Abstract
Tumor blodkar fungerer som en viktig livline for tumorprogresjon og forenkler metastatisk spredning. Novel vaskulær målrettingsstrategier tar sikte på å opprettholde vaskulær avslutning kan potensielt forårsake betydelig skade, noe som resulterer i en betydelig tumorvekstforsinkelse. Vi undersøkte kombinasjonen av to nye komplementære vaskulære målretting midler med strålebehandling i en strategi som mål å opprettholde vaskulær forstyrrelse. Forsøkene ble utført med deltaliknende ligand 4 (Dll4) blokade (angiogenese deregulator) behandling administrert i kombinasjon med en strålebasert vaskulær ødeleggelse behandling i et sterkt aggressive godt perfusert colon cancer tumor linje implantert i hunn atymiske nakne mus. Svulster ble behandlet med permutasjoner av stråling, ultralyd-stimulert mikrobobler (USMB) og Dll4 monoklonalt antistoff (mAb). Tumor vaskulær respons ble vurdert med tredimensjonal effekt Doppler ultralyd for å måle aktiv flyt og immunhistokjemi. Kreftsvulster ble vurdert med histochemical analyser og langsgående målinger av tumorvolumet. Våre resultater tyder på en signifikant tumorrespons i dyr som ble behandlet med USMB kombinert med stråling, og Dll4 mAb, som fører til en synergistisk tumorvekst forsinkelse på opptil 24 dager. Dette er sannsynligvis knyttet til rask celledød i svulsten og en vedvarende svulst vaskulær nedleggelse. Vi konkluderer med at trippel kombinasjonsbehandlinger forårsake en vaskulær nedleggelse etterfulgt av en vedvarende hemming av angiogenese og tumor celledød, som fører til en rask svulst vaskulær-baserte «kollaps» og en betydelig tumorvekst forsinkelse
Citation. El Kaffas A, Nofiele J, Giles A, Cho S, Liu SK, Czarnota GJ (2014) Dll4-Notch Signale Blockade synergizes Kombinert ultralyd-stimulert av mikro og strålebehandling i human Colon Cancer xenografter. PLoS ONE 9 (4): e93888. doi: 10,1371 /journal.pone.0093888
Redaktør: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, USA
mottatt: 7 august 2013; Godkjent: 10 mars 2014; Publisert: 15 april 2014
Copyright: © 2014 El Kaffas et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Terry Fox Foundation gjennom et program prosjektstøtte «Ultralyd for Cancer Therapy». Dr. Gregory Czarnota er kliniker-forsker og støttes av en CCO Research Chair i Experimental Therapeutics og bildebehandling. Dr. Stanley Liu er en kliniker-forsker og støttes av en OICR (Ontario Institute of Cancer Research) tidlig stadium etterforsker award og erkjenner støtte fra PCC (Prostate Cancer Canada). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Song Cho er ansatt i MedImmune. Dette endrer ikke tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Svulster krever aktivering av en angiogen «bryter» for å vokse 1-2 mm utover
3 i volum. Vaskulær utvikling i tumorer skjer via frigjøring av en rekke endotelial vekstfaktorer og angiogenese-regulatorer (dvs. vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), delta-lignende ligand 4 (Dll4)), noe som fører til neo-vaskularisering overveiende via en spirende prosess som minner om embryonal utvikling [1] – [3]. Nydannede fartøy tilveiebringe en livline av næringsstoffer og oksygen for å tillate videre tumorvekst. Anti-angiogene narkotika, opprinnelig utviklet for å blokkere utviklingen av tumor blodkar, har blitt viktige kreftbehandlingen. For noen tid, farmakologiske anti-VEGF agenter fått viktig bakken i målretting angiogenese, men ble funnet å være mindre effektive enn opprinnelig forventet på grunn av svulst resistensmekanismer [4], [5]. Men disse agentene ble vist seg å være nyttig når strategisk kombinasjon med andre anti-kreft terapi [6]. For tiden er farmakologiske midler målrettet mot forskjellige aspekter av tumor angiogenese blir utviklet og undersøkt i forbindelse med ulike eksisterende terapeutiske modaliteter.
En rekke fysiologiske og biologiske faktorer stimulere svulst vaskulær utvikling (dvs. hypoksi). Disse stimuli fungere som eksterne køer for angiogen (dvs. VEGF, Dll4) molekylære signal. Notch vei har vist seg å regulere den spirende av nye skip i tumorer [7], [8]. Notch ligand Dll4 ble funnet å tilveiebringe kritisk regulatorisk nedstrøms signalisering for å initiere VEGF stimuli [9], [10]. Denne veien har blitt identifisert som en lovende ny kreftbehandling mål [9]. Studier har vist at inhibering av Dll4 aliserte resulterer i overdreven, men ikke-funksjonell angiogenese i tumorvev [11], [12]. I tillegg fører Dll4 blokade en betydelig tumorvekstforsinkelse i forskjellige tumorcellelinjer [11], [12]. Studier har også vist muligheten av Dll4 blokade i kombinasjon med andre kreftterapier [8], [11] – [15]. En fersk studie observert synergistisk forbedring av tumorvekst forsinkelse når en nøytral Dll4 monoklonalt antistoff (mAb) ble kombinert med strålebehandling [15].
I tillegg til de mange farmakologiske midler som er utviklet for å målrette angiogenese, nye biofysiske vaskulær målretting midler, inkludert ultralyd-stimulert mikrobobler og gull nanopartikler, er også blitt vist å øke konvensjonell kreftbehandling effekt [16] – [19]. Disse har blitt foreslått å forårsake en hurtig innsettende svulst vaskulær nedleggelse og /eller økt åreveggen permeabilitet, handle for å strategisk forbedre effekten av kreftmedisiner eller strålebehandling. . Mer nylig Czarnota
et al product: [19] – [23] viste at ultralyd-stimulert mikrobobler (USMB) forbedrer tumor celledød i prostata, blære og brystkreft cellelinjer. De hevdet at forbedring av stråling reaksjon var knyttet til biofysiske membranskade av tumor endotelceller forbundet med mikrobobler stimulering, senere fører til ceramid signalering og en vaskulær nedleggelse på grunn av endotelceller celledød [22]. Observasjonene er potensielt knyttet til nylig rapportert,
asmase
-avhengig, akutt endothelial apoptose etter enkelt store doser av stråling [2], [24], [25].
I dette arbeidet, vi har undersøkt Dll4 blokade følgende kombinert ultralyd-mikrobobleutskillere og stråling-baserte vaskulær ødeleggelse i en svært aggressiv og godt dynket tykktarmskreft linje. Svulster ble dyrket i bakbenet hos mus og behandlet med permutasjoner av stråling, USMB og Dll4 monoklonalt antistoff (mAb). Dyrene ble fotografert ved hjelp av tredimensjonal effekt Doppler ultralyd for å undersøke endringer i svulst perfusjon (blodstrøm) med behandling.
Tredimensjonal høyfrekvente makt Doppler ultralyd er et ideelt avbildningsfunksjonalitet for pre-klinisk vurdering av tumorvaskulatur i dyremodeller [26] – [28]. Det gir høy oppløsning strukturell informasjon og forbedret Doppler strømningssignalet deteksjon. I tillegg gjør den lettvinte bruk den egnet for longitudinelle studier, der relative endringer i blodkar kan vurderes. Doppler resultater ble supplert med vaskulære tettheter bestemt fra CD31 farging av tumor tverrsnitt. Tumor respons på Dll4 mAb, ultralyd-mikrobobler og strålekombinasjonsterapi ble også vurdert med målinger av immunhistokjemi og tumorvekstmålinger.
Resultatene indikerer at Dll4 blokade fulgt av USMB og stråling frembringer en synergistisk tumorvekstforsinkelse som er større enn når strålingen er kombinert med Dll4 mAb alene. Disse funnene tyder også på at USMB og stråling handle til akutt stenge tumor vaskulatur, som i andre typer av tumorer, men at på grunn av den aggressive art av tykktarmskreft cellelinje, følger en hurtig svulst rebound. Behandling med Dll4 mAb deregulates deretter neovakularisering, som fører til minimal funksjonell tumor blodkar og en vedvarende svulst vaskulær «sammenbrudd». Således er kombinasjonen av DLL4 blokade med USMB og stråling er en ny, meget effektiv metode for å forsinke tumorvekst gjennom biologisk og biofysisk målretting av tumorvaskulatur.
Materialer og metoder
xenograft tumor Model
Alle dyreforsøk som presenteres i dette arbeidet ble utført i samsvar med internasjonalt anerkjente retningslinjer fastsatt i protokoller godkjent av Sunnybrook Research Institute institusjonelle dyr omsorg og bruk komité. Alle dyr prosedyrer ble utført under anestesi, slik som beskrevet nedenfor, og alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. For denne studien ble opp til 90 dyrene tilfeldig delt inn i 3 kullene. Dyr i kullet 1 ble avlivet ved 24 timer, ble dyr i kullet 2 avlivet 7 dager og dyrene i kohort 3 ble holdt i tumorvekst Vurderingen i opptil 30 dager. For å initiere tumorvekst, LS174T (3 x 10
6) tykktarmskreftceller (ATCC, Manassas, VA) ble injisert subkutant inn i høyre bakben fra 6 til 7 uker gamle hunn atymiske nakne mus (Harlan, Indianapolis, IN). Alle tumorer vokste i 9-14 dager for å oppnå et midlere volum på 200 mm
3. Et gjennomsnitt på 5 dyr ble brukt per behandling betingelse for hver av behandlingsvurderingsmetoder (dvs. effekt Doppler, vekstforsinkelse, immunhistokjemi).
Behandling Administration
Tumor-bærende dyr ble gitt en av seks behandlinger: (1) ingen behandling (CTRL), (2) stråling (XRT), (3) Dll4 mAb, (4) XRT og Dll4 mAb, (5) ultralyd-stimulert mikrobobler (USMB) kombinert med XRT, eller ( 6) en trippel kombinasjon av USMB, XRT og Dll4 mAb. Dyrene ble bedøvet med isofluorane før bildebehandling eller for kateterinnleggelse (når du mottar USMB behandling). Alle dyrene som fikk strålebehandling ble behandlet med en enkelt dose av 5 Gy ioniserende stråling administrert ved å anvende en Faxitron kabinett stråle (Faxitron Bioptics, Lincolnshire, IL), ved bruk av røntgenstråler ved en energi på 160 kVp, en SSD på 35 cm, og en doserate på 200 cGy /min. For strålebehandling, ble hoveddelen av hvert dyr er dekket med 3 mm tykt bly skjerming, utsette bare tumoren. Dyrene som fikk den Dll4 monoklonalt antistoff (mAb; MedImmune LLC, MD) ble administrert mAb to ganger ukentlig, med start på behandlingsdagen etter avbildning, i en dose på 5 mg /kg kroppsvekt. Dyr som mottar stråling i forbindelse med Dll4 mAb, mottok den første anti-Dll4 mAb behandling 1 time etter bestråling. Dll4 mAb behandling ble fortsatt i dyr inntil avlivning (24 timer eller 7 dager), eller inntil en tumorvolum nås i det minste det dobbelte av det opprinnelige volum. En skjematisk av behandlingen tilførsel og avbilding plan er vist i figur S1A.
For dyr behandlet med USMB, Definity mikrobobler (perfluorpropan gass /liposom skall, Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, Massachusetts) ble fremstilt ved anvendelse av en Vialmix anordning (Lantheus Medical Imaging) og administreres gjennom et halevenekateter på en volumkonsentrasjon av 3% vol /vol (1,08 x 10
9 mikrobobler i 90 ul), som er omtrent 300-ganger anbefalt diagnostisk avbildning dose 10 ul /kg [19]. Dyrene ble deretter nedsenket i et vannbad ved 37 ° C for å bli utsatt for ultralyd. Behandlingssystemet er utformet på en slik måte at bare den nedre del av kroppen til dyret er nedsenket i vannbadet, utsette bare tumorvolumet for ultralydfeltet i fokus for transduseren. Ultralyd terapi system involvert en mikroposisjoneringssystem, bølgegenerator (AWG520, Tektronix, Beaverton, OR), effektforsterker med pulser /mottaker (RPR4000, Ritec, Rochester, NY), og en digital innsamlingssystem (CC103, Agilent, Monroe , New York). Svulster ble eksponert i den halve maksimale topp av det akustiske signal (-6 dB strålebredde på navet på 3,1 cm, og fokuseres ved 8,5 cm) under anvendelse av en 16-sykluser tonestøt på 500 kHz senterfrekvens med en 2,86 cm diameter element ultralyd svinger (ILO509HP, Valpey Fisher Inc., Hopkinton, MA). En 3 kHz pulsrepetisjonsfrekvens i løpet av 50 ms ble anvendt for lydbehandling, sammen med en topp negativt trykk innstilt på 570 kPa, noe som tilsvarer en mekanisk indeks (MI) på 0,8. Total lydbehandling gang var ~ 5 ms innenfor hver 50 ms vindu. En periodisk 1950 ms perioden mellom lydbehandling vinduer ble ansatt for å minimere biologiske oppvarming i vev under ultralydeksponering. Den totale svulst akustisk belysning tid var 750 ms mer enn 5 minutter for en total kapasitet på 0,25% [19]. Denne spesielle pulssekvens har vist seg å ha gode radiosensitizing effekter, samtidig som blodkar for å fylle opp med bobler 150 ganger i løpet av behandlingen. Svulster ble bestrålt med en 5 Gy dose av ioniserende stråling umiddelbart etter USMB behandling.
High-Frequency ultralyd Strøm Doppler Imaging
Alle dyr ble fotografert med tredimensjonale høyfrekvente ultralyd umiddelbart før behandling og 24 timer etter behandling. Data ble ervervet ved hjelp av en Vevo 770 høyfrekvent ultralyd-bildeenhet (Visualsonics, Toronto, ON) med en 30 MHz senterfrekvensen svinger (RMV-707:55 mikrometer aksial oppløsning, 115 mikrometer lateral oppløsning, brennvidde på 12,7 mm). En motorisert skannetrinn (Visualsonics, Toronto, ON) ble anvendt til å anskaffe 3D-B-mode-bilder og strøm Doppler strømningsdata, ved en trinnstørrelse på 0,2 mm. Strøm Doppler data ble samlet med følgende innstillinger: en rot-filter cut-off på 1-2 mm /s, en skannehastighet på 1 mm /s, en pulsrepetisjonsfrekvens på 5 kHz, en makt Doppler gevinst på 20 dB og en bildefrekvens mindre enn 10 fps. Strøm Doppler bildeanalyse ble utført ved hjelp av egenutviklet programvare i MATLAB (De MathWorks, Natick, MA). Vaskulariteten indeks (VI) ble beregnet fra makten Doppler-bilder ved å skaffe volumet av alle fargede objekter (fargede piksler) over volumet av den valgte Rois. En relativ vascularity Indeksen ble brukt for å vurdere generell vaskulær respons på behandling, beregnet som følger: ((VI
24 timer /VI
0 Timer) × 100) -100) eller ((VI
7 dager /VI
0 timer) × 100) -100).
Histologisk analyse
Mus ble avlivet 24 timer, og i en annen årsklasse, 7 dager etter behandling for histologi og immunhistokjemi. Tverrsnitt av tumorxenotransplantater ble farget med hematoksylin eosin (H E) for å evaluere necrosis etter behandling. Tumor xenograft tverrsnitt ble også farget for DNA pauser ved hjelp av
in situ
slutten merking (ISEL) flekken som celledød markør, og klynge av differensiering (CD31) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) til evaluere vaskulær tetthet. Celledød ble kvantitativt bedømt for hver av de tumor ISEL-farget tverrsnitt. Dette ble gjennomført ut ved hjelp av tilpassede MATLAB (De MathWorks, Natick, MA) rutine, som tillater brukeren å beregne antall brune piksler (ISEL-farget) over totalt antall piksler per hele svulsten tverrsnitt. Den vaskulære tetthet ble også beregnet fra bilder av CD31 farget kreft tverrsnitt. For hvert tverrsnitt ble 4 synsfelt (FOV) analyseres på en objektivlinse forstørrelse på 10X for å beregne tettheten av vaskulaturen. Dette ble utført ved å bruke MATLAB (All MathWorks, Natick, MA) for å skille de brune flekker regionene (CD31-farging av endotelceller) i tumoren fra bakgrunnsflekker (andre celler).
Tumorvekst Assessment
Tumor vekst ble vurdert i et gjennomsnitt på 5 dyr per behandling tilstand. Tumor volum ble bestemt av kaliper målinger utføres hver 2-4 dager, og beregnes ved hjelp av modifiserte ellipsoidiske formel (volum = lengde × bredde
2/2). Tumorvolumene ble normalisert til sin startvolumet og tumorvekstforsinkelse ble beregnet ved å subtrahere den gjennomsnittlige antall dager for behandlingsgrupper for å oppnå to ganger sin startvolumet fra den til kontrollgruppen.
Statistical Analysis
kvantifisert relative VI, Isel og CD31 flekker og tumor vekst forsinkelser, ble evaluert for statistisk signifikans ved hjelp av en Mann-Whitney test (to-tailed, forutsatt ulike variasjoner, α = 0,05). Hver behandling tilstand ble sammenlignet direkte til 0 Gy kontroll tilstand. I tillegg er p-verdier fra statistiske tester av forskjellige permutasjoner er oppsummert i tabellene S1 til S7 i tilleggsdataene. Statistiske tester ble utført ved bruk av Prism (GraphPad Software versjon 5, La Jolla, CA).
Resultater
Vi har utført eksperimenter for å vurdere effekten av vaskulær målrettingsstrategier hvor USMB, stråling og anti-Dll4 behandlinger ble kombinert for å ødelegge tumor vaskulaturen og opprettholde vaskulære effekter, for å maksimere total tumorrespons (fig S1B). Tumor blodkar respons ble vurdert med tredimensjonale høyfrekvente makt Doppler ultralyd ved 24 timer og 7 dager etter behandling, i forhold til baseline. Figur 1A viser representative bilder av tredimensjonale strømmen Doppler-data ved 24 timer etter behandling for kontroll (1), Dll4 mAb (3), USMB + XRT (5) og USMB + XRT + Dll4 mAb (6) behandlingsbetingelsene. En reduksjon i strømningssignalet var tydelig i tumorer behandlet med trippelkombinasjonen (6). Kvantifiserte makt Doppler resultater på 24 timer og 7 dager etter behandling presenteres for alle behandlingsforhold i figur 1B og 1C. Det ble observert minimale endringer i VI for kontrolldyrene (1) på begge ganger. Vi observerte en ikke-signifikant økning i kraft doppler-signalet er relatert til blodstrømmen ved 24 timer og 7 dager etter XRT (2). Dyr som fikk Dll4 mAb (3) alene ble observert å ha en reduksjon i strømningssignal (VI) 24 timer etter behandling (p 0,05). I tillegg behandling med Dll4 mAb alene (3) forårsaket VI for å slippe ytterligere 7 dager etter behandling (p 0,05). Behandlinger med USMB + XRT (5) bidro også til raskt (innen 24 timer) og signifikant (p 0,05) reduksjon i effekt doppler-signalet. Men blodstrømmen volumforskjellene ved makten Doppler tilbake til utgangsverdiene etter 7 dager, noe som indikerer en midlertidig, kortvarig mikroboblebasert vaskulære forstyrrelser. Det ble observert en rask VI nedgang på nesten 60% for behandlinger med XRT og Dll4 mAb (4), samt trippelkombinasjonen forhold (6) (p 0,05). Imidlertid VI fallet vedvarte til 7 dager bare i dyr som fikk trippelkombinasjonen (6) behandlinger eller de som fikk Dll4 alene (3) (p 0,05). I motsetning til dette, (4) behandlede dyr indikerer en økning på ~ 25% i VI for XRT + Dll4 mAb en potensiell reperfusjon av svulsten.
A) Representative bilder av tredimensjonale maksimal intensitet projeksjon av kraft Doppler signal på 24 timer etter behandling, og kvantifisert makt Doppler på B) 24 timer og C) 7 dager, blir vist. Dyrene som fikk Dll4 mAb alene hadde en reduksjon i strømningssignal (VI) 24 timer etter behandling levering; VI falt ytterligere 7 dager etter behandling. USMB + XRT forårsaket en rask reduksjon i effekt doppler-signalet. Men tilbake den aktive blodvolum til baseline nivå av 7 dager. En rask VI nedgang på nesten 60% ble observert for XRT og Dll4 mAb samt trippel kombinasjons forhold. Imidlertid VI fallet vedvarte til 7 dager bare i dyrene som fikk den trippel tilstand behandling. Hver eksperimentelle tilstand blir representerer et gjennomsnitt av 5 dyr. Feilstolpene representerer en standard feil av gjennomsnittet. Statistisk signifikante endringer er merket med * (p≤0.05). Målestokk representerer 2 mm
2A, S2A og S2B skjerm representant H . E og ISEL farget kreft tverrsnitt for hver av behandlingene. Data viser celledød ved 24 timer i den kombinerte XRT og Dll4 mAb (4) behandling, samt trippelkombinasjonen (6) behandling tilstand. Celledød regioner vedvarte i tumorer 7 dager etter behandling i begge disse forholdene. Kvantifiserte celledød områder fra Isel farget kreft tverrsnitt er presentert i figurene 2A og 2B. Signifikant (p 0,05) celledød ble observert i tumorer behandlet med USMB + XRT + Dll4 mAb (6), mens en ikke-signifikant økning i celle-død ble observert for dyr behandlet med stråling kombinert med Dll4 mAb (3). Ved 7 dager etter første behandling, bemerket vi signifikant (p 0,05) mengder av celledød både i XRT + Dll4 mAb (4) og den USMB + XRT + Dll4 mAb (6) behandlingsbetingelsene. Videre unike tumor H E farget kreft tverrsnitt for spesifiserte behandlingsforhold ved lav forstørrelse. Den nederste raden er av høy forstørrelse bilder av representative H E farget kreft tverrsnitt for de spesifiserte behandlinger. Den øverste raden skala bar representerer 2 mm og nederste rad skala bar representerer 50 mikrometer. Kvantifisert ISEL flekker på B) 24 timer og C) 7 dager. Signifikant (p≤0.05) celledød ble observert i tumorer behandlet med USMB + XRT + Dll4 mAb, mens en ikke-signifikant mengde av celledød er observert for dyr behandlet med XRT og Dll4 mAb. Ved 7 dager etter første behandling, bemerket vi signifikante (p≤0.05) mengder av celledød i både kombinert XRT + Dll4 mAb og USMB + XRT + Dll4 mAb behandlingsforhold. Statistisk signifikans er merket med * for p≤0.05.
Strøm Doppler og celledød resultater ble supplert med resultater fra CD31 flekker. Representant CD31 immunhistokjemi er vist i figur 3A og S2C. Ved 24 timer etter behandling (figur 3B), bemerket vi en ikke-signifikant, men nær dobling av CD31 flekker hos dyr behandlet med Dll4 mAb (3) bare. I mellomtiden ble det observert en signifikant reduksjon i CD31-farging i dyrene behandlet med USMB + XRT (5), så vel som de som ble behandlet med trippelbehandlingsbetingelsene (p 0,05). Ved 7 dager etter behandling (figur 3C), ble det observert en betydelig økning i CD31-farging for alle dyrene som fikk Dll4 mAb behandling, enten alene (3) eller i kombinasjon med USMB og /eller XRT (4 og 6). Vi har også bemerket at dyr behandlet med XRT alene (2), eller i kombinasjon med USMB (5), hadde CD31 fargenivåer tilsvarende kontrolldyr.
A) Representative bilder av CD31-farging av tumor tverrsnitt. Bildene er av fire av de behandlingsbetingelser som oppnås ved 24 timer og 7 dager etter behandlingen. Målestokk representerer 100 mikrometer. B) Normalisert CD31 flekker per avkastning på 24 timer og C) på 7 dager etter behandling start. Vi merket en ikke-signifikant, men nær dobling av CD31 flekker hos dyr behandlet med Dll4 mAb bare. Det var en betydelig reduksjon i CD31-farging i dyrene behandlet med USMB + XRT, så vel som de som ble behandlet med trippelbehandlingsbetingelsene. Ved 7 dager etter behandlingen, var det en betydelig økning i CD31 farget fartøy for alle dyrene som fikk Dll4 mAb behandling, enten alene eller i kombinasjon med USMB og /eller XRT. Dyr behandlet med XRT alene, eller i kombinasjon med USMB, hadde kvantifisert CD31 farget teller lignende med kontrolldyrene. Statistisk signifikans er angitt med * indikerer et p≤0.05.
Figur 4A viser den normaliserte tumorvekstkurve for hver av behandlingsbetingelsene. Mens kontrolldyrene (1) doblet i volum på mindre enn 5 dager etter behandlingsstart, bemerket vi en forsinket tumorvekst i alle andre behandlingsforhold. Vekstkurver fulgt lignende tendenser for tumorveksten ble behandlet med XRT alene (2), Dll4 mAb alene (3), og den USMB + XRT behandling (5). Tumorer behandlet med XRT og fortsatte Dll4 mAb terapi (4) viser en signifikant synergistisk og tumorvekstforsinkelse (se figur 4B) i 14 dager (p 0,05). Triple kombinasjonsbehandlinger (6) forårsaket størst tumorvekst forsinkelse, med en svak nedgang i tumorstørrelse tydelig på 5 dager etter behandlingsstart, etterfulgt av et avbrudd i vekst som varer i nesten 15 dager. En gjennomsnittlig tumorvekst forsinkelse på 24 dager ble observert (p 0,05). For trippel kombinasjonsbehandling
A) Normaliserte svulst vekstkurver. En forsinket tumorvekst i alle behandlingsforhold ble notert. Tumor vekstkurver fulgt samme trendene for XRT alene, Dll4 mAb alene, og de USMB + XRT behandlinger. Kombinert USMB + XRT + Dll4 mAb ble observert å indusere størst respons, med en reduksjon i tumorstørrelse på 5 dager etter behandling, fulgt av veksthemning som varte i nesten 15 dager. B) kvantifiserte tumorvekstforsinkelse for å nå to ganger utgangsvolumet. Behandlinger med XRT og fortsatte Dll4 mAb opplevd en betydelig synergistisk tumorvekstforsinkelse på 14 dager. I mellomtiden, trippel kombinasjonsbehandling (USMB + XRT + Dll4 mAb) forårsaket en svulst vekst forsinkelse på 24 dager. Statistisk signifikante forskjeller i tumorvekst forsinkelse er angitt med * for p≤0.05.
Diskusjoner
I denne studien har vi satt ut for å undersøke effekten av strategisk kombinere en biofysisk, stråling -basert, vaskulær forstyrre behandling etterfulgt av en angiogenese-dereguleringen farmakologiske agent. Det ble hevdet at dette ville optimalisere behandlingsrespons. For å maksimere vaskulær ødeleggelse, ble ultralyd-stimulert mikroboble-terapi anvendes for å radiosensibilisere første tumor endotelceller, etterfulgt av en enkelt dose av ioniserende stråling (XRT) for å fremkalle raske vaskulære effekter. Dll4 mAb ble senere gitt som en «vedlikehold» terapi. En illustrasjon av fremføres sammen USMB, XRT og Dll4 mAb effekter på tumor endotelceller er presentert i figur 5. Forskjellige permutasjoner av de tre kombinerte behandlingsmetoder ble også undersøkt. Resultatene tyder på en 1.4X synergistisk tumorvekst respons hos dyr behandlet med én økt trippel kombinasjonsterapi (6), hvor en ~ 24 dagers tumorvekstforsinkelse ble oppnådd (figur 4). Dette er sannsynligvis forbundet med en vedvarende tumor vaskulær avslutning indusere celledød i tumoren. Anti-Dll4 mAb behandling virker da å opprettholde vaskulær nedleggelse. Til sammenligning, ved å kombinere stråling og Dll4 mAb (4) forårsaket en signifikant vekstforsinkelse på ~ 14 dager. Ingen annen betydning ble observert i vekstforsinkelse analyser. Svulster som får strålebehandling alene opplevd minst tumorvekst forsinkelse (~3 dager), trolig knyttet til konvensjonelle ikke-vaskulær strålebiologisk DNA-skader.
Vi posit at forbehandling av svulster med ultralyd-aktivert mikrobobler kan først radiosensibilisere cellene via en biofysisk prosess. Ved stråling levering, vil endotelceller først gjennomgå apoptose, hvilket fører til tumor celledød. Fortsatt levering av en angiogenese deregulator ville hindre svulsten reperfusjon, som et vedlikeholdsbehandling.
En reduksjon i tumorstørrelse ble observert innen 5 dager etter trippelkombinasjonen behandling (6), viser en akutt respons og noe som tyder på en rask svulst vaskulær-baserte «kollaps». Vi observerte en kraft Doppler VI reduksjon på mer enn 50% ved 24 timer i begge XRT + Dll4 mAb (4) og trippelkombinasjonsbehandlinger (6), i forhold til strålings alene (2), hvor ingen reduksjon i VI ble observert ( Figur 1). VI nedgangen ble bare påført til 7 dager i trippel kombinasjonsbehandlinger. Tumor volum nedgangen er sannsynligvis assosiert med omfattende vaskulær avslutning, som fører til hurtig dannelse av nekrotiske områder i kjernen av tumoren. Vi posit at døde celler blir raskt oppløst og ryddet i svulster behandlet med trippel kombinasjonsterapi, som skulle forklare mindre omfattende kvantifisert ISEL farging for trippel kombinasjonsbehandlinger (figur 2), og svulsten størrelsesreduksjon. Vi har også observert en betydelig mengde av celledød 24 timer etter denne trippelkombinasjonsterapi (6), mens ingen annen betydning ble funnet i andre behandlingsbetingelsene (figur 2). Her ISEL-kvantifiserte celledød områder per svulst tverrsnitt vedvarte på lang sikt (utover 24 timer) og nådde nesten et gjennomsnitt på 30% av svulsten tverrsnitt av 7 dager etter behandling. Stråling kombinert med Dll4 mAb (4) også medført betydelig celledød 7 dager etter behandlingen, men tumorvolumer i denne tilstand viste seg å være større enn tumor behandlet med trippelkombinasjonsterapien. H E farget bildene viste en vedvarende heterogen og nekrotisk svulstens mikromiljø 30 dager etter behandling (Figur S3). Disse resultatene viser klart styrken av å kombinere USMB, stråling og Dll4 mAb ovenfor (6) og utover enhver terapi alene.
For dyr behandlet med XRT + Dll4 mAb (4) eller USMB + XRT + Dll4 mAb (6 ), en vesentlig og hurtig reduksjon i den vaskulære indeks ble observert ved 24 timer etter behandlingen (figur 1). Imidlertid posit vi at den resulterende vaskulær stans i noen av disse behandlingene er av en forskjellig art. I USMB + XRT + Dll4 mAb (6) behandlede dyr, endotelceller sannsynlig gjennomgår hurtig apoptose forbundet med en membran forstyrrelse på grunn av mikroboble mekaniske påvirkninger, og som resulterer i produksjon ceramid [29], [30]. Retur av funksjonelle fartøy i behandlede tumorer er så undertrykt av Dll4 mAb behandlinger. I motsetning til dette, er behandling med XRT + Dll4 mAb (4) sannsynligvis forårsaker noen endotelial celledøden (som foreslått i CD31-farging), som fører til en midlertidig stans vaskulær [15]. Ved 7 dager etter XRT + Dll4 mAb (4) behandlinger, vises vaskulær indeksen for å komme tilbake til baseline nivå, mens den vaskulære indeksen depresjon vedvarer i trippelkombinasjonen behandlede-dyr.
Behandling med Dll4 mAb alene (3) induserte en tilsvarende reaksjon på de som tidligere er rapportert [9] – [12]. Som forventet, økte kvantifisert CD31 flekker etter behandlingsstart, mens aktive blodstrøm, som målt ved bruk av makt Doppler ultralyd, redusert (figur 3). Dette er karakteristisk for Dll4 blokade, hvor overdreven angiogenese skjer, men paradoksalt vaskulære perfusjon avtar. I denne studien ble nedleggelse av vaskulær funksjon opprettholdes i inntil 7 dager etter start av Dll4 mAb behandling (3) (figur 1). Imidlertid er en tumorvekstforsinkelse lik den stråling alene (2) ble observert, noe som indikerer at Dll4 mAb basert vaskulær avslutning er ikke tilstrekkelig til å indusere betydelig tumor skader (figur 4).
Nyere undersøkelser har vist at forbehandling av svulster med USMB kan radiosensibilisere endotelceller for stråling, deretter øker den generelle responsen av svulster [19]. Vi har funnet at USMB behandling etterfulgt av XRT (5) forårsaker en akutt og signifikant reduksjon i VI, som målt med strøm Doppler ultralyd (figur 1).
