Abstract
Bakgrunn
Formålet med denne studien var å undersøke BRF2 uttrykk hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og utforske forholdet mellom BRF2 protein med clinicopathologic faktorer, tumor angiogenese og prognose.
Metoder
Både BRF2 protein og intratumorale microvessels ble undersøkt ved immunhistokjemisk farging i 107 ikke-småcellet lungekreft pasienter. Intratumoral m icrovessel tetthet (MVD) ble målt ved å telle CD-34 positive immunfargete endotelceller. Western blot og RT-PCR-analyser ble benyttet for å undersøke BRF2 uttrykk status i vev
Resultater
En betydelig høyere nivå av BRF2 uttrykk ble funnet i NSCLC vevet på protein nivåer. I tillegg univariat og multivariat analyse viste at BRF2 protein overuttrykk og høy MVD var signifikant assosiert med tumor tilbakefall. Selv BRF2 overekspresjon og høy MVD indikerte dårlig fem års total overlevelse (p = 0,004 og p = 0,019, henholdsvis), multivariat analyse viste at bare BRF2 overekspresjon var en uavhengig prognostisk faktor for ugunstig total overlevelse (p = 0,021).
Konklusjoner
BRF2 er en lovende biomarkør for å identifisere personer med dårlig prognostisk potensial og et mulig mål for anti-angiogen terapi for pasienter med tidlig stadium NSCLC
Citation. Lu M, Tian H, Yue W, Li L, Li S, Qi L, et al. (2014) TFIIB-Related Factor 2 Over uttrykk er en prognose markør for tidlig stadium ikke-småcellet lungekreft korrelert med tumor angiogenese. PLoS ONE 9 (2): e88032. doi: 10,1371 /journal.pone.0088032
Redaktør: Kapil Mehta, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 22 august 2013; Godkjent: 02.01.2014; Publisert: 11 februar 2014
Copyright: © 2014 Lu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektet støttes av Natural Science Foundation National of China (No. 30571844), og Foundation Science and Technology Development i Shandong-provinsen (No. 2009GG10002007), og Natural Science Foundation i Shandong-provinsen (nr ZR2009CM090) National, og Wu Jie Ping Foundation (No. 320.6750.12393). Sponsorer hadde ingen engasjement i studiedesign, i innsamling, analyse og tolkning av data; i skriving av manus; og i beslutningen om å sende inn manuskript for publisering. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste årsaken til kreftdød for både menn og kvinner over hele verden. Hvert år er det 1,35 millioner nye lungekrefttilfeller i verden [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 75-80% av tilfellene av lungekreft [2] – [3]. Til tross for fremskritt i tidlig oppdagelse, radikal kur drift, og multimodale terapeutiske modaliteter i de siste tiårene, den samlede fem års overlevelse av lungekreft er bare 15% [4]. 30-40% av stadium I pasienter tilbakefall etter kirurgisk reseksjon [5]. Videre prospektive randomiserte data viste at adjuvant kjemoterapi i stadium IB ikke har oppnådd en betydelig overlevelse fordel og enda en skadelig effekt ble observert i stadium IA [6]. Derfor er det et presserende behov for å identifisere nye biomarkører som vil bidra til å velge pasienter med høy sjanse for kreft tilbakefall lunge og gi bedre prognose og individualisering behandling.
RNA polymerase (pol) III er ansvarlig for transkripsjon av liten, mindre enn 300 nukleotider, uoversatt RNA inkludert microRNAs (mirnas) [7] – [8]. Siden oppdagelsen, har mirnas vært innblandet i patogenesen av ulike kreft hos mennesker, og miRNA uttrykk profilering av humane tumorer har spesifikke signaturer i forbindelse med diagnostisering, staging, progresjon, prognose og behandlingsrespons [9]. Nøyaktig transkripsjon av RNA pol III krever TFIIIB, mens BRF2 (TFIIB relatert faktor 2) er en del av TFIIIB. Reguleringen av pol III er en integrert del av vekstkontrollfunksjoner av RB, P53 og c-myc, og TFIIIB aktivitet er strengt regulert av Maf1, chemopreventative agenter, onkogener og tumor suppressors [10] – [15]. BRF2 har vist seg å være sterkt overuttrykt i en rekke kreftformer, inkludert mage, nyre og melanom kreft [16] – [17]. Nylig, Lockwood et al. rapportert at overekspresjon av BRF2 kunne drive uttrykk for RNA pol III transkripsjoner, bidrar til plateepitelkarsinom tumorigenesis, og BRF2 har blitt identifisert som en roman avstamning spesifikke onkogen i lunge plateepitelkarsinom [18]. Men til vår kunnskap, uttrykk for BRF2 og dens korrelasjon med clinicopathologic faktorer og prognose i kirurgisk reseksjon NSCLC er ikke undersøkt.
I denne studien har vi benyttet immunhistokjemisk metode for å undersøke BRF2 protein uttrykk i kliniske NSCLC prøvene , og vi analyserte forholdet av BRF2 uttrykk med variabel clinicopathologic funksjoner og pasient prognose. Videre vurderte vi de uavhengige prognostiske faktorer som påvirker langsiktig overlevelse av NSCLC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Studien protokollen ble godkjent av etikk styrene Qilu Hospital, og vev prøven Kjøpet ble gjennomført i henhold til institusjonelle retningslinjer. Alle fag signert skriftlig informert samtykke, og samtykket prosedyren ble godkjent av etikk styrene i Qilu Hospital.
Pasient
Prøver ble innhentet fra 107 pasienter som ble diagnostisert med NSCLC mellom januar 2004 og oktober . 2006 ved Institutt for Thoracic Surgery, Qilu Hospital, og behandles med lunge lobektomi pluss regional lymfeknute disseksjon.
Alle pasientene hadde ingen preoperativ strålebehandling eller kjemoterapi, og hadde ingen fjernmetastaser. Dataene på sine clinicopathologic funksjoner og oppfølging var fullført. 46 tilfeller av tilstøtende vevsprøver ble tatt fra ca. 0,5 cm fra den ytre kant av de lunge tumor-vev, og de andre 32 tilfeller ble tatt mer enn 5 cm fra tumor margin av normale lunge vev som negative kontroller. For RT-PCR og Western blotting-analyse, 12 matchet par av svulster vev og tilstøtende prøver noncancerous vev ble oppnådd fra lunge Lobectomy eksemplarer av pasienter diagnostisert med NSCLC umiddelbart etter operasjonen mellom september 2013 og oktober 2013 i vår avdeling, og lagret ved -80 ° C.
for alle pasienter, ble histologisk type og grad av kreft celledifferensiering revurdert og bestemmes av klassifiseringssystemet i Verdens helseorganisasjon endret i 2004, og postsurgical patologisk iscenesettelse ble fastsatt basert på den internasjonale iscenesettelse system.
Immunohistochemistry
Alle prøver ble samlet under operasjonen, fast med 10% formalin og innstøpt i parafin. Vev ble kuttet som 4 mikrometer seriesnitt, og deretter deparaffinized hjelp xylen og rehydrert gjennom en etanol-serien til vann. Høy temperatur antigen gjenfinning ble utført i citrat-buffer i 25 minutter i en mikrobølgeovn. Deretter endogen peroksydase enzymaktiviteten ble blokkert ved bruk av 3% H
2o
2 i metanol i 20 minutter ved romtemperatur. Platene ble deretter inkubert med primært kanin-anti-BRF2 polyklonalt antistoff (Abcam) og kanin-anti-CD34-monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology) over natten ved 4 ° C i et høyt fuktighetskammeret, etterfulgt av inkubasjon i 30 minutter ved 37 ° C med biotinylerte sekundære antistoffer og streptavidin-peroksidase kompleks. Til slutt ble et 3,30-diaminobenzidin-løsning tilsatt, og objektglassene ble motfarget med hematoksylin og montert med nøytral balsam. For negative kontroller ble snittene inkubert med PBS i stedet for de primære antistoffer.
Evaluering av BRF2 protein uttrykk og microvessel tetthet
For BRF2 flekker, området innenfor diagnoseområdet ble scoret av tre uavhengige observatører og en reproduserbar semi-kvantitativ metode som anses både fargeintensitet (0, negativ, 1, svak, 2, moderat og 3, sterk) og andelen av positivt fargede celler (0, 0-5%, 1, 6-25 %, 2, 26-50%, 3, 51-75%, 4, 76%) ble vedtatt [19]. For evaluering av positiv farging av BRF2, bør minst 3 seksjoner eller områder fra hver prøve scores. Motstridende score ble løst ved å velge verdien konsekvent mellom to observatører eller gjennomsnittet av resultatet.
For intratumoral microvessel tetthet (MVD), ble microvessels registrert ved å telle CD34 positivt fargede endotelceller som descripted tidligere [20]. Den microvessel count (MVC) ble bestemt uavhengig av to patologer i hvert enkelt tilfelle. Tre representative områder med tett neovascularization ble valgt under lav mikroskop makt (× 10 objektiv og × 10 okulær objektivet) og deretter fartøyer ble telt ved høyere forstørrelse (× 20 objektiv og × 20 okulær objektivet). Gjennomsnittet av tellingene i tre felter ble registrert. Store fartøy med tykke, muskuløse vegger ble ekskludert.
Verdien cutoff for høyt og lavt uttrykk ble fastsatt basert på en heterogenitet verdi måles gjennom log-rank statistisk analyse med hensyn på total overlevelse [21]. Farging indeksen poengsum fire ble valgt som cut-off point for diskriminering mellom BRF2 lav og høy uttrykk. Og flekker indeksen score≥4 definert svulster med høy BRF2 uttrykk og farging indeksen poengsum 4 indikerte lav BRF2 uttrykk. Svulster med microvessels ≥42 ble klassifisert som høy MVD, mens svulster med microvessels 42 ble klassifisert som lav MVD
Real-time PCR (RT-PCR)
Kirurgiske prøver ble behandlet umiddelbart. etter operasjonen. Total RNA ble ekstrahert fra vevene ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) i henhold til produsentens protokoll og behandlet med RQ1 RNase-fri DNase (Promega) cDNA ble syntetisert. Uttrykk for BRF2 og HIF-1α ble kvantifisert ved real-time polymerase chain reaction (PCR) ved hjelp av en Bio-Rad iQ5 real-time PCR system med EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, USA) i henhold til bruksanvisningen. Primeren for GAPDH og BRF2 er som følger: GAPDH, forward,5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,reverse,5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′;BRF2,forward,5′-GTGAAGCTCCTGGGACTGGAT-3′,reverse, 5′-GTATTTGGCTGGCACAGAAGG-3 «; Resultatene er gjennomsnitt ± standardfeil (SEM) av 3 gjentatte eksperimenter og GAPDH ble brukt som en referanse transkripsjon.
Western blotting-analyse
De friske vev ble vasket tre ganger med iskald fosfat -buffered saltvann (PBS) og lysert på is i RIPA (radio immunoprecipitation assay) buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) inneholder komplett proteasehemmer cocktail (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Protein fra vev eller celler ble separert via SDS-PAGE og overført til en PVDF membran (GE Healthcare, USA). Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20 (TBST) i 1,5 timer ved romtemperatur ble membranene deretter inkubert over natten ved 4 ° C med anti-BRF2 (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), eller anti-GADPH (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) antistoffer. Etterfulgt av anti- kanin pepperrot konjugert IgG, en ECL kit (GE Healthcare, USA) ble brukt for deteksjon.
Statistisk analyse
Chi-kvadrat test ble brukt for å teste sammenhengen mellom BRF2 uttrykk og MVD, og assosiasjoner mellom BRF2 uttrykk eller MVD og clinicopathological faktorer. Kaplan-Meier metoden ble brukt til å beregne overlevelseskurver, og log-rank test ble brukt for å sammenligne forskjellen mellom overlevelse av undergrupper av pasienter. Multivariat Cox regresjonsanalyse ble brukt for å identifisere vesentlige uavhengige prognostiske faktorer. Forskjeller mellom grupper ble betraktet som signifikant for P-verdi 0,05. Alle statistiske analyser ble utført med SPSS 13.0 statistisk programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
BRF2 uttrykk i NSCLC
Vi oppdaget uttrykk for BRF2 protein i normal lunge vev, ved ikke-tumor vev og tumorvev ved immunhistokjemi. Som vist på fig. 1 A, diffus nukleær farging av BRF2 protein ved forskjellige intensiteter ble observert i kreftcellene, men BRF2 var knapt påvises i normalt lungevev. I tillegg ble noen farging observert i cytoplasma av kreftceller. Men observerte vi ingen statistisk signifikant sammenheng mellom BRF2 protein uttrykk og eventuelle clinicopathological funksjoner i NSCLC vev (P 0,05, tabell 1). Middelverdien av BRF2 ekspresjon i 107 NSCLC-vev var 55,14%, betydelig høyere enn i tilstøtende vev og normalt lungevev (36,96% og 34,38%, henholdsvis, p = 0,034 Tabell 2).
(A ): uttrykket mønster av BRF2 i lungekreft vev. (A) Høy BRF2 uttrykk i lunge adenokarsinom. (B): Høy BRF2 uttrykk i lunge plateepitelkarsinom vev. (C): Negativ BRF2 ekspresjon i lunge adenokarsinom. (D): Negativ BRF2 uttrykk i lunge plateepitelkarsinom vev. (E): intratumorale microvessels var farget som brun av anti-CD34 monoklonalt antistoff i lungekreft vev (forstørrelse × 400). (B): Kvantitativ real-time PCR-analyser av BRF2 mRNA i tolv par matchet NSCLC og noncancerous vev med GAPDH som en lasting kontroll i begge paneler. (C): Protein nivåer av BRF2 uttrykk ble evaluert av western blotting fra paret noncancerous vev og NSCLC
For å undersøke status for BRF2 genuttrykk i NSCLC, vi brukte Real. -time PCR for å måle mRNA uttrykk i 12 par primære kreftsvulster og tilstøtende noncancerous prøver. Sammenlignet med sine tilstøtende noncancerous prøver, 8 av 12 NSCLC var oppregulert ekspresjon (Fig. 1B og fig. 1 C). Konsekvent, western blot analyse viste at de 8 tilfellene hadde også høyere BRF2 protein uttrykk enn tilstøtende vev.
Sammenheng mellom MVD og clinicopathologic faktorer av NSCLC
intratumorale MVD ble kvantifisert ved å telle CD34-positive endothelial celler i kreftvev (fig. 1A), og fargeintensitet av MVD varierte i stor grad fra 12 til 118 microvessels /200 x forstørrelse felt. Vi fant at MVD var signifikant korrelert med invasjonen dybde (P = 0,013), men ikke med andre clinicopathologic faktorer av NSCLC (P 0,05; Tabell 1)
Univariat og multivariat overlevelsesanalyse
. av de 107 pasientene, 53 (49,5%) tilfeller døde innen 5 år etter operasjonen, og svulst tilbakefall utviklet under oppfølging i 57 (53,3%) pasienter. Kaplan-Meier-analyser sammenlignet ved log-rank test ble anvendt for å beregne effekten av clinicopathologic faktorer på total overlevelse og sykdomsfri overlevelse. Univariat analyse viste at høy MVD (40,0% vs 63,8%, p = 0,019) og BRF2 protein overekspresjon (39,0% vs.64.6%, P = 0.004) signifikant predikerte redusert samlet 5-års overlevelse. I tillegg høy MVD (65,0 vs 38,3%, p = 0,008) og BRF2 protein overekspresjon (62,7% vs 41,7%, p = 0,006) indikerte en høyere risiko for tilbakefall (fig 2.); Videre multivariat analyse identifisert BRF2 overekspresjon (P = 0,036) og MVD (P = 0,034) som uavhengige prognostiske faktorer for progresjonsfri overlevelse. Men bare BRF2 overekspresjon beholdt sin betydning som en selvstendig prognostisk faktor for generelle samt progresjonsfri overlevelse (P = 0,021, Tabell 3 og Tabell 4).
Å utforske sammenhengen av BRF2 overekspresjon med MVD, vi videre undersøkt overlevelse forskjeller pasienter stratifisert for lav MVD og høy MVD ifølge BRF2 protein uttrykk status. For pasienter uten BRF2 overekspresjon, vi har oppdaget en svært signifikant dårligere total overlevelse (OS) og Sykdomsfri overlevelse (PFS), henholdsvis hos pasienter med høyt MVD sammenlignet med pasienter med lav MVD (P = 0,003 for OS og p = 0,001 for PFS, tabell 5). Men det var ingen signifikante forskjeller i overlevelse mellom lav-MVD gruppe og høy MVD gruppe for pasienter med BRF2 overekspresjon (P 0,05, tabell 5). Og statistisk analyse viste at det var betydelig mer MVD i svulster med BRF2 protein høy uttrykk enn i de med BRF2 protein lav uttrykk (P 0,001, Mann-Whitney U test, Fig. 3).
mann- WhitneyUtest demonstrert at svulster med BRF2 protein høy uttrykk viste signifikant høyere intratumoral MVD enn svulster med BRF2 protein lav uttrykk (p 0,001).
Vi videre analysert den prognostiske betydningen av BRF2 protein i selektiv undergrupper av pasienter stratifisert etter histologi type NSCLC. Univariat analyse viste at den totale 5 års overlevelse av pasienter med BRF2 protein høy ekspresjon var signifikant lavere enn den til de gjenværende pasientene blant squamous cell carcinoma, og vi har også funnet en trend i adenokarsinom, til tross for den statistiske analysen ikke fornuftig ; (P = 0,007 og p = 0,130, respectly, fig 4).
(a): plateepitelkarsinom.. (B). Adenokarsinom
Diskusjoner
Evnen til å spre seg ukontrollert er den dominerende karakteristisk for mange typer kreftceller. Evaluering av molekylære prognostiske faktorer er en viktig område for kreftforskning. BRF2 protein er kodet for av et gen lokalisert på kromosom 8p12 [22]. Flere studier har vist at BRF2 er overuttrykt i flere typer kreft [23] og foreslå onkogene rollen BRF2. Imidlertid har få studier undersøkt uttrykk og betydningen av BRF2 i NSCLC, spesielt for prognosen for NSCLC.
I denne studien, resultatene viste at det var ingen signifikant sammenheng mellom BRF2 uttrykk og clinicopathological funksjonene i NSCLC (p 0,05). Imidlertid høy MVD var signifikant assosiert med T-status i NSCLC, men ikke assosiert med alder, kjønn, røyking, histologi og differensiering. Til en viss grad, er T stadium en kritisk prosess for tumorutvikling, og forskjellen i korrelasjonen mellom MVD og clinicopathological funksjoner kan gjenspeile at microvessel tetthet er en viktig del av tumorutvikling. Men vi fant ingen signifikant forskjell i BRF2 uttrykk mellom lunge adenokarsinom og lunge plateepitelkarsinom ved immunhistokjemisk farging.
Spesielt våre resultater viste at BRF2 protein overekspresjon var vanlig i tidlige NSCLC vev og signifikant assosiert med økt angiogen aktivitet målt som intratumoral MVD, noe som tyder på at BRF2 spiller avgjørende rolle i NSCLC tumorigenesis ved induksjon og /eller markedsføring av tumor angiogenese. Selv om flere vekstfaktorer er blitt vist å regulere angiogenese og vaskulære utvikling, er lite kjent om den komplekse regulering mekanisme av genekspresjon og translasjon [24]. Våre resultater markere potensielle rolle BRF2 i tumor angiogenese.
Vår overlevelse analyse viste at høy MVD og BRF2 protein overekspresjon betydelig spådd redusert samlet 5-års overlevelse og høyere tilbakefall. Videre analyser ved hjelp av Cox regresjonsmodellen bekreftet at BRF2 uttrykk og MVD var uavhengige faktorer i å forutsi progresjonsfri overlevelse for NSCLC pasienter, noe som tyder på at BRF2 protein og MVD kan være potensielle prognostiske faktorer for tilbakefall av tidlig stadium NSCLC pasienter. Men i multivariat analyse, bare BRF2 uttrykket kan selvstendig og i betydelig grad forutsi samlet 5-års overlevelse, til tross for funn som høy MVD ble signifikant assosiert med tumor tilbakefall. Våre data indikerer at BRF2 overekspresjon hadde en overveldende innflytelse på OS og PFS, mens MVD viste en signifikant effekt på OS og PFS bare i de pasienter uten BRF2 overekspresjon.
Til sammen våre data støtter antagelsen om at BRF2 protein over-uttrykk er vanlig i tidlig stadium NSCLC og signifikant korrelert med tumor angiogenese og tilbakefall. Videre er BRF2 overekspresjon en uavhengig prognostisk faktor for NSCLC.
