjon 18.0 (SPSS Japan Inc., Tokyo, Japan), og resultatene ble betraktet signifikant når p-verdien og 0,05 ble oppnådd ved en to-sidig test.
Resultater
Valg av spesifikke regioner av Genome-wide Screening
Genome-wide metylering analyse ble utført ved hjelp av DNA i) 28 ESCCs oppnås ved endoskopisk biopsi, ii) fire ESCC cellelinjer (KYSE30, KYSE50, KYSE220, og KYSE270), iii) perifere leukocytter av en sunn frivillig, iv) en pool av normal esophageal slimhinner av fire friske frivillige, og v) en pool av ikke-kreft esophageal slimhinner av åtte ESCC pasienter. Vi søkte etter CpG områder som var sterkt metylert (β verdi 0,8) i alle de fire ESCC cellelinjer og neppe metylert (β verdi 0,1) i perifere leukocytter, pool av normale slimhinner, og pool av ikke-kreft slimhinner, og isolerte 2,752 CpG nettsteder fra 470,870 informative CpG nettsteder. Fra 2,752 CpG-områder, valgt vi 14 CpG områder hvor forekomsten av hypermethylation (β verdi 0,5) i de 28 ESCCs var mer enn 50% (figur 1B).
De 14 CpG områder ble avledet fra 11 genomiske regioner, som vi definert som områder innenfor 500bp for bekvemmelighet (tabell 1). Fra de 11 genomiske regioner, vi ekskludert
SOX2OT
, som ble rapportert å være svært forsterket i ESCC celler [24], og tre regioner uten kjente gener. For de syv gjenværende regionene, forsøkte vi å designe primere for MS-HRMA, som er kjent som en sensitiv og spesifikk metode for å vurdere DNA-metylering nivåer [25]. Vi var i stand til å designe primere for tre regioner (
TFAP2B
,
ARHGEF4
, og
RAPGEFL1
) (figur 1C).
No.
Gene symbol
Gene navn
Chr
nt, antall
Probe ID
Forholdet til CpG island
posisjon for å genet
Forekomst
a
1
TFAP2B
** transkripsjonsfaktor AP-2 beta650791202cg27260772IslandBody2450791419cg22248052IslandBody142
SOX2OT
SOX2 overlapp transcript3181438216cg05513806S_ShoreBody223
ARHGEF4
** Rho guanin nukleotid utveksling faktor (GEF) 42131792772cg13024709IslandBody204
RAPGEFL1
** Rap guanin nukleotid utveksling faktor (GEF) -lignende 11738347603cg20668644IslandBody1938347968cg24903006S_ShoreBody1938347710cg00129651IslandBody145
GRK7
*G protein-koblet reseptor kinase 73141516705cg25640519S_ShoreBody186
–
2200327334cg07835424Island-187
–
2119607885cg09385093Island-188
KCNA3
*Potassium spennings gated kanal, shaker-relaterte underfamilien, medlem 31111217194cg20302133Island1stExon159
BCAT1 product: * forgrenede aminosyre-nase 1, cytosolic1225055967cg20399616IslandBody1410
KLF16 product: * Kruppel-lignende faktor 16191857004cg04998634IslandBody1411
–
1170630558cg23089825Island -14Table 1. Genomisk regioner identifisert ved beadchip analyse
MERK:
en
Forekomst av hyppigheten av hypermethylation (βvalue 0,5) i 28 ESCCs.. ** Primere for HRMA ble vellykket utformet. * Grunnmaling for HRMA kan ikke utformes. CSV Last ned CSV
Kvalifisering av de tre regionene som en brøk Marker
For å bekrefte at de tre regionene var helt unmethylated i ikke-kreftceller, og helt metylert i kreftceller, vi analyserte deres metylering nivåer i jeg ) åtte LCM-renset ikke-kreftcelleprøver fra åtte ESCCs, ii) åtte LCM-renset kreft celleprøver fra de åtte ESCCs, iii) de åtte ESCCs før LCM, iv) perifere leukocytter av en sunn frivillig, og v) de fire ESCC cellelinjer (figur 2A).
(A) metylering nivåer av de tre regionene ble analysert i i) åtte LCM-renset ikke-kreftcelleprøver fra tre ESCCs, ii) åtte LCM-renset kreft celleprøver fra de tre ESCCs, iii) åtte ESCCs før LCM, iv) perifere leukocytter fra en frisk frivillig, og v) fire ESCC cellelinjer. En eller flere av de tre regionene ble nesten fullstendig metylert i rensede kreftceller og cancercellelinjer, og alle ble neppe metylert i ikke-cancerceller. (B) Kopier nummer endringer av de tre regionene ble analysert ved kvantitativ PCR hjelp 15 ESCCs.
I de åtte LCM-renset ikke-kreftcelleprøver og de perifere leukocytter, alle de tre regionene var nesten helt unmethylated, og i de fire ESCC cellelinjer, alle av dem var helt denaturert. I de åtte LCM-rensede cancer celleprøver, i det minste en av de tre regionene var nesten fullstendig denaturert. Men
TFAP2B
i prøven Et5T,
ARHGEF4
i Et1T, Et2T, Et4T, og Et5T, og
RAPGEFL1
i Et2T var ikke helt denaturert, muligens på grunn av heterogenitet blant kreftceller. Slike områder var ikke egnet som en brøkdel markør for noen spesifikke eksempler. På samme tid, i regionen med høyest metylering nivået i LCM-rensede cancer celleprøver viste også den høyeste metylering nivået i ESCCs før LCM. Derfor ble det høyeste nivået metylering av de tre regionene anses å reflektere brøkdel av kreftceller i ESCCs.
metylering nivået av en region i en prøve kan bli påvirket av et kopitallet endring av regionen. Derfor analyserte vi kopitall endringer av de tre regionene som bruker 15 ESCCs (figur 2B). For
ARHGEF4
ble ingen signifikant kopitall endringer observert. I motsetning til for
TFAP2B Hotell og
RAPGEFL1
, betydelig kopitall endringer ble observert ved lave frekvenser (
TFAP2B
, 1.64-1.65 fold endringer i tre av de 15 ESCCs;
RAPGEFL1
, 0,60 ganger endring i en av de 15 ESCCs). Forutsatt at to-fold eller 0,5-gangers kopitall forandringer var tilstede i kreftceller, ble et avvik av den målte metylering nivå fra den egentlige fraksjon av kreftceller beregnet til å være mindre enn 17,2% (figur S1). Også forekomsten av betydelig kopinummer endringer av
TFAP2B Hotell og
RAPGEFL1
var lav (
TFAP2B
, 20%;
RAPGEFL1
, 6,7%) . Derfor effekten av kopiantallet endringer av
TFAP2B
, og
RAPGEFL1
ble ansett for å være minimal i beregningen av en brøkdel av kreftceller. Til slutt har vi definert brøkdel av kreftceller som det høyeste nivå metylering av de tre regionene.
Analyse av nøyaktigheten av Fraction Marker
Vi deretter analysert hvorvidt kreftcellen brøkdel estimert ved brøkdel markør virkelig reflektert brøkdel av kreftceller beregnet ved mikroskopisk undersøkelse. Vi målte metylering nivåer av de tre regionene i 20 ESCCs (figur 3A), og beregnet brøkdel av kreftceller i hver prøve, ved å bruke den høyeste verdi av de tre regionene. I de 20 ESCCs,
TFAP2B
,
ARHGEF4
, og
RAPGEFL1
viste de høyeste verdiene i ni, ni, og to prøver, henholdsvis. Uavhengig av hverandre, ble den fraksjon av kreftceller estimert ved mikroskopisk undersøkelse av seriesnitt. Vi var i stand til å observere en god korrelasjon mellom de to metodene (r = 0,85; p 0,001) (Figur 3B). Dette resultat bekreftet at brøkdel av kreftceller som er estimert av fraksjonen markør nøyaktig reflekterte den egentlige fraksjon av kreftceller i en tumorprøve.
(A) metylering nivåer av de tre regionene ble analysert i 20 ESCCs av MS-HRMA. Fraksjonen av kreftceller i hver prøve ble definert som den høyeste nivå metylering av de tre regionene. (B) Korrelasjon mellom brøkdel av kreftceller anslått av brøkdel markør og som vurderes ved mikroskopisk undersøkelse. Korrelasjonen mellom de to metodene, beregnet ved hjelp av Pearsons produkt-kovariansen, var tilstrekkelig høy (r = 0,85).
Bruk av Fraction Marker
Vi søkte brøkdel markør for å sammenligne fraksjoner av kreftceller mellom biopsiprøver og kirurgiske prøver. Fraksjonene av kreftceller i 39 biopsiprøver og 96 kirurgiske prøver ble vurdert ved hjelp brøkdel markør. Blant de 135 prøvene,
TFAP2B
,
ARHGEF4
, og
RAPGEFL1
hadde de høyeste verdiene i 60, 37, og 38 prøver, henholdsvis, og de høyeste verdiene ble definert som fraksjoner av kreftceller i prøvene. Den midlere fraksjon av cancerceller i biopsier (gjennomsnitt ± SD, 53,5 ± 17,1%; rekkevidde, 7,3 til 86,7%) var ikke signifikant forskjellig fra den i de kirurgiske prøver (56,7 ± 18,9%, 14,0 til 87,3%) (p = 0,377) (figur 4A). Variansene var stor i begge de biopsiprøver og i de kirurgiske prøver, og det var ingen signifikant forskjell mellom de biopsiprøver og kirurgiske prøver (p = 0,076). Dette bekreftet at forurensning av normale celler må tas vare på for analyse av tumor-DNA-prøver med ukjente kreftcelleinnhold.
(A) Anvendelse av fraksjonen markør til sammenligning av den fraksjon av kreftceller mellom biopsiprøver og kirurgiske prøver. Fraksjoner av kreftceller i 39 biopsiprøver og 96 kirurgiske prøver ble beregnet ved fraksjonen markør, og ble ikke observert noen signifikant forskjell. (B) Anvendelse av fraksjonen markør til DNA-metylering analyse. Rå p-verdier av to CpG nettsteder [cg22879515 (MIR34B), cg23180938 (CDO1)] ble korrigert av kreftcelleinnholdet i 28 ESCCs. Noen ESCCs hadde nesten fullstendig metylering (β verdi ≥ 0,8).
Fraksjonen markør ble også brukt for å utelukke effekten av forurensning av normale celler i DNA metylering analyse. For dette formålet, valgte vi CpG områder innenfor 200 bp fra transkripsjonsstartsider (TSS200) for to tumor-suppressor gener (cg22879515 (
MIR34B
) [26], og cg23180938 (
CDO1
) [27]), og utlignet fordelinger av deres p-verdiene som ble oppnådd i det første genom-wide metylering analyse. CpG steder i TSS200 av tumor-suppressor gener ble brukt siden de var forventet å ha noen eller fullstendig metylering i kreftprøver på grunn av veksten fordel gitt av deres metylering. De βvalues av de to CpG nettstedene var mindre enn 0,1 i de perifere leukocytter, pool av normale slimhinner, og pool av ikke-kreft slimhinner, og de to CpG steder ble ansett for å være nesten helt unmethylated i normale celler. Rå p-verdiene for de to CpG områder og βvalues korrigert for kreftcelleinnholdet [Korrigert β verdi = β verdi /(en fraksjon av ESCC celler i prøven (%) /100)] ble så sammenlignet (figur 4B). Bruke beta verdiene korrigeres ved brøkdel markør, noen prøver viste fullstendig metylering (β verdi ≥ 0,8), noen prøver viste nesten ingen metylering (β verdi 0,2). Dette resultatet antydet at ved å bruke fraksjonen markør, var vi i stand til å minimalisere effekten av forurensning av normal celle-DNA i tumor DNA-prøver for analyse metylering.
Diskusjoner
I denne studien ble brøkdel av kreftceller i en ESCC prøve vellykket estimert ved hjelp av DNA metylering nivåer som en brøk markør. For å oppnå dette, isolert vi tre genomiske regioner (
TFAP2B
,
ARHGEF4
, og
RAPGEFL1
) som var sterkt og ofte metylert i ESCC celler, men ikke i normale celler ved genom-wide metylering analyse. Dette er den første studie hvor en fraksjon av kreftceller i en tumor-DNA-prøve ble beregnet ved bruk av DNA-metylering. Nylig har differensielt denaturert genomiske områder mellom kreft og normale celler har blitt identifisert i mange typer kreft [14-18]. Derfor kan vi forvente å identifisere spesifikke genomiske regioner høyt og ofte metylert i de andre typer kreftceller, men ikke i normale celler. Ved å måle DNA-metylering nivåer av slike spesifikke genomiske regioner, kan fraksjonen av kreftceller blir også estimert i DNA-prøver av andre typer kreft.
Nøyaktigheten av fraksjonen markør ble verifisert ved å sammenligne den fraksjon av kreftceller som er estimert av fraksjonen markør med det anslått ved mikroskopisk undersøkelse. En høy nøyaktighet ble støttet av en god korrelasjon mellom de fraksjoner av kreftceller anslått av de to metodene (r = 0,85). Også metylering nivåene av to CpG steder i TSS200 av to tumor-suppressor gener (
MIR34B Hotell og
CDO1
) ble korrigert, og noen kreftprøver viste nesten fullstendig metylering. Spredningsdiagram analyse av p-verdiene før og etter korreksjon viste at noen av prøvene med lav P-verdier hadde store økninger (figur S2). Praktisk talt, har vår brøkdel markør fordel over mikroskopisk undersøkelse fordi den kan brukes for prøver bare med DNA og innvielsen av erfarne patologer er ikke nødvendig. Vår fraksjon markør har også en fordel i forhold til fremgangsmåter ved bruk av SNP microarray og NGS fordi den kan brukes selv uten sammenkoblede normale prøver, og kan analyseres forholdsvis enkelt og billig. Derfor er anvendelsen av en fraksjon markør har rimelig nøyaktighet, og praktiske fordeler fremfor de andre fremgangsmåter.
En begrensning av vår fraksjon markør er at estimeringen kan påvirkes ved heterogenitet blant kreftceller fordi de tre regionene er ikke alltid helt metylert i kreftceller. Siden kreftceller er teoretisk klonal ble heterogenitet ansett for å være på grunn av metylering eller demetylering under progresjon av kreft. For å minimere effekten av heterogenitet blant kreftceller, ble tre regionene valgt som de med høyest forekomst av hypermethylation (βvalue 0,5) blant de 28 ESCCs. Vi bekreftet også at ved anvendelse av åtte parede LCM-renset kreft og ikke-kreftcelleprøver, ble i det minste en av de tre regionene nesten helt metylert i noen cancerceller. En annen begrensning er at eksemplar nummer endringer kan påvirke estimeringen. For å utelukke effekten av kopitall endringer på estimering, vi også undersøkt kopinummer endringer av de tre regionene i 15 ESCCs, og bekreftet at eksemplar nummer endringer som kan føre til et stort avvik på estimering av brøkdel av kreftceller ble ikke observert i de tre regionene. På grunn av disse egenskaper, kan fraksjonen markør fremstilt av de tre regionene kan brukes for de aller fleste av ESCCs. Til slutt, i prøven Et3N, en LCM-renset, ikke-kreftcelleprøve, de tre regionene var litt metylert. Dette ble ansett for å være på grunn av ufullstendig rensing ved LCM fordi grensene mellom kreftcellegrupper og ikke-kreftcellegruppene var meget uklart i denne prøven.
Som konklusjon kan DNA-metylering benyttes for estimering av den fraksjon av kreftceller i en tumor-DNA-prøve. Estimeringen er ansett for å være en praktisk og nøyaktig metode for molekylær analyse av kreftvev i hvilken normale celler er nesten alltid forurenset. DNA metylering brøkdel markør er forventet å være svært fordelaktig i mange aspekter av kreftforskning.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Målt metylering nivå og sann brøkdel av kreftceller. Forutsatt at en 2 gangers kopitall vinning var til stede i kreftceller, ble den virkelige fraksjon av kreftceller beregnet som [Målt metyleringen nivå (%) /(200-Målt metylering nivå (%))] x100. Forutsatt en 0,5-gangers kopitall tapet var til stede i kreftceller, ble den virkelige fraksjon av kreftceller beregnet som [2xMeasured metyleringen nivå (%) /(100 + Målt metylering nivå (%))] x100. Et avvik av den målte metylering nivå fra den egentlige fraksjon av kreftceller ble beregnet til å være mindre enn 17,2% både i 2-ganger forsterkning og i 0,5-gangers tap.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082302.s001 plakater (TIF)
Figur S2. Host Sammenligning av betaverdier før og etter korreksjon. Raw beta verdier av to CpG nettsteder [cg22879515 (
MIR34B
), cg23180938 (
CDO1
)] ble korrigert av kreftcelleinnholdet i de 28 ESCCs. X-aksen viser den rå betaverdier, og y-aksen viser p-verdier etter korreksjonen.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082302.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
Grunning og betingelser for MS-HRMA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082302.s003 plakater (docx)
Tabell S2.
Grunning og betingelser for kvantitativ PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082302.s004 plakater (docx)
Takk
Vi takker Mr. Mark Glaire for korrekturlesing av vårt manuskript og National Cancer Center Forskning Kjerne Facility for utarbeidelse av seksjoner fra parafininnstøpte kirurgiske prøver i denne studien.
