Abstract
metastaser er ansvarlig for 90% av kreftdødsfall. Under metastaser, tumorceller bryte vekk fra den primære svulsten, inn i blodet og lymfeårer, og bruke dem som motorveier å reise til fjerne steder i kroppen til å danne sekundære svulster. Kreftcelle migrering gjennom endotelet og inn i basalmembranen representerer et kritisk trinn i den metastatisk kaskade, men det er ikke godt forstått. Denne prosessen er godt preget for immunceller som rutinemessig transmigrere gjennom endotelet til nettsteder for infeksjon, betennelse eller skade. Tidligere studier med leukocytter har vist at dette trinnet er svært avhengig av aktiveringsstatusen til endotelet og subendotel underlaget stivhet. Her har vi brukte en tidligere etablert
in vitro
modell av endotelet og levende celle avbildning, for å observere cancercelletransmigrasjon og sammenligne denne prosessen for å leukocytter. Interessant, omfatter kreftcelle transmigrasjon et ytterligere trinn, som vi begrepet «innlemmelse «, inn i endotelceller (EC) monolag. I denne fasen, kreftceller fysisk fortrenge egenkapitalbevis, som fører til forvridning av EC VE-cadherin unna EC veikryss grenser kreftceller, og spredt i monolaget. I noen tilfeller, ECS fullstendig løsner fra matriksen. Videre oppstår kreftcelle inkorporering uavhengig av aktiveringsstatusen og subendotel substratet stivhet for brystkreft og melanomceller, en merkbar forskjell fra den prosessen som leukocytter transmigrere. I mellomtiden, bukspyttkjertelkreft celle innlemmelse var avhengig av aktiveringsstatusen til endotelet og endres på meget stive subendotel substrater. Samlet våre resultater gir mekanistiske innsikt i tumorcelle bloduttredelse og vise at inkorporering er en av de tidligste trinnene
Citation. Hamilla SM, Stroka KM, Aranda-Espinoza H (2014) VE-cadherin-Uavhengig Cancer Cell innlemmelse i blodåreendotelets forut Sjele. PLoS ONE 9 (10): e109748. doi: 10,1371 /journal.pone.0109748
Redaktør: Claudia Daniela andl, Vanderbilt University, USA
mottatt: May 30, 2014; Godkjent: 10 september 2014; Publisert: 02.10.2014
Copyright: © 2014 Hamilla et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et National Institutes of Health National Research Service Award F31NS068028 (KMS) og Human Frontier Science Prosjekt Award RGP0058 /2011 ( HAE). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag eller National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft metastasering oppstår når tumorceller fragment fra den primære svulsten nettstedet, gå inn i blod og lymfeårer, og spredt seg til fjerne kroppslige organer. Denne prosessen er en av de viktigste faktorene til den deadliness av kreft [1], [2]. Når metastatiske kreftcellene har kommet inn i blodstrømmen, må de krysse endotelceller (EF) barriere før invaderer vevet under i et trinn som kalles ekstravasasjon. De fleste tumorceller arrestasjonen av spesifikk binding av koagulasjonsfaktorer og etter størrelse begrensning i kapillærsjikt [3]. I noen tilfeller har spesifikke ligander på tumorceller blitt korrelert med en øket metastatisk potensiale [4] – [6]. Hittil har betydelig forskning vært opptatt av å analysere biokjemiske og molekylær egenskapene til kreftceller [7] – [9], men den underliggende mekanismen for kreftcelle ekstravasasjon gjennom endotelet fortsatt i stor grad ukjent. Kreftceller er blitt observert til å migrere gjennom den EC cellekroppen [10], og gjennom endoteliale celle-celle kryss uten å ødelegge EC sjiktet [11]. Imidlertid har motstridende forskning har også vist at kreftceller ikke forlater endotelet intakt følgende ekstravasasjon [10], [12] – [14]. Det er viktig å merke seg at disse studiene ble det brukt forskjellige tumorcellelinjer, samt forskjellige EC linjer og
in vitro
metoder, så det er mulig at forskjellige kombinasjoner av forskjellige typer av tumorceller og ECS kan føre til avvik mekanismer for ekstravasasjon. Det er tre foreslåtte fremgangsmåter for kreftcellemigrering gjennom endotelet: (a) cancerceller kan migrere gjennom EC legemet [10], (b) cancerceller kan fremkalle EC apoptose [10], [13] og (c) cancerceller kan migrere gjennom endoteliale celle-celle kryss uten permanent å ødelegge EC sjiktet [11]. I de senere år har forskning har også vist at kreftceller også utøve krefter på ECS som presser dem dypere inn i den ekstracellulære matriks i løpet av transmigrasjon [15], [16], og at endotel forbedrer kreftcellevandring [17]. Disse funnene antyder at kreft migrasjon gjennom endotelet er en kompleks prosess som krever ytterligere undersøkelser for å klargjøre dets mekanistisk kurs.
Leukocytter rutinemessig transmigrere gjennom endotelet og underliggende lag av vaskulaturen til å nå vevet steder med inflammasjon, infeksjon, eller skade. Dette er en godt karakterisert prosess som er avhengig av lokaliserte biokjemiske signaler. I leukocytt trafikk, opptrer endotel som en selektiv barriere som i stor grad reduserer invasjonshastigheten [18]. I løpet av en immunrespons, kjemokinet tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) fremstilles ved stromale celler, og den lokaliserte eksponering av ECS til TNF-α oppregulerer adhesjonsmolekyler slik som intercellular adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) på overflaten av endotelet. Videre er det i tillegg til molekylære endringer, TNF-α også vesentlig endrer de strukturelle egenskapene til endotelet, som induserer mykning, aktin omstilling, og en økning i total permeabilitet [19], [20]. En ytterligere faktor som fremmer leukocytt-transmigrasjon er subendotel substratet stivhet og mekaniske egenskaper av endotelet. Disse varierer i løpet av vaskulær homeostase og patologiske tilstander [19]. Neutrofiler er i stand til å mechanosense deres mikromiljø [19], [21] – [24], og neutrofil Sjele øker etter hvert som subendotel substrat stivhet øker på grunn av EC myosin lettkjede-kinase (MLCK) -mediert sammentrekkende krefter [19]. Alle disse endringene i EC mono lette leukocytter sjelevandring i løpet av en immunrespons.
Siden leukocytter rutinemessig transmigrere gjennom EC lag, er det antatt at metastatiske kreftceller kan dele mange av de samme mekanismene. Disse mekanismene er ennå ikke undersøkt mer detaljert. For eksempel er involvering av kjemokiner i tumor-endotel-interaksjoner og deres effekter på kreftcellemigrering ikke godt forstått [25]. Enda mer, kan de betydelige molekylære og strukturelle endringer som finner sted i endotelet følgende TNF-α behandling forbedre metastatisk kreft celle sjelevandring. Det gjenstår også å se hvordan kreftcelle ekstravasasjon varierer med subendotel underlaget stivhet. Som observert med leukocytter [19], er det mulig at kreftcellen transmigrasjon kan øke med økende substrat stivhet. Kreftceller er også blitt observert å presse ECS inn i den ekstracellulære matriks i løpet av ekstravasasjon, noe som indikerer at de mekaniske egenskapene til ECM kan spille en viktig rolle. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at både aktiveringsstatusen til endotelet og subendotel underlaget stivhet kan påvirke kreftcelle ekstravasasjon.
I dette arbeidet, en
in vitro
modell av blodåreendotelets [19 ], [26] – [28] ble brukt til å utforske cancercelletransmigrasjon, og hvordan denne prosessen sammenlignet med leukocyttfrie ekstravasasjon. Våre resultater viser at en av de tidligste trinn i ekstravasering av metastatisk brystcancer-celler er inkorporering i EF-monolaget, som i betydelig grad forstyrrer EC barrieren og fysisk fortrenger ECS, noen ganger fører til fullstendig fjernelse av ECS fra monolaget. I motsetning til leukocytt transmigrasjon, betyr kreftcelle innlemmelse ikke være avhengig av aktiveringsstatusen til endotelium eller subendotel-substrat stivhet for melanomceller og brystkreftceller. Interessant, avhenger pankreas celle innlemmelse på aktiveringsstatusen til endotelet og subendotel stivhet. Sammen våre resultater indikerer at metastatisk brystkreft celle ekstravasasjon innebærer et ytterligere trinn med inkorporering i endotelium, som ikke forekommer i løpet av leukocytt ekstravasjon.
Materialer og metoder
Fremstilling av polyakrylamid gel substrater
Tynne polyakrylamidgeler ble fremstilt på dekkglass i henhold til metoden først beskrevet av Wang og Pelham [29] og er beskrevet i detalj i de tidligere publikasjoner [19], [23], [30] – [33]. Kort sagt ble 280 kPa (15% akrylamid + 1,2% bis akrylamid) og 0,87 kPa (3% akrylamid + 0,1% bis-acrylamid) gelene laget og belagt med 0,1 mg /ml fibronektin (Sigma-Aldrich) som tidligere beskrevet [19]. Karakterisering av det Youngs modulus av gelene ble utført ved atomkraftmikroskopi og dynamisk mekanisk analyse, mens analyse av overflate-bundet fibronektin ble oppnådd ved immunofluorescens [23], [32]. For eksperimenter på glass, 22 x 22 mm dekkglass (Fisher Scientific) ble belagt med 0,1 mg /ml fibronektin i 2 timer ved romtemperatur.
Cell kultur
Menneskelige umbilical vein endotelceller (Lifeline Cell Technology) ble dyrket som tidligere beskrevet [34]. MDA-MB-231 metastatisk brystcancer-celler (ATCC) og A375-melanomceller (ATCC) ble dyrket i DMEM, 10% FBS og 1% penicillin streptomycin. SW1990 kreft i bukspyttkjertelen celler (ATCC) ble dyrket i DMEM, 10% FBS og 50 ug /ml gentamicin. HUVECs (passasjer 2-5, 4 × 10
5 totalt) ble sådd ut på fibronektin-belagt dekkglass eller polyakrylamidgeler og dyrket i ca 48 timer, noe som medførte en mono dannet. Celler ble behandlet med kontrollmedia eller 25 ng /ml tumor nekrose faktor-α (TNF-α) for de siste 24 timer før eksperimentene. I noen eksperimenter ble HUVECs transfektert med VE-cadherin-GFP (VEcadGFP) ved anvendelse av en adenovirus (AdV), som ble mottatt som en generøs gave fra Dr. William Luscinskas (Harvard Medical School). Dr. Luscinskas laboratorium har tidligere beskrevet prosedyren for bygging av VEcadGFP plasmid og overføring til et adenovirus uttrykk vektor [35]. HUVECs ble sådd ut på fibronektin-belagte polyakrylamidgeler eller dekkglass og gitt 1-2 timer for å spre seg, og 3 ul av AdV-VEcadGFP ble tilsatt til cellene med 2 ml medium per substrat. HUVECs ble deretter dyrket i monolag i formasjonen, som beskrevet ovenfor. Monolagene ble vasket med PBS før tilsetting av ytterligere HUVECs eller tumorceller (1 x 10
5 celler totalt) til den apikale overflate av monolaget mm 22 x 22. For å skille mellom de HUVEC-celler i monolag og de ytterligere celler tilsatt til monolaget, lagt til HUVECs eller MDA-MB-231-celler ble farget med det lipofile DiIC
16 fargestoff (1 uM) i suspensjon i 5 minutter ved romtemperatur , etterfulgt av sentrifugering og en PBS-vask.
Levende celle avbildning og analyse
Levende celle mikroskopi ble gjennomført i et lukket objektbord inkubator ved 37 ° C, 5% CO
2 og 55% fuktighet ved hjelp av et invertert mikroskop (Olympus IX71). Bilder ble tatt med enten en QImaging Retiga-SRV CCD (CCD) digitalkamera (QImaging Corporation) ved hjelp IPLab programvare (Becton, Dickinson and Company), eller med aa QImaging Rolera-MGI CCD digitalt kamera (QImaging Corporation) med Slidebook (versjon 4.2.0.9; Intelligent Imaging Innovations). Fase kontrast, differensial interferens kontrast (DIC), og /eller fluorescens timelapse bildene ble tatt ved hjelp av enten en 20 × /0,45 NA PH1 objektiv eller en 60 × /1,42 NA olje objektiv. Fraksjonen av inkorporerte cellene (HUVECs eller MDA-MB-231) ble beregnet ved å dividere antall celler som ble innlemmet på noe tidspunkt i løpet av timelapse sekvens av det totale antall fase hvite celler over monolaget i den første rammen av sekvens. Tid til å fullføre innlemmelse ble beregnet ved hjelp av forskjellen mellom tiden når cellen først begynte å spre seg inn i mono og tidspunktet når cellen nådd maksimum spre område innenfor monolaget.
Interference refleksjon mikros
interferens refleksjon mikroskopi (IRM) ble brukt til å påvise overflate-til-overflate interferens mellom lysstråler som reflekteres fra substratet /medium grensesnitt og de fra mediet /celle grensesnitt, slik det er beskrevet i vårt tidligere arbeid [36] – [38] . I denne teknikken, intensiteten av lyset er et mål på nærhet av cellen til glassflaten, slik at områder av membranen nærmest overflaten synes mørkt og de lenger borte vises lysere. Derfor er IRM en optimal metode ved vurdering av cellulær vedlegg, heft, og spre oppførsel [36] – [38]. For sprer eksperimenter, 1 × 10
5 MDA-MB-231 celler ble sådd ut på 22 × 22 mm fibronektin-belagt dekkglass i HUVEC media, noe som resulterer i observasjon av enkeltceller. For disse eksperimentene, et invertert mikroskop (Olympus IX71) med et 60 x /1,42 NA olje objektivlinsen og en 100 W kvikksølvlampe (Olympus anvendt ved bølgelengde 561) ble anvendt i kombinasjon med et CCD-kamera (Retiga SRV kamera, QImaging) for bildeopptak. Forsøk ble utført i et lukket kammer mikroskop som opprettholdt dyrkningsbetingelser ved 37 ° C, 50% luftfuktighet og 5% CO
2. Under cellespredning, ble en ramme registrert hvert 5. sekund over en periode på 1 μhour for N = 5 uavhengige eksperimenter. For statistiske evalueringer av spredningsområder, ble bildene analysert ved hjelp ImageJ (National Institutes of Health) programvare. Den cellegrensene ble gjenfinnes ved hånd og område ble beregnet ved hjelp av ImageJ rutiner. Områder i MDA-MB-231 celler sprer i en HUVEC monolag ble også spores for hånd og sammenlignet med enkeltceller sprer seg på endotelet frie dekkglass.
Confocal Imaging
Totalt 1 × 10
5 MDA-MB-231 celler ble transfektert med 10 ul av CellLight Actin-GFP (Life Technologies) i henhold til produsentens protokoll og inkubert i 24 timer. Etter 24 timer infiseres de MDA-MB-231-celler ble innført til et konfluent monolag HUVEC og tillatt å innlemme i 15 timer. Etter inkorporering ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyde og farget ved hjelp av Texas-Red Phalloidin (Invitrogen). Z-stack bilder ble samlet inn ved hjelp av en Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop med en 63 × olje mål.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble gjennomført ved hjelp av en Student t-test mellom par av data, eller ved hjelp av ANOVA for grupper av data, hvor P 0,05 angitte statistisk signifikans. Etter ANOVA ble multiple sammenligninger gjort ved hjelp av Tyrkias ærlig signifikant forskjell kriterium. Alle målinger rapporteres her i formatet gjennomsnitt ± standard feil.
Resultater
innlemmelse i endotelet er første skritt i metastatisk kreft celle sjele
MDA-MB-231 metastatisk brystkreft celler ble introdusert på den apikale overflaten av en EC monolayer og overvåket som de interaksjon med endotelet (Movie S1). Til å begynne med, MDA-MB-231-celler var hvit og sfærisk i motsetning til den underliggende fase-mørknet og flatet endotel (Fig. 1A). I løpet av flere timer, MDA-MB-231-celler begynte å innlemme i endotelet, i en prosess som varierte i gjennomsnitt fra 40 til 60 minutter (Fig. 1B) og ble visuelt forskjellig fra nøytrofile transmigrasjon gjennom endotelet (Fig. 1C) . Nærmere bestemt, viste det seg at ECS tilstøtende til setet for inkorporering var fysisk forskjøvet, noe som skaper tomrom for MDA-MB-231-celle til å spre seg på den underliggende matrise (fig. 1A), mens nøytrofiler presset gjennom endotelet uten å forstyrre monolag ( fig. 1C). Noen ECS løsgjort fra den underliggende matrise, avrundet opp og ble sfærisk etter inkorporering av MDA-MB-231 celler i monolaget (fig. 2). Omtrent 25% av ECS frittliggende følgende kreftcelle inkorporering (figur 2). Imidlertid inkorporering av MDA-MB-231 celler i endotelium forekom mer langsomt, med en mindre helling av «spredning området vs tid», og hadde en lavere endelig cellulært område i forhold til MDA-MB-231-celler som sprer seg på en endothelium- fri fibronektin-belagte substrat (fig. 3D), noe som indikerer at endotelet ikke favorisere inkorporering av kreftcellen, men heller begrenset samlet spredningsområde. Videre, MDA-MB-231 celle innlemmelse i endotelet forekom mer langsomt, med en mindre helling av «kumulativ innlemmelse vs tid», i forhold til ECS innlemme inn i et monolag av ECS (fig. 3A). Således er det sannsynlig at inkorporering av MDA-MB-231 celler i endotelium forekommer ved en annen mekanisme enn nativ ECS sprer seg inn i den samme endotel. A375-melanomceller og SW1990 pankreatiske celler ble også introdusert til den apikale overflate av endotel. I likhet med MDA-MB-231-celler, er melanomceller og bukspyttkjertelceller begynte å innlemme i endotelet i en prosess som varte omtrent 15 minutter og 50 minutter henholdsvis. A375 kreftceller innlemmet i monolag på en mye raskere hastighet i forhold til metastatisk brystkreft celler og deres innlemmelse dynamikk tett lignet som opprinnelig egenkapitalbevis spre seg i EC mono. A375-melanomceller hadde en endelig brøkdel av innlemmelse som lignet egenkapitalbevis sprer seg egenkapitalbevis, mens SW1990 kreftceller hadde en mye lavere andel av inkorporering i forhold til alle grupper (figur 3C). Videre konfokale bilder (figur 4A) viste at etter 15 timer med inkorporering, MDA-MB-231 (grønn) celler forflyttes ECS (red) ved å spre mellom tilstøtende ECS. Ortogonale projeksjoner viser at MDA-MB-231 celler er faktisk spredning mellom egenkapitalbevis og ikke migrerer under dem under inkorporering (fig 4B).
(A) Phase kontrast bilde av MDA-MB-231 celler (lyse hvitt ) på toppen av en human navleveneendotel (HUVEC) monolag. Scale bar er 20 mikrometer. (B) MDA-MB-231-celle (sort pil) begynner å innlemme i endotelium, som indikert av dets endring i fasekontrastmikroskopi fra skinnende hvit til formørket. Scale bar er 20 mikrometer, og gjelder for alle bildene i panel B. Lengde tid etter plating MDA-MB-231 celler på endotelet er angitt i øvre høyre hjørne av hvert bilde i time: minutt: sekund format. Den endelige andelen av inkorporering for dette forsøk var 95%. (C) Fasekontrast bildesekvens av en nøytrofile transmigrating gjennom en TNF-α-aktivert endotel. Scale bar er 20 mikrometer, og gjelder for alle bildene i panel C. Lengde tid etter plating nøytrofile på endotelet er angitt i øvre høyre hjørne av hvert bilde i time: minutt:. Andre format
fase kontrast (til venstre) og DiIC
16 fluorescens (høyre) bilder av MDA-MB-231 celler sådd ut på en ubehandlet HUVEC monolaget, på tidspunkter umiddelbart etter plating (øverst) og etter 16 timer for interaksjon med endotelet (nederst ). Røde piler peker til fase-hvite celler som ikke avgir fluorescens; disse er endotelceller som har blitt tvunget ut av monolaget og dermed har frittliggende og bli avrundet. Scale bar er 25 mikrometer, og gjelder for alle bilder.
(A) Akkumulert brøkdel av egenkapitalbevis eller MDA-MB-231 celler (231), SW1990 (1990), og A375 celler innlemmet i endotelet som en funksjon av tid etter utplating. Datapunkter representerer gjennomsnitt ± SEM for minst 3 uavhengige eksperimenter (N 20 celler for hvert eksperiment). (B) Slutt fraksjon av MDA-MB-231-celler som inngår i den ubehandlede eller TNF-α-behandlede endotel etter 15 timer. Linjene representerer middelverdien, mens Feilstolpene representerer SEM på minst 3 uavhengige eksperimenter. P 0,05 mellom disse verdiene indikerer at det er ingen statistisk signifikant forskjell (N.S.). (C) Slutt fraksjon av MDA-MB-231 brystkreftceller, ECS, A375 melanomceller, og SW1990 pankreatiske celler innlemmes i endotelet etter 15 timer. Linjene representerer middelverdien, mens Feilstolpene representerer SEM på minst 3 uavhengige eksperimenter. (*) Angir signifikant (P 0,05) sammenlignet med ECS. (D) Plot spre område versus tid avslører forskjeller i spredning dynamikk for MDA-MB-231 celler sprer på en fibronektin-belagt dekkglass ( «enkeltceller») eller inn i en ubehandlet endotelet ( «inn mono»).
(A) en representant MDA-MB-231 (grønn, Actin-GFP) celle infisert med GFP-aktin er vist sprer seg en HUVEC monolag (rød, Phalloidin). Ortogonale projeksjoner vises. (B) Skjematisk viser at en kreftcelle (grønn) fortrenger egenkapitalbevis (rød) ved å spre mellom tilstøtende egenkapitalbevis i løpet av innlemmelse.
Aktivering av endotelet av TNF-α påvirker ikke innlemmelse dynamikken i brystkreft og melanom celler
aktivering av endotelet er et viktig skritt i leukocyttadhesjon kaskade, og vår tidligere arbeid har vist at leukocytter sjelevandring er svært avhengig av aktiveringsstatusen til endotelet [19], [28], [ ,,,0],30]. Aktivering av endotel av TNF-a ikke bare oppregulerer adhesjonsmolekyler slik som ICAM-1 og vaskulær celleadhesjonsmolekyl-1 (VCAM-1), men øker også EC kontraktilitet [31] og reduserer EC barrierefunksjonen [20]. Derfor vårt neste mål var å avgjøre om inkorporering av metastatisk brystkreft celler i endotelet som kreves ECS for å bli aktivert. Intriguingly, har vi funnet at den kumulative fraksjon av inkorporering mot tid av MDA-MB-231-celler var like, uavhengig av om ECS ble behandlet med TNF-α (fig. 3A). I tillegg er den endelige fraksjon av celler som inngår i et TNF-α-aktivert endotel etter 15 timer var ikke forskjellig fra den fraksjon innlemmet i en ubehandlet endotel (Fig. 3B). Til slutt, den tid som kreves for å fullføre inkorporering (fra en avrundet sfære til en flatlagt celle i endotelet) var ikke avhengig av hvorvidt endotel ble behandlet med TNF-α (fig. 5C). I likhet med brystkreft celler, brøkdel av inkorporering av A375-melanomceller i ECS var sammenlignbare, uavhengig av om ECS ble behandlet med TNF-α (Fig S1). Disse resultatene tyder på at noen metastatiske kreftceller er i stand til å fullføre de tidlige stadiene av ekstravasasjon, selv i fravær av en inflammatorisk stimulus. Men brøkdel av inkorporering etter 15 timer for SW1990 bukspyttkjertelen celler var statistisk forskjellig mellom ubehandlet egenkapitalbevis og de som ble behandlet med TNF-α (Fig S2). SW1990 celler innlemmet på en mye raskere og høyere andel i TNF-α behandlet egenkapitalbevis i forhold til ubehandlet egenkapitalbevis.
(A) Akkumulert brøkdel av MDA-MB-231 celler innlemmet i endotelceller på en fibronektin belagt 0,87 kPa og 280 kPa polyakrylamidgel, eller glass (50 GPa). Datapunkter representerer gjennomsnitt ± SEM for minst 3 uavhengige eksperimenter (N 20 celler for hvert eksperiment). (B) Slutt fraksjon av MDA-MB-231-celler innlemmes i (ubehandlet) endotelet som en funksjon av subendotel substrat stivhet. Linjene representerer middelverdien, mens Feilstolpene representerer SEM på minst 3 uavhengige eksperimenter. P 0,05 mellom disse verdiene indikerer at det er ingen statistisk signifikant forskjell (N.S.). (C) Tid for MDA-MB-231-celler for å fullføre innlemmelse er uavhengig av de mekaniske egenskapene til substratet under endotelcellene. Endotelceller på fibronektin-belagte dekkglass (50 GPa) eller polyakrylamidgeler (0,87 kPa og 280 kPa) forble ubehandlet (ingen TNF) eller behandlet med TNF-α (TNF). Ingen statistisk forskjell i inkorporeringen ble målt som en funksjon av subendotel substrat stivhet eller endotelcelle-behandling (P 0,05).
innlemmelse er uavhengig av subendotel substrat stivhet for brystkreft og melanomceller
Vårt tidligere arbeid har også vist at leukocytt-transmigrasjon er avhengig av de mekaniske egenskapene til substratet under endotelcellene [19], [30]. Stivere subendotel matriser fremme myosin lett kjede kinase avhengig EC kontraktilitet, som fører til inter hull og forbedret leukocytter sjele [19], [30]. Derfor vårt neste mål var å fastslå om metastatisk brystkreft celle innlemmelse i endotelet var avhengig subendotel underlaget stivhet. I motsetning til neutrofil transmigrasjon, som øker med subendotel substrat stivhet, dynamikken i MDA-MB-231 celle inkorporering i endotelet var lik for myk (0,87 kPa), intermediat (280 kPa), og meget stiv (glass; 50 GPa) subendotel substrater (fig. 5A). I tillegg er den endelige innlemmet fraksjon av MDA-MB-231 inn i endotelet var uavhengig av subendotel substrat stivhet (Fig. 3B). og den totale tiden det tar å fullføre sjelevandring var uavhengig av subendotel underlaget stivhet (Fig. 5C). A375-melanomceller innarbeidet i myke, middels, og veldig stive subendotel matriser med liknende innlemmelse dynamikk og slutt brøkdel av inkorporering til brystkreftceller (fig S3). SW1990 bukspyttkjertelen celler vises en annen oppførsel fra melanomceller og brystkreftceller (fig S4). Når SW1990 celler ble sådd ut på myke og middels substrater, viste de et tilsvarende nivå av inkorporering dynamikk og sluttfraksjon av inkorporering etter 15 timer (fig S4). Når imidlertid tillatt å innlemme på meget stiv matriser (glass; 50 GPa), viste de en mye lavere andel av inkorporering og lavere inkorporasjonsraten. Selv om de påfølgende trinn av metastatisk kaskade kan avhenge av substratet stivhet, våre resultater indikerer at de tidlige stadier av brystkreft celle ekstravasasjon og melanom ekstravasering forekomme uavhengig av de mekaniske egenskapene til matrisen under endotelet mens bukspyttkjertelcelle innlemmelse forandres på meget stive substrater.
endotelceller ikke uttrykker VE-cadherin langs grensen mot innlemmet brystkreft celler
Vascular endothelial cadherin (VE-cadherin) er en av de viktigste homofilist adhesjonsmolekyler uttrykt av egenkapitalbevis ved celle-celle grenser i en konfluent monolag. Integriteten til endotelet som en vaskulær barriere er sterkt avhengig av riktig funksjon av VE-cadherin adhesjonsmolekyler [39], [40]. Som egenkapitalbevis innlemmet i et sunt konfluent endotelet, GFP-VE-cadherin ble uttrykt av alle egenkapitalbevis nabo innlemmet DiIC
16-merket EC (Fig. 6A, Movie S2), noe som indikerer at tillegg av nye egenkapitalbevis på mono gjorde ikke forstyrre integriteten til EF veikryss. Vi neste søkt å identifisere mulige endringer i VE-cadherin morfologi etter inkorporering av MDA-MB-231 celler i endotelet. Påfallende, egenkapitalbevis nabo innlemmet DiIC
16-merket MDA-MB-231 celler ikke uttrykker GFP-VE-cadherin i grenseland med MDA-MB-231 celler, men de fortsatte å uttrykke GFP-VE-cadherin i kryss med andre egenkapitalbevis (fig. 6B). Disse resultatene indikerer at det tidlige stadium av kreftcellen ekstravasasjon ikke bare påvirker VE-cadherin-avhengige celle-celle-adhesjon, men kan også tilveiebringe en lett tilgjengelig rute for ekstravasasjon for andre sirkulerende tumorceller.
DiIC16-merket HUVECs (A) eller MDA-MB-231 (B) ble utsådd på endotelceller som uttrykker VE-cadherin-GFP (VE-cad-GFP). Bilder ble tatt etter inkorporering av hver celletype. Scale bar er 10 mikrometer og gjelder for alle bildene i dette tallet.
Brystkreft celle innlemmelse initierer av dislocating VE-cadherin på endotelcelle veikryss
Før utbruddet av MDA- MB-231 innlemmelse i endotelet, observerte vi intakt GFP-VE-cadherin på EC krysset rett under MDA-MB-231 celle (fig 7A;. røde piler, Movie S2). Dette var i kontrast til den MDA-MB-231 celler som inkorporert i endotelet ved tidligere tidspunkter, hvor GFP-VE-cadherin ble ikke uttrykt av nabo ECS (figur 7A;. Gule piler). Det første trinnet av innlemmelse skapt et avbrudd i GFP-VE cadherin-i EC krysset rett under MDA-MB-231-celle, fører til dannelse av en liten (ca. 2 um
2) hull i EF krysset (Fig . 7B, rød pil). En annen lite hull noen ganger dannet (figur 5B;. To røde piler) før tomrommet ble betydelig større (~33 mikrometer
2 ved T = 06:35) og ryddet området av en del av kroppen av EF. Til slutt, det som begynte som et lite gap i GFP-VE-cadherin spredd i et stort hull i endotelet, som ble okkupert av MDA-MB-231 celle (Fig. 7B). Vi har også observert betydelig forskyvning og restrukturering av GFP-VE-cadherin på nærliggende EC-EC veikryss (Fig 7B;. Gule piler).
DiIC
16-merket MDA-MB-231 celler ble sådd ut endotelceller uttrykker VE-cadherin-GFP (VE-cad-GFP). (A) Vist er differensial interferens kontrast (DIC), DiIC
16 (rød) fluorescens, og VE-cadherin-GFP (grønt) fluorescens og klæ bilder. På dette tidspunktet har en MDA-MB-231 allerede innarbeidet i endotelet (gule piler), og VE-cadherin-GFP er fortsatt intakt i stedet rett under en annen MDA-MB-231 celler som ennå ikke har begynt å innlemme (røde piler). (B) Fluorescens timelapse sekvens av en DiIC
16-merket MDA-MB-231 celle (rød) å innlemme i en endotelet uttrykker VE-cadherin-GFP (grønt). Tiden etter plating MDA-MB-231 celler på endotelet er angitt i øvre høyre hjørne av hvert bilde i timer: minutter format. Scale bar i panel A (DIC bilde) er 10 mikrometer og gjelder for alle bildene i dette tallet.
Diskusjoner
Kreft metastase fortsetter å være en ledende årsak til død hos kreftpasienter [1], [2], og en av de kritiske trinn regulerer metastase er uttredelse fra blodkar. Selv om mekanismene som regulerer denne prosessen er uklare, er endotel er kjent for å spille en viktig rolle, som virker enten som en barriere for enkelte kreftceller, eller en promotor for invasiv evnen i kreftceller, inkludert MDA-MB-231 [15], [ ,,,0],41]. EC apoptose og klarering fra basalmembranen har tidligere blitt rapportert som bivirkninger under kreftcelle-ekstravasasjon [10], [13]. Tilsvarende eggstokkene tumorcelleklumper fortrenge mesothelial celler under innskyting inn i submesothelial plass [16].
