Abstract
Nasofaryngeal karsinom (NPC) er etiologisk assosiert med Epstein-Barr virus (EBV) infeksjon. Men den eksakte rolle EBV i NPC patogenesen fortsatt ukjent. Aktiveringen av signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) er vanlig i humane kreftformer, inkludert NPC og spiller en viktig rolle i patogenesen og progresjon av kreft hos mennesker. Interleukin-6 (IL-6), et viktig inflammatorisk cytokin, er en potent aktivator for STAT3. I denne studien rapporterer vi at EBV-infiserte udødelig nasofaryngeale epitel (NPE) celler ofte få en bedre respons på IL-6-indusert STAT3 aktivisering for å fremme deres vekst og invasive egenskaper. Interessant nok ble dette forbedrede IL-6 /STAT3 respons mediert av overekspresjon av IL-6 reseptor (IL-6R). Videre IL-6R overekspresjon forbedret IL-6-indusert STAT3 aktivering i uinfiserte udødeliggjort NPE celler
in vitro
, og fremmet vekst og tumorigenicity av EBV-positive NPC cellelinje (C666-1)
in vivo
. Videre er det vist for første gang at IL-6R ble overuttrykt i kliniske prøver for NPC. IL-6 ekspresjon kan også være sterkt påvises i stromale celler av NPC og et høyere sirkulerende nivå av IL-6 ble funnet i sera av forhåndslagret NPC pasienter sammenlignet med kontrollpersoner. Derfor IL-6R overekspresjon, kombinert med forbedret IL-6 /STAT3 signale kan lette malign transformasjon av EBV-infiserte premaligne NPE celler til kreftceller, og forbedre maligne egenskaper NPC celler
Citation. Zhang G , Tsang CM, Deng W, Yip YL, Lui VW-Y, Wong SCC, et al. (2013) Forbedret IL-6 /IL-6R signale fremmer vekst og Ondartet Properties i EBV-infiserte premaligne og Cancerous Nasofaryngeal Epitelceller. PLoS ONE 8 (5): e62284. doi: 10,1371 /journal.pone.0062284
Redaktør: Qian Tao, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 12. desember 2012; Godkjent: 19 mars 2013; Publisert: 01.05.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet er finansiert av GRF bevilgninger av Hong Kong stipend Council (Grant nummer~~POS=HEADCOMP: 776608M; 779810M, 780911M til SWT) og RGC sponset Area of Excellence Theme (Grant nummer~~POS=HEADCOMP: AoE /M-06/08 til MLL). VWL støttes av Patricia L. Knebel fond i Pittsburgh Foundation, USA, Karriere 512 Development Program for Specialized Program for fremragende forskning (SPORE) i hode- og halskreft (5P50CA097190-05), hode og nakke kreft SPORE Developmental forskning Award (5P50CA097007). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nasofaryngeal karsinom (NPC) er en distinkt type hode-hals-kreft med høy forekomst i Sørøst-Asia [1]. Dette malignitet er karakterisert ved Epstein-Barr virus (EBV) -infeksjon, så vel som dens høyt inflammatorisk stroma og metastatisk natur [2]. EBV er til stede i nesten alle tilfeller av udifferensiert NPC i endemiske områder og har lenge vært antatt å være et avgjørende etiologisk faktor for NPC patogenesen. Likevel til dato, eksakte rolle EBV i NPC patogenesen er fortsatt uklart [3] – [5]. Rollen av inflammatoriske cytokiner i kreft patogenesen er vel etablert, men deres virkninger på EBV-infiserte premaligne og cancerøse nasofaryngeale epitel er dårlig definert.
Kumulativ bevis tyder på at flere faktorer er involvert i patogenesen NPC i tillegg til eller i forbindelse med EBV-infeksjon [4], [6]. STAT3 aktivering er vanlig i humane kreftformer, inkludert både hematologiske og solide tumorer [7]. Konstitutiv aktivering av STAT3, indikert ved økt ekspresjon av fosfo-STAT3 (p-STAT3), har blitt rapportert i 70% av NPC prøvene [8] – [10]. Under normale fysiologiske forhold, er STAT3 aktiveringen vanligvis forbigående, og er strengt regulert. I tumorceller kan konstitutiv aktivering av STAT3 være forårsaket av unormal og vedvarende autokrine og /eller parakrin signale inkludert interleukin-6 (IL-6) signalering [11] – [13]. IL-6 aktiveres STAT3 ved å binde spesifikt til kognatreseptoren på cellemembranen, dvs. IL-6R. Ved IL-6 binding, aktiverer IL-6 reseptor reseptor-assosiert kinaser (JAK1, JAK2 og Tyk2), som deretter induserer fosforylering og dimerisering av STAT3 (aktivering av STAT3). Aktivert STAT3 blir deretter translokert inn i kjernen for å indusere målgenet transkripsjon [14], [15]. Konstitutiv aktivering STAT3 fremmer tumorvekst og overlevelse, samt invasjon epithelial-mesenchymale overgang og angiogenese [16] – [18]. En nylig studie foreslår at IL-6-mediert aktivering STAT3 kan mediere iNOS induksjon i NPC, noe som resulterer i dannelse av mutagene DNA-lesjoner som kan bidra til dets patogenese [19].
Til tross for den nye biologiske viktigheten av STAT3 aktivering i NPC, forblir den eksakte mekanismen for dets aktivering dårlig definert, spesielt i sammenheng med EBV-infeksjon [20]. L1-TR formidler av en EBV-kodet onkogen, LMP1, inneholder STAT3-responsive element [21]. STAT3 aktivering kan indusere transkripsjon av lmp1 i EBV-infiserte NPC celler. Videre oppregulerer lmp1 ekspresjon IL-6-produksjon [22], [23], som aktiverer STAT3 signalering for å etablere en positiv tilbakekoplingssløyfe fra STAT3 /lmp1 /IL-6 /STAT3 activatioin for å forsterke STAT3 signalisering i EBV-infiserte NPC-celler [22 ].
IL-6-drevet STAT3 aktivering er av særlig betydning i NPC patogenesen.
In vivo
, den inflammatoriske stroma kan representere en kraftig kilde av IL-6 for å drive STAT3 aktivering i EBV-infiserte nasofaryngeal epitelial (NPE) celler for å fremme tumorgenese og sykdomsprogresjon. Selv om IL-6 er et cytokin nøkkel mediere STAT3 signalering, rollen til IL-6 /STAT3 signalisering i EBV-infiserte pre-maligne NPE-celler har ikke tidligere blitt rapportert. Vi har tidligere etablert stabil EBV-infeksjon i immortaliserte NPE-celler [24], [25]. Disse EBV-infiserte NPE-cellelinjer ble anvendt i denne studie for å undersøke den intrikate forholdet mellom STAT3 aktivering og EBV-infeksjon. Interessant, observerte vi for første gang at stabil EBV-infeksjon i immortaliserte NPE celler resulterte ofte i potensiering av deres respons til IL-6-indusert STAT3 aktivering. Videre STAT3 aktivering i disse EBV-infiserte NPE celler forsterket sin forankring uavhengighet og invasive egenskapene
in vitro
. Mekanismene bak den forbedrede IL-6-indusert STAT3 aktivering signalisering i EBV-infiserte nasofaryngeale celler ble undersøkt i denne studien, og den kliniske relevansen i NPC ble utforsket.
Materialer og metoder
Etikk uttalelser
studiene omfatter mennesker ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster, og alle fag gitt skriftlig informert samtykke før studiedeltakelse. Dyret Undersøkelsene ble godkjent av komiteen for bruk av levende dyr i undervisning Forskning ved University of Hong Kong. Ytterste ble benyttet for å forebygge lidelser og minimere antallet av mus som kreves for hvert eksperiment.
Celler og cellekultur
etablering og karakterisering av udødeliggjort cellelinje NPE NP460hTert er tidligere beskrevet [26 ]. Etablering av andre NPE cellelinjer inkludert NP550-cyclinD1-hTert, NP550-CDK4-hTert, NP361-cyclinD1-hTert vil bli rapportert separat. Stabil EBV infeksjon ble oppnådd i disse udødeliggjorte NPE celler og deres dyrkningsforhold har tidligere blitt rapportert [24], [25]. EBV-infeksjon og cellekultur av NPE-celler ble utført som tidligere rapportert [24]. Menneske NPC cellelinjer CNE2, C666-1, HONE1 ble dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma, St. Louis, MO, USA) inneholder 10% FBS ved 5% CO
2 ved 37 ° C.
Plasmider
plasmid for å uttrykke en konstitutivt aktiv mutant STAT3 (pBabe-STAT3-C), IL-6-promoteren luciferase reporter-konstruksjonen (pGL3-IL-6-Luc), og den M67 luciferase reporter plasmid brukt for påvisning av STAT3 aktivering (luc-M67) ble vennlig levert av Dr. JF Bromberg, Institutt for indremedisin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, USA [27]. PUC-IL-6R brukes for ekspresjon av IL-6R ble vennlig levert av Dr. R. Stefan (Institute of Biochemistry, Christian-Albrechts-universitetet i Tyskland) [28]. Den retrovirale ekspresjonsvektor (pBabe-IL-6R) som brukes til å overuttrykke IL-6R ble dannet ved å sette IL-6R-fragmentet fra pUC-IL-6R inn i pBabe vektoren ved Sall. Lmp1 uttrykk plasmid (pcDNA 2117), som ble brukt i en tidligere studie [29] var en generøs gave fra Dr. D.P. Huang, Chinese University of Hong Kong.
Western blotting analyse
Western blot analyser ble utført som beskrevet tidligere [26]. Atom ekstrakter ble preparert fra dyrking celler ved hjelp NE-PER Kjerne- og cytoplasmatiske Utvinning reagenser (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Antistoffene som anvendes til å påvise IL-6R, cyclin D1 og β-aktin ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffene mot STAT3, p-STAT3 (Tyr705) og Bcl-2 ble kjøpt fra cellesignalering (Danvers, MA, USA). Antistoffene mot c-myc, ble anti-Flag innkjøpt fra Sigma. Antistoff mot LMP-en ble kjøpt fra Dako (Glostrup, Danmark). De sekundære antistoffene som ble anvendt pepperrotperoksidase-bundne antistoffer innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Påvisning av antigen i Western blotting var ECL Plus Chemiluminescence reagenser (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) i henhold til produsentens instruksjoner.
Elektro-mobilitet shift-analysen (EMSA)
EMSA ble utført i henhold til manufactor instruksjon med en kommersielt tilgjengelig kit for STAT3 aktivering (Thermo Scientific). I korthet, hele celleekstrakter (4 ug protein) fremstilt fra IL-6-behandlede og ubehandlede celler ble inkubert med biotin-merkede høy affinitet serum induserbare element (hSIE) dupleks oligonukleotid (GATCCATTTCCCGTAAATC). Etter gel elektroforese, bundet STAT3: oligonukleotid ble elektro ved 350 mA til biodyne B membrances (nylon) og festes ved hjelp av en UV tverrbinder. Membranene med det bundne oligonukleotid overført ble blokkert, merket med streptavidin-HPR konjugat ved 1:1000 konsentrasjon, og utsatt for ECL Plus Chemiluminescence reagenser (GE Healthcare) i henhold til produsentens instruksjoner. Supershifting av STAT3: oligonukleotid kompleksene ble oppdaget etter 30 min preinkubasjon med anti-STAT3 antistoff (Santa Cruz)
Transwell Invasion analysen
Boyden kammer invasjonen analysen ble utført ved hjelp av Transwell kammeret fra. Milipore Company (6,4 mm i diameter med 8,0 um porestørrelse) i henhold til en tidligere publisert metode [30]. Cellemigrering ble bestemt som gjennomsnittet av antall celler migrert i ti tilfeldig valgte mikroskopiske felt ved 400 x forstørrelse. Data presentert er gjennomsnitt ± SD av tredoble brønner.
Transient plasmid transfeksjon og luciferase reporter analysen
Lipofectamine
™ 2000 (Invitrogen) ble brukt for transient plasmid DNA transfeksjon i henhold til produsentens instruksjon. For måling av transaktive STAT3 aktivitet i HONE1 og HONE1-EBV-celler, 0,8 ug av M67 luciferase reporter (luc-M67) plasmid per prøve ble anvendt. Påvisning av STAT3 aktivering ble utført med co-transfeksjon av RcCMV STAT3-C eller kontroll vektor med luciferase reporter plasmid. For måling av IL-6-genpromoteren aktivitet i HONE1 celler, 0,8 ug pGL3-IL-6-Luc pr prøve ble benyttet. Forholdet for ildflue luciferase reporter-konstruksjonen og Renilla som ble anvendt var 200: 1. Trettiseks timer etter transfeksjon ble cellene lysert, og luciferase aktiviteter ble målt ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid Kit (Promega, Madison, WI, USA). Den relative luciferase aktiviteten ble normalisert mot verdien av Renilla luciferase signal.
Sanntids Kvantitativ PCR
RNA ble isolert fra prøvene ved hjelp TRIzol (Invitrogen). RNA ble transkribert til cDNA omvendt ved hjelp av SuperScriptII revers transkriptase (Invitrogen) i henhold til tidligere publiserte protokoller [26]. De prober og primere ble utformet ved hjelp av Universal Probe Bibliotek system (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens anvisninger. Reaksjonsblandingen besto av 0,4 ul fremover-primer (10 uM), 0,4 ul bakover primer (10 uM), 10 ul LightCycler masterblanding, 4 mL autoklavert Milli-Q vann, 0,2 ul probe, 5 pl cDNA. Real time PCR ble utført i Min IQTM2 Real Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Gene spesifikke primere og prober som brukes for studien er oppført i tabell 1. De relative nivåer av mRNA transkripsjoner av gener ble undersøkt ble normalisert til nivåer av intern kontroll karakter GAPDH.
Anchorage uavhengig vekst
myk-agar-kolonianalyse ble anvendt for å bestemme forankringsuavhengig vekst av de EBV-infiserte og uinfiserte celler. Den nederste agar (0,6%) ble fremstilt ved å blande 6% bacto-agar og medium ved 1:09 forhold. To ml øvre agar (0,3%) blandes med 1 x 10
5-celler ble deretter sådd ut på toppen av den nederste agar. Størrelsene på kolonier ble scoret etter 3 uker inkubasjon. Bare kolonier 0,2 mm i diameter ble talt opp. Data presentert er gjennomsnitt ± SD av tredoble brønner.
tumorgenisiteten analysen i nakne mus
C666-1 celler (1 x 10
6 celler) ectopically uttrykker IL-6R ble høstet og suspendert i 50 ul PBS, og deretter blandet med et likt volum av Matrigel
™ basalmembran Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Det totale volum av 100 ul cellesuspensjon ble injisert i flanken av 6-8 uker gamle hann nakne mus. Når tumorvekst ble etablert, ble svulststørrelser målt hver annen dag. Tumor volum (gjennomsnitt ± SD) ble beregnet som lengde x bredde
2/2 [31].
MTT analyse
Kort, 1 × 10
3 celler per brønn var sådd ut i 96-brønns plate og inkubert over natten. Deretter ble kulturmediet erstattet med RPMI-medium inneholdende 1% FBS med eller uten rekombinant humant IL-6 og inkubert ytterligere i de angitte tidspunkter. Deretter ble 20 ul av MTT-merkingsreagens (5 mg /ml i PBS, Sigma) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer ved 37 ° C etterfulgt av tilsetning av 200 ul DMSO for å oppløse de formazankrystaller. Absorbansen ble målt ved 570 nm ved hjelp av en multiplate leser (Merck Eurolab, Dietikon, Sveits). Hvert datapunkt representerte gjennomsnittlig ± SD av tre brønner per behandlingsgruppe.
Immunohistochemistry
Tissue microarray (TMA) som inneholder kontroll og prøver NPC vev ble oppnådd fra NPC vev bank etablert av Senter for nasofaryngeal Carcinoma forskning (RGC finansiert Area of Excellence Theme). Seksjoner for immunhistokjemi ble avvokset i xylen og rehydrert i gradert alkohol. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering lysbilder med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter. For antigen gjenfinning, ble alle lysbilder inkubert med 10 mmol /l citratbuffer (pH 6,0) til 93 ° C i 10 minutter, og deretter avkjølt til romtemperatur. Etter dette ble delene skylt med PBS og behandlet med normal blokkeringsserum (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) i 30 minutter. Anti-humant IL-6 antistoff og anti-humane IL-6R-antistoff (Santa Cruz) fortynnet i PBS (1:100) ble påført på seksjonene og inkubert ved 4 ° C over natten. Etter skylling, ble alle seksjonene ytterligere inkubert i 1 time med biotin-konjugert sekundært antistoff og pepperrotperoksydase konjugert streptavidin, etterfulgt av et kromogen, diaminobenzidin (Dako). Kontra ble utført av hematoxylin før dehydrering og montering. De negative kontroller ble utført ved tilsetning av blokkerende peptid for å erstatte binding av de primære antistoffer til antigenene.
ELISA for IL-6
De sirkulerende konsentrasjoner av IL-6 i sera av kontroller og NPC pasienter og supernatantene av cellelinjene ble kvantifisert ved hjelp av ELISA-analyse for IL-6 (R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant i denne studien
Resultater
EBV-infeksjon av udødelig NPE celler forbedret sine svar til STAT3 aktivering indusert av IL. -6
Vi har tidligere rapportert etablering av stabile EBV-infeksjon i en telomerase-udødeliggjort cellelinje NPE (NP460hTert) [24]. Når kontrollert for respons på IL-6, observerte vi at de EBV-infiserte NP460 (NP460hTert-EBV) celler konsekvent vist et mye høyere nivå av p-STAT3 (Tyr 705) sammenlignet med uinfiserte NP460hTert cellene ved IL-6 eksponering (figur 1A ). Vi var også i stand til å vise en langvarig induksjon av p-STAT3 ved lengre tidspunkter etter IL-6-behandling (figur 1B). P-STAT3 kunne detekteres opp til 12 timer i EBV-infiserte celler (figur 1B). I kontroll uinfiserte celler, nivået av p-STAT3 allerede returnert til basalnivå på 0,5 timer (figur 1A og B). Denne observasjonen støtter videre at IL-6-indusert STAT3 aktivering er mye mer forsterkes i EBV-infiserte celler sammenlignet med ikke-infiserte seg. Vi var i stand til å bekrefte den forbedrede aktivering av STAT3 til IL-6 behandling i NP460hTert-EBV-celler ved nukleær translokasjon av p-STAT3 (figur 1C), som indikerer hyperaktive av STAT3 av IL-6 i EBV-infiserte NPE-celler, men ikke i EBV-negative motstykke. Denne forbedrede aktivering av STAT3 av IL-6 behandling i NP460hTert-EBV-celler ble ytterligere bekreftet ved EMSA (figur 1D). Spesifisiteten av EMSA for STAT3 aktivering ble bekreftet ved supershifting den STAT3 /DNA-komplekset etter binding til spesifikt antistoff til STAT3 (figur 1E). Forsterkning av IL-6 indusert STAT3 aktivering ble også observert i en annen udødeliggjort cellelinje NPE, NP550-cyclinD1-hTert (nylig udødeliggjort ved kombinerte virkningen av hTert og cyklin D1, manuskript under forberedelse) (figur 1F). En forbedret STAT3 aktivering ble også observert i en EBV-infiserte NPC cellelinje, CNE2, til tross for en mindre grad (figur 1G) sammenlignet med den i udødeliggjorte NPE cellelinjer. Det høyere nivå av p-STAT3 i kreftceller etter at IL-6-behandling kan forklare en svakere respons til forsterket STAT3 aktivering etter EBV-infeksjon. Denne svakere respons i EBV-infiserte CNE2 ble demonstrert ved gjentatte forsøk. Kollektivt, i nærvær av EBV-infeksjon (både EBV-infiserte NPE og EBV-infiserte celler NPC), IL-6 induserer hyperaktive av STAT3.
EBV-infiserte og ikke-infiserte NP460hTert cellene behandlet med IL-6 i 50 ng /ml for (A) 10, 20 eller 30 minutter, og for (B) 0,5, 1, 2, 4, 8 eller 12 timer. Helcellelysater ble fremstilt og ekspresjon av p-STAT3 (Tyr 705) ble analysert ved hjelp av western blot. Total STAT3 ble oppdaget som kontrollen for protein lasting. (C) Kjerneekstrakter ble fremstilt fra EBV-infiserte og ikke-infiserte celler NP460hTert med eller uten IL-6 behandling (50 ng /ml i 30 minutter) og utsatt for Western blot-analyse for p-STAT3 uttrykk. Histone 1 ble gjenkjent som kontroll for atom ekstrakt lasting. (D) Hel-celle protein lysater ble fremstilt etter behandling med IL-6 for den angitte tid, og ble deretter underkastet analyse ved hjelp av EMSA biotinmerket probe hSIE (inneholdende STAT DNA-bindingselementer). For «kald» konkurranse, ble ekstraktene preinkubert med umerket hSIE sonde ved 200-gangers molart overskudd i 20 minutter før analyse. (E) Den supershift Analysen ble utført ved inkubering av ekstrakten med anti-STAT3-antistoff i 30 minutter før EMSA analyse. Den STAT3 spesifikk supershifted komplekset ble observert som bekreftet spesifisiteten av EMSA for forbedret STAT3 aktivering i EBV-infiserte NP460hTert til IL-6 stimulering. (F) NP550-cyclinD1-hTert og EBV-infiserte NP550hTert-cyclinD1 ble enten behandlet eller ubehandlet med IL-6 i en sluttkonsentrasjon 50 ng /ml i 30 minutter. Ekspresjonen av p-STAT3 (Tyr 705) ble analysert ved Western blotting. STAT3 ekspresjon ble undersøkt som en kontroll lasting av proteiner. (G) CNE2 og EBV-infiserte CNE2-celler ble enten behandlet eller ubehandlet med IL-6 i en sluttkonsentrasjon 50 ng /ml i 30 minutter. Ekspresjonen av p-STAT3 (Tyr 705) ble analysert ved Western blotting. STAT3 uttrykk ble undersøkt som en lasting kontroll av proteiner fra forskjellige cellepopulasjoner.
IL-6R overekspresjon er involvert i forsterkning av IL-6-mediert STAT3 aktivering i EBV-infiserte udødeliggjort NPE celler
Deretter undersøkte vi den underliggende mekanisme for en slik forbedret respons fra EBV-infiserte NPE-celler til IL-6. Som IL-6 formidler signalering via celleoverflaten direkte interaksjon med IL-6R, undersøkte vi ekspresjonen av IL-6R i EBV-infiserte NPE celler og uinfiserte motstykker. Uventet ble det overekspresjon av IL-6R-protein så vel som økte nivåer av IL-6R mRNA-transkripter påvises ved hjelp av Western blotting og real-time PCR, henholdsvis i NP460hTert-EBV-celler (figur 2A
0,05
. (C) NP460hTert celler ble infisert med retrovirale ekspresjonsvektorer, pBabe-IL-6Rα eller pBabe tomme vektorer. Stabilt transduserte celler ble behandlet med IL-6 ved 50 ng /ml i 30 minutter. Cellelysater ble fremstilt og undersøkt for ekspresjon av IL-6Rα og p-STAT3 (Tyr 705) ved Western blot. Immunoblottings for STAT3 og β-aktin er vist som kontroller for protein lasting. (D) NP460hTert og NP460hTert-EBV-celler ble for-behandlet med anti-IL-6R-antistoff ved 5 ug /ml i 30 minutter før IL-6-behandling. Ekspresjonen av p-STAT3 ble analysert ved hjelp av Western blot. Immunoblotting for total nivåer av STAT3 protein er vist som kontroller for protein lasting. (E) Etter at EBV-infeksjon, de EBV-infiserte celler NP460hTert og dets uinfiserte parentale celler ble subdyrket kontinuerlig. Cellene lysater ble fremstilt fra celler som var blitt dyrket i 56, 99 og 133 ganger (betegnet som tidlig, midten og slutten av passasje). Ekspresjonen av IL-6R ble analysert ved Western blotting. Immunoblotting for β-actin ble inkludert som kontroll for protein lasting. (F) De nivåer av IL-6R ekspresjon i celler ble påvist ved Western blot i flere sammenkoblede uinfiserte og EBV-infiserte cellelinjer, inkludert EBV-infiserte og ikke-infiserte par av NP460hTert, NP550-CDK4-hTert, NP361-cyclinD1- hTert, NP550-cyclinD1-hTert. β-actin uttrykk ble vist som protein lasting kontroll.
Vi ønsket å undersøke om IL-6R overekspresjon var en direkte konsekvens av EBV infeksjon eller resultatet av progressiv utvalg av EBV-infiserte NP460hTert celler overekspresjon IL-6R ved langvarig passasjer. Uttrykket nivåer av IL-6R ved forskjellige passasjer av EBV-infiserte og ikke-infiserte NP460hTert celler ble sammenlignet. Vi har observert en meget moderat økning i IL-6R ekspresjon på et tidlig passasje av EBV-infiserte NP460hTert-celler, og det var en gradvis økning i IL-6R ekspresjon i NP460hTert-EBV-celler ved langvarig kultur (figur 2E). Legg merke til at en slik endring av IL-6R nivåer ble ikke observert i de uinfiserte cellene NP460hTert over lengre kulturer (figur 2E). Dette indikerte sterkt at overekspresjon av IL-6R har selektiv vekst fordel for EBV-infiserte NP460hTert-celler og var aktivt valgt i kultur. Overekspresjon av IL-6R ble også påvist i tre andre stabilt EBV-infiserte foreviget NPE cellelinjer nylig etablert i vårt laboratorium ved kombinerte handlingene til telomerase med CDK4 eller cyclin D1 (NP550-CDK4-hTert-EBV, NP361-cyclinD1-hTert-EBV ; NP550-cyclinD1-hTert-EBV) [25], men ikke i friske kolleger (NP550-CDK4-hTert; NP361-cyclinD1-hTert; NP550-cyclinD1-hTert) (figur 2F). Detaljerte egenskapene til disse nylig foreviget NPE cellelinjer vil bli publisert separat. Disse observasjonene antydet at overekspresjon av IL-6R har selektiv vekst fordel i EBV-infiserte NPE celler og er aktivt valgt over lengre passasjer.
konstitutiv aktivering av STAT3 forsterker veksten og maligne egenskaper av EBV-infiserte celler
Vi har søkt å utforske noen av biologiske betydningen av denne aktive utvalg av IL-6R uttrykk i EBV-infiserte NPE celler. En hypotese er at EBV infeksjon kan forårsake stress å udødeliggjort NPE celler [5] og STAT3 aktivering kan overvinne stress-indusert vekst arrest i NPE celler etter EBV infeksjon og fremme deres overlevelse. Aktivering av STAT3 er kjent for å aktivere en rekke nedstrøms mål hendelser for å forsterke veksten og maligne egenskaper av kreftceller [16]. Vi undersøkte derfor om STAT3 aktivering kan forsterke veksten og maligne egenskaper av EBV-infiserte NPE celler. En dominerende aktiv mutant form av STAT3 (STAT3C) ble transfektert inn i EBV-infiserte og ikke-infiserte celler NP460hTert slik at det oppnås konstitutiv aktivering av STAT3 (figur 3A). Vi var i stand til å observere en moderat økning i ekspresjon av c-myc og BCL-2, under konstitutiv aktivering av STAT3 i EBV-infiserte celler sammenlignet med kontroll-infiserte celler (figur 3A). IL-6 behandling også opprettholdes en lengre og sterkere ekspresjon av cyclin D1 i EBV-infiserte celler (figur 3B). Densitometri ble benyttet for å analyse av cyklin D1-nivåene ved 0,5, 1, 2, 4 time (r) i EBV-infiserte celler og uinfiserte celler etter IL-6-behandling. Cyklin D1 nivået ble oppregulert i IL-6-behandlede EBV-infiserte celler i 2 folder ved 4 timers tidspunkt (figur 3B). I motsetning til dette cyklin D1-nivåer i IL-6-behandlede ikke-infiserte celler bare marginalt oppregulert ved 0,5 time og opphørte å øke ved andre tidspunkter (figur 3B). Disse dataene tyder på at IL-6 kan differensielt heve ekspresjonen av cyclin D1 i EBV-infiserte celler, men ikke i ikke-infiserte celler. Interessant, konstitutiv aktivering av STAT3 av STAT3C uttrykk også forbedret invasive egenskapene til NP460hTert-EBV sammenlignet med kontroll infisert NP460hTert celler som analysert ved Matrigel invasjonen assay (Figur 3C). Videre IL-6 behandling også forbedret invasive egenskapene til NP460hTert-EBV celler (Figur 3D). Konstitutiv aktivering av STAT3 av STAT3C uttrykk i NP460hTert-EBV celler også indusert robust forankringsuavhengig vekst i myk agar, tyder på en rolle STAT3 aktivisering for å fremme tumorigent transformasjon av EBV-infiserte udødeliggjort NPE celler (Figur 3E). Tallene samt størrelsen på forankrings selvstendige kolonier i STAT3C-uttrykke NP460hTert-EBV celler ble økt sammenlignet med kontrollceller infisert med den tomme pBabe vektor (Figur 3E). Alle disse observasjonene viste at STAT3 aktivering forbedrer vekstegenskaper i EBV-infiserte udødeliggjorte NPE celler, noe som kan forklare valg av IL-6R overekspresjon fenotype i EBV-infiserte NPE celler gjør dem mer mottakelig for IL-6-indusert STAT3 aktivering.
(A) c-Myc og Bcl-2 ble indusert av STAT3-C uttrykk i NP460hTert og NP460hTert-EBV celler. Den FLAG-merket STAT3-C ble omformet og valgt i NP460hTert og NP460hTert-EBV celler. Western blotting-analyse avslørte uttrykk for FLAG indikerer vellykket uttrykk for STAT3C. Uttrykk av c-myc og BCL-2 ble indusert i begge NP460hTert og NP460hTert-EBV celler etter STAT3-C uttrykk. (B) Forbedret uttrykk for cyclin D1 i IL-6-behandlede NP460hTert-EBV-celler ble observert i forhold til å kontrollere NP460hTert celler. Cellene ble behandlet eller ubehandlet med IL-6 i en sluttkonsentrasjon 50 ng /ml for den angitte tid. I venstre panel, ble uttrykk for cyclin D1 analysert ved Western blot for protein uttrykk. I panelet til høyre, ble densitometry brukt til å kvantifisere uttrykk for cyclin D1 med referanse til aktin. Langvarig ekspresjon av cyclin D1 ble observert i IL-6-behandlede EBV-infiserte celler, men ikke på IL-6-behandlede NP460hTert celler. (C) STAT3-C-uttrykke NP460hTert og NP460hTert-EBV celler viste forbedret invasivitet sammenlignet med vektorkontrollceller. Den invasive egenskaper ble målt ved å telle antallet celler som gjennomtrenges av Matrigel-belagte membran i 24 timer. Dataene presentert er gjennomsnittet ± SD av triplikatbrønner fra triplikate eksperimenter. *,
#
p
0,05. (D) IL-6 behandling forbedret celle invasjon av NP460hTert-EBV celler
in vitro
. NP460hTert-EBV-celler ble lastet inn i det øvre kammer invasjon med eller uten behandling av IL-6 (50 ng /ml). Etter 24 timer ble cellene som penetrerer inn i det nedre kammer farget og tellet. Dataene presentert er gjennomsnittet ± SD av triplikatbrønner fra triplikate eksperimenter. *
p
0,05. (E) pBabe vektor kontroll- og STAT3-C-uttrykke celler (1 x 10
5) ble belagt i myk agar. Tre uker senere, bilder av koloniene ble tatt. Kolonier med diameter (≥0.2 mm) ble talt opp. Antallet kolonier er vist er gjennomsnitt ± SD fra triplikate resultater. *
p
0,05
IL-6 oppregulerer lmp1 uttrykk i EBV-infiserte NPE og NPC celler
Vi har tidligere rapportert at STAT3 aktivering kunne oppregulere lmp1
