Abstract
Milk Fat Globule – EGF – faktor VIII (MFGE8), også kalt lactadherin, er et utskilt protein som binder ekstracellulært til fosfatidylserin og til αvβ3 og αvβ5 griner. På menneske- og museceller uttrykker disse griner, som endotelceller, fagocytter og noen svulster har MFGE8 /lactadherin vist seg å fremme overlevelse, epitelial til mesenchymale overgang og fagocytose. En protumoral funksjon MFGE8 har derfor blitt dokumentert for noen typer kreft hos mennesker, inkludert melanom, en undertype av brystkreft, og blære carcinoma. Inhibering av funksjonene til MFGE8 kan således representere en ny type terapi for humane kreftformer. Her viser vi ved immunhistokjemi på en samling av menneskelige eggstokkreft som MFGE8 er overuttrykt i 45% av disse svulstene, og vi bekrefter at det er spesielt overuttrykt i trippel-negativ subtype av menneskelige brystkreft. Vi har etablert nye
in vitro
analyser for å måle effekten av MFGE8 på overlevelse, adhesjon og migrasjon av menneskelig eggstokkreft og trippel-negativ brystkreft cellelinjer. Ved hjelp av disse analysene, kunne vi identifisere nye MFGE8 spesifikke monoklonale antistoffer, som effektivt blokkerte disse tre kreftfremmende effekten av MFGE8. Våre resultater tyder på fremtidig bruk av MFGE8-blokkerende antistoffer som nye anti-kreftbehandling i undergrupper av ovarialcancer, og trippel-negativ brystkreft pasienter
Citation. Tibaldi L, Leyman S, Nicolas A, Notebaert S, Dewulf M, Ngo TH, et al. (2013) Nytt Blokkering Antistoffer hindre vedheft, migrasjon og overlevelse av eggstokkreft celler, utheving MFGE8 som et potensielt terapeutisk mål av menneskelige ovarialcancer. PLoS ONE åtte (8): e72708. doi: 10,1371 /journal.pone.0072708
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 18 januar 2013; Godkjent: 15 juli 2013; Publisert: 16 august 2013
Copyright: © 2013 Tibaldi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Institut Curie, INSERM, Association pour la Recherche contre le Cancer, en premie fra Fondation de France, og en to-års samarbeidskontrakten mellom Institut Curie, INSERM, og ThromboGenics NV, Leuven, Belgia (www.thrombogenics.com) . ThromboGenics NV skissert strategien for antistoff generasjon, utført musene immunisering, sjekket spesifisiteten av de nye anti-human MFGE8 antistoffer, sekvensert sine variable regioner, og deltatt i utformingen av testene for valg av hovedkandidat antistoffer.
Konkurrerende interesser: forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: en del av dette arbeidet ble subsidiert av midler til Clotilde tHERY team inkludert Lorenzo Tibaldi lønn, som et samarbeid kontrakt mellom Institut Curie, INSERM, og ThromboGenics NV, Belgia. Shirley Leyman, Sofie Notebaert, to Hoa Ngo og Claudia Zuany-Amorim er ansatt ThromboGenics NV. En internasjonal PCT-søknad som dekker de beskrevne antistoffer, co-eid av ThromboGenics NV, Institut Curie og INSERM har blitt arkivert under nummeret PCT /EP2013 /056057. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer med akademiske laboratorier.
Innledning
For å utvikle seg som en fullverdig svulst, må en celle ikke bare erverve celle-autonome egenskaper spredning og motstand mot programmert død, men også etablere samspill med sin mikromiljøet slik at dens vedvarende spredning, og unngå dens eliminasjon [1]. Fibroblaster, endotelceller danner blodkar, og immunceller alle utveksle signaler med de transformerte cellene gjennom direkte ligand-reseptor-interaksjoner, samt gjennom løselige faktorer og ekstracellulære membranvesiklene som virker i en avstand fra tumorcellene. Svulster kan dermed skille ut vekstfaktorer som opptrer i en autokrin måte å opprettholde sin overlevelse, men også i en parakrint måte på de andre cellene i deres mikro
Milk Fat Globule -. EGF – Faktor VIII (MFGE8), også kalt lactadherin, er en av disse faktorene utskilt med pleiotrope potensielle funksjoner. Opprinnelig klonet som et viktig protein av melkefettkulene [2,3], bovint, humant (MFGE8) og mus (Mfge8) proteiner er blitt vist å inneholde to forskjellige funksjonelle domener: EGF-lignende domener, inkludert et RGD-inneholdende sekvensen bindings til αvβ3 og αvβ5 griner, og faktor VIII-lignende (eller discoidin) domener binding til fosfolipider (fosfatidylserin og fosfatidyletanolamin). MFGE8 /Lactadherin er således bindes ikke-kovalent til lipider på ekstracellulære vesikler, og samvirker med målceller som uttrykker αvβ3 /5 integriner. MFGE8 binding til endotelceller, er blitt vist å fremme VEGF-avhengig overlevelse og angiogenese [4], så vel som fagocytose av apoptotiske celler [5]. I mus, fremmer Mfge8 fagocytose av apoptotiske celler fra makrofager [6], og forskyver dem til å utskille cytokiner tolerogene [7]. På enkelte kreftceller selv, ble MFGE8 vist å indusere epitelial til mesenchymale overgang [8,9], og /eller for å øke motstanden mot narkotika-indusert apoptose [10,11].
Alle disse resultatene markere MFEG8 som et lovende mål for hemmere som kan utvikles for å begrense tumorprogresjon. I noen typer kreft hos mennesker, har en pro-tumor rolle MFGE8 blitt vist, basert på høy overekspresjon under tumorprogresjon, og /eller på analyse av musemodeller: disse kreftformene inkluderer blære carcinoma (vårt eget arbeid [12]), melanom [8], og trippel-negative subtype av brystkreft [13]. Men i enkelte andre kreftformer, som hormonreseptor (HR) og /eller HER2-uttrykke menneskelige brystkreft [13], MFGE8 er ikke overuttrykt, og det synes i stedet å hindre tumorprogresjon. Således, genererer nye verktøy for å hemme de pleiotrope funksjoner av MFGE8, så vel som å finne riktige humane kreft mål for slike verktøy, må utføres samtidig dersom vi ønsker å oppnå en effektiv nye behandlingsformer.
Her, ved å analysere MFGE8 uttrykk i store matriser av humane tumor biopsier, og ved å etablere nye funksjonelle analyser for å måle effekten av MFGE8 og nye MFGE8-blokkerende antistoffer på fysiologi av tumorceller, identifiserte vi ovarialcancer, og bekreftet trippel-negativ brystkreft som lovende mål som kan ha nytte av MFGE8-hemmer behandling.
Resultater
MFGE8 overekspresjon i eggstokkreft
i et tidligere arbeid, ved hjelp av offentlig tilgjengelige mRNA expression data samlet i oncomine nettsted (
www.oncomine.org
), observerte vi en signifikant oppregulering av
MFGE8
genet på transcriptomic nivå i en undergruppe av kreft hos mennesker, inkludert eggstokkene serøse adenokarsinomer [12]. Gitt behovet for nye behandlinger for kreft, som ofte presenterer i avansert stadium, bestemte vi oss for ytterligere å utforske rollene til MFGE8 i ovarialcancer. For å bekrefte observasjon av
MFGE8
mRNA overekspresjon på proteinnivå, vi brukte to kreft microarrays generert på huset, som inneholder 50 biopsier fra eggstokkreft pasienter i alle karakterer og typer (Tabell S1). Immunhistokjemi for å påvise MFGE8 i disse svulstene ble utført ved hjelp av vår tidligere beskrevet kanin polyklonale anti-MFGE8 antistoff [4], og analyse av stainings ble utført av en patolog. Som tidligere rapportert [4,12], ble MFGE8 påvist i blodårene stede i svulstene (pil i figur 1a). I tillegg ble MFGE8-positive tumorceller selv observert i flere biopsier. Som vist i figur 1a, det totale ekspresjonsnivået av proteinet var variabel mellom individuelle tumorer, som strekker seg fra fraværende (0), til meget sterk i hele tumor (3). Rangering av tumorer i henhold til nivået av MFGE8 protein (figur 1b) viste at 45% (22/48) sterkt uttrykt MFGE8 (nivå 2-3). MFGE8-overekspresjon tumorer var av alle karakterer (1 til 3, figur 1b), av alle typer, og av forskjellige metastatiske status (tabell S1), for således MFGE8 overekspresjon kunne ikke brukes enten som en prognostisk eller diagnostisk markør for ovariekreft. Den høye andelen svulster overekspresjon MFGE8 imidlertid bedt oss om å utforske videre sin verdi som et terapeutisk mål for eggstokkreft
(a) Eksempler på Menneskelig MFGE8 immunhistokjemi på ovarialcancer seksjoner som viser:. Ingen farging av tumorceller (0 poeng), men MFGE8-positive endotelceller (svart pil) i venstre panel. Områder i svak uttrykk (w) og middels uttrykk (m) av MFGE8 i samme avsnitt, og dermed rangert som satte inn 2 i det midtre panelet. Sterk MFGE8 uttrykk (e) i hele svulsten, rangert som score (høyre panel) 3. (B) Skårer for MFGE8 uttrykket (y-aksen) i 48 eggstokkkreft biopsier fra Institut Curie-pasienter, som en funksjon av tumor klasse (x-aksen). Ingen statistisk signifikant forskjell ble observert i fordelingen av svulster overekspresjon MFGE8 (skår 2-3) eller ikke (0-1) i klasse 2 versus karakteren 3 svulster.
Utvikling av in vitro-analyser for å kvantifisere effektene av MFGE8 på eggstokkreft celler
Siden MFGE8 har vært vist i ulike celletyper, inkludert noen kreftceller, for å fremme vedheft, overlevelse og /eller epitelial til mesenchymale overgang muligens fører til migrasjon, setter vi opp nye
in vitro
analyser for å måle disse fysiologiske resultatene i sammenheng med ovarialcancer. I de fleste studiene ble disse effektene av MFGE8 tilskrives den bindende αvβ3 og /eller αvβ5 inte på målceller. For å velge cellelinjer for å vurdere effekten av anti-MFGE8 terapier, vi først analysert mRNA uttrykk nivået av
MFGE8 Hotell og dets reseptorer i en samling av menneskelige eggstokkreft cellelinjer. Offentlige resultater fra Bred Novartis Cancer Cell linje Encyclopedia ble brukt til dette formålet (https://www.broadinstitute.org/ccle/home). Ut av de 38 tumorcellelinjer (figur 2a), hadde bare fem ikke uttrykke
MFGE8
over sikkerhetsnivå ((MAS5 «Fraværende» flagg som tilsvarer en Affymetrix U133plus2.0 uttrykk signal (Log
2 .) som er lavere enn 6,1 for denne probeset) Vi bekreftet MFGE8 proteinutskillelse ved hjelp av ELISA-analyse av det kondisjonerte medium av to av de mRNA-uttrykkende cellelinjer: SKOV-3 og IGROV-1, og vi har identifisert en annen eggstokk-karsinom-cellelinje, skulle skinne 3 [14], som ikke utskiller påvisbare nivåer av MFGE8
in vitro
(figur 2b). de 38 tumorcellelinjer uttrykte gener som koder for αv (
ITGAV
, ekspresjon signal ovenfor 10 i de fleste tilfeller ikke data vist), og β5 integrin kjeder (
ITGB5
, figur 2c). i motsetning til Affymetrix signal for β3 inte kjeden (
ITGB3
) var bare i nærheten av tillit nivå (uttrykket signal = 4,8 for denne probeset) for de fleste cellelinjer (23/38 = 60,5%), inkludert SKOV-3 og IGROV-1, noe som tyder på svak eller ingen ekspresjon av dette integrin. ved strømningscytometri, imidlertid både SKOV-3 og IGROV-1 vises αvβ3 i tillegg til αvβ5 på sin overflate, mens SHIN-1 vises kun αvβ5 (figur 2d). Vi valgte dermed Skov-tre cellelinje som et representativt eksempel på en stor andel av eggstokkreft cellelinjer (middels til høy
MFGE8
, påviselig
ITGB3 Hotell og
ITGB5
), og en mottagelig til å reagere på MFGE8 ettersom den uttrykte de kjente reseptorer for MFGE8, for å utvikle de funksjonelle
in vitro
analyser.
(a) Analyse av mRNA ekspresjonsnivåer ( Logg
2 (Affymetrix U133plus2.0 signal)) av
MFGE8
i felles resultatene av microarray data for Bred Novartis Cancer Cell linje Encyclopedia. Uttrykket nivå terskelen bak som det kan betraktes som støy (MAS5 «Absence» flagg-status, genet uttrykkes ikke) er 6,1 for dette probeset. Sorte piler indikerer SKOV-3 og IGROV-1-cellelinjer. (B) Kvantifisering av MFGE8 ved ELISA i Skov-3, IGROV-en og Shin-3 kondisjonert medium (24 timer). Utskilt MFGE8 er uttrykt i ng /ml pr 10
6 dyrkede celler. Gjennomsnitt av to eksperimenter + SD. (C) Analyse av mRNA uttrykk nivåer (Log
2 (Affymetrix U133plus2.0 signal)) av
ITGB3 plakater (rød) og
ITGB5 plakater (grønn) på felles resultatene av microarray data av Bred Novartis Cancer Cell linje Encyclopedia. Uttrykket nivå terskelen bak som det kan betraktes som støy (MAS5 «Absence» flagg-status, genet uttrykkes ikke) er 4,8 for
ITGB3
probeset. (D) FACS-analyse av αvβ3 (øvre panel) og αvβ5 (nedre panel) griner ekspresjon på overflaten av SKOV-3, IGROV-1 og SHIN-3-celler. Spesifikke antistoff (blå linje). Isotypekontrollantistoff (rød linje).
Vi utviklet 3 typer analyser for å undersøke effektene av MFGE8 på adhesjon, migrasjon og overlevelse av kreftceller. Den xCELLigence system (ACEA Biosciences), en anordning som tillater sanntids måling av cellebinding til et substrat, ble anvendt for å kvantifisere kortvarig adhesjon til human rekombinant MFGE8 (figur 3a-e), og langsiktig transwell vandring mot MFGE8 i nærvær av føtalt kalveserum (FCS 0,1%) (figur 3f-h). Klassisk fluorescens-baserte kvantifisering av celletall ble brukt for å vurdere langtidsoverlevelse i sult betingelser (figur 3i, j).
(a-e) Analyse for adhesjon av SKOV-3 til MFGE8 hjelp av xCELLigence systemet . (A) Eksempel på celleindeks (CI) som en funksjon av tid, på PBS eller human MFGE8 (huMFGE8), i nærvær av anti-huMFGE8 eller kontroll IgG. Blå og røde vertikale linjer angir tidspunktene for beregning av skråningen verdier. (B) Klebe SKOV-3 til MFGE8, sammenlignet med PBS (Ctrl), kvantifisert ved helling verdi mellom 0 og 2 timer. (C) hemming av adhesjon til 5 ug /mL MFGE8 ved 10 ug /ml anti-huMFGE8 (hMc3) eller en negativ kontroll (Rituximab, Ritux). (D) Virkning på adhesjon til 5 pg /mL MFGE8 (Ctrl) av polyklonalt antisera huMFGE8 (1/100) som er spesifikt for den RGD-domenet (anti RGD), C1 domene (anti C1) eller RGD-domene av muse Mfge8 (anti mus RGD). (E) hemming av adhesjon til 5 pg /mL MFGE8 (Ctrl) ved hjelp av anti-αvβ3 og /eller -αvβ5 integrin-antistoffer (5 ug /ml hver gang). (F-g) Assay for migrering av SKOV-3 ved anvendelse av xCELLigence. Celler ble sådd ut i det øvre kammer, og MFGE8 og antistoffer i det nedre kammer av CIM-plater. (F) Eksempel på celle index (y-aksen) som en funksjon av tid (x-aksen), i tilsvarende forhold som (a). Blå og røde vertikale linjer angir tidspunktene for beregning av skråningen verdier. (G) Doseavhengig effekt av MFGE8 på SKOV-3-migrasjon, sammenlignet med PBS (Ctrl), kvantifisert ved helling verdi mellom 0 og 18 timer. (H) hemming av migrasjon til 5 ug /mL huMFGE8 ved 10 ug /ml anti-huMFGE8 hMc3, sammenlignet med negativ kontroll (Ritux). (I-j) Overlevelse analyse av SKOV-3 dyrket i 96 timer i nærvær av 0,1% serum. Celle nummer kvantifiseres som fluorescence vilkårlige enheter (A.U.) som sammenlignet med kontrollen tilstand som tilsvarer 100%. (I) Doseavhengig effekt av MFGE8 på SKOV-3 overlevelse. 100% = basalnivået A.U. i fravær av eksogene MFGE8 (Ctrl). (J) Inhibering av overlevelse i nærvær av 10 mikrogram /ml huMFGE8, ved 10 ug /ml hMc3 eller den negative antistoff. 100% = basalnivået A.U. i nærvær av MFGE8. Data er representert som Box-and-whiskers grafer som viser minimum (lavere feil bar), 25
th persentil-median-75
th persentil og maksimum (øvre error bar) verdier. N = 4 (bortsett fra 3j: N = 5). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P 0,05 sammenlignet med Ctrl = PBS i 3b, g; til 0,312 mg /ml MFGE8 i 3i; eller Ctrl = MFGE8 i 3c, d, e, h, j ..
xCELLigence enhet kontinuerlig måler endringer i impedans indusert av cellene når de møter elektroder som dekker bunnen av en kultur mikro (eplate ). Nivået av impedans-signal er proporsjonal med antall celler, og intensiteten av deres interaksjon med substratet, og dette signal kan således omdannes til en vilkårlig celle indeksverdi (figur 3a, f). Effektiviteten av cellen binding beregnes som helningen av impedansen observert i de første to timene etter såing celle (figur 3a-e). For å måle adhesjon av SKOV-3 til MFGE8, ble rekombinant human MFGE8 belagt på xCELLigence mikrobrønnene, i forhold som ligner de som vi tidligere hadde brukt til å analysere binding av humane endotelceller til MFGE8 [4]. Figur 3b viser at MFGE8 tillot binding av cellene til substratet på en doseavhengig måte. Vi har testet effekten av tidligere beskrevne antistoffer som er spesifikke for human MFGE8 i denne analysen: kaninsera som genereres i vårt laboratorium, erkjenner henholdsvis enten det RGD-inneholdende integrin-bindende domene [4] eller den discoidin C1 domene av human MFGE8 (C. Thery, upubliserte data), og en humanisert versjon av MC3 monoklonale antistoff beskrevet av Ceriani et al [15], (hMc3) [16] også erkjenner den integrin-bindende domene av MFGE8. Både hMC3 antistoff (figur 3c), og kanin-anti-RGD domene (figur 3d) inhiberte sterkt celleadhesjon, mens ingen av en styre humanisert antistoff (Ritux, figur 3c), og heller ikke kanin anti-C1 domene serum, og heller ikke en kaninserum til RGD-domenet av mus Mfge8 (anti C1 eller anti mus RGD, Figur 3d) hemmet den. Til slutt, blokkerer antistoffer mot αvβ3 eller αvβ5 hemmet binding, og deres effekter var additive (figur 3e). Dermed er heft Skov-3 til MFGE8 formidlet av samspillet av αvβ3 /5-uttrykker celler med RGD-holdige domene av MFGE8.
xCELLigence enhet var neste brukes med elektrodebelagt Boyden kammer mikro ( Plater CIM), som tillater måling av impedansen produsert etter overføringen av cellene i den nedre side av en 8 um pore-filter som skiller den øvre fra det nedre kammer (figur 3f). Evnen av celler til å migrere mot MFGE8 holdige nedre rom, i nærvær av en identisk liten mengde FCS i begge kamrene (0,1%), ble beregnet som helningen av celleindeks på mellom 0 og 18 timer etter celle seeding i øvre kammer (figur 3f-h). Figur 3g og 3h viser at MFGE8 indusert SKOV-3 migrering på en doseavhengig måte, og at, som for adhesjonsassayet, hMC3 spesifikt inhiberte denne effekten.
Den tredje analysen målte effekten av MFGE8 på overlevelse av SKOV-3 celler dyrket i sult forhold (0,1% FCS). Tilstedeværelsen av MFGE8 induserte en doseavhengig økning av SKOV-3 overlevelse, påvisbare fire dager etter utsåing (figur 3i), som, selv om det ikke er meget sterk, var reproduserbare. Denne effekten ble også spesifikt blokkert av MFGE8 spesifikke hMC3 antistoff (Figur 3j).
Generering av nye anti-MFGE8 monoklonale antistoffer med anti-tumor egenskaper
For å validere vår nye robust og reproduserbar
in vitro
analyser som verktøy for å identifisere nye MFGE8 blokkerende midler, brukte vi dem til å undersøke et stort sett med nye anti-MFGE8 antistoffer dannet ved å immunisere våre Mfge8-mangelfull mus [4,17] med rekombinant MFGE8. I alle analyser, ble forsøksbetingelser sammenlignet med celler dyrket i nærvær av MFGE8, betraktet som 100% signal. De monoklonale antistoffer som viser spesifikk binding til human MFGE8
in vitro
, og ingen binding til andre proteiner med felles strukturelle domener (dvs. vitronektin og faktor VIII) ble testet i SKOV-3 adhesjonsanalysen. De forskjellige antistoffer som vises forskjellige inhiberende aktivitet i denne analysen. Figur 4a viser eksempler på resultatene fra det første skjermbildet (utført en gang) for 10 kandidater. Vi valgte fem antistoffer som viste aktivitet tilsvarende til referanse antistoffet hMc3 når de anvendes ved 50 eller 10 ug /ml.
(a) Virkning av 10 nye anti-MFGE8 antistoffer (10 eller 50 ug /ml) på adhesjon til MFGE8 (adhesjonsassayet), sammenlignet med hMC3. 100% adhesjon svarer til 5 pg /mL MFGE8 belegg uten antistoffer (Ctrl). Eksempel på screening forsøkene utført en gang med hver av de 40 nye antistoffer. Svarte piler indikerer antistoffer valgt for ytterligere karakterisering. (B) Dose-responseffekt av de 5 utvalgte antistoffer, sammenlignet med hMC3 i adhesjonsassayet. (C) dose-responseffekt av de 5 utvalgte antistoffer, sammenlignet med hMC3 i migrasjon analysen. 100% migrering svarer til 5 pg /mL MFGE8 uten antistoffer. (D) Dose-responseffekt av de 5 utvalgte antistoffer, sammenlignet med hMC3 i overlevelse analyse. 100% overlevelse tilsvarer 10 ug /ml rekombinant MFGE8 uten antistoffer. Box-and-kinnskjegg grafer som i figur 3. N = 4 (unntatt i (c) for 215A9 -10 mg /ml og 311A7 -0,625 mikrogram /ml: N = 3 og for hMc3 n = 2, i (b) for 215A9 -5μg /ml: N = 2). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P. 0,05 sammenlignet med den laveste antistoffkonsentrasjon (0,5 eller 0,625 mg /ml) for hver enkelt antistoff i 4b, c, d
For å bestemme effekten av disse 5 kandidater, avtagende mengder av antistoff 50 til 0,5 ug /ml ble anvendt i adhesjonsassayet (figur 4b). I nærvær av 10 ug /ml av hMc3 eller alle kloner, med unntak av 346B6, ble det observert mindre enn 20% av celleadhesjon. I tilfelle av 346B6 ved 10 ug /ml, ble 40% av celleadhesjon detektert (median av 4 målinger). I nærvær av 0,5 ug /ml av tre kloner (416H9, 311A7 og 399A12), 60% celleadhesjon ble observert, mens 90% adhesjon ble oppnådd med hMc3 ved denne konsentrasjonen.
Når den testes i et dose reaksjon innstilling i migrasjonsanalysen (figur 4c), alle antistoffer redusert migrering når de anvendes ved den høyeste konsentrasjon (20 pg /ml). To kloner (416H9, 399A12) betydelig redusert migrering når det brukes på 2,5 ug /ml.
Til slutt ble antistoffene prøvet i overlevelse analyse i nærvær av 10 ug /ml MFGE8 (= 100% overlevelse i figur 4d). 346B6, den minst effektive klonen i de to andre analyser, ikke redusere overlevelse ved hvilken som helst konsentrasjon, to andre indusert høyst 30% inhibering (= 70% celleoverlevelse signal forble) når de anvendes ved den høyeste konsentrasjon (2154A9 og 311A7), mens de siste to (416H9 og 399A12) var like effektive som hMc3, og nedsatt celletallet til mindre enn 50% av MFGE8 stående behandlede celler (= 50% overlevelse).
den kombinerte bruk av tre komplementære analyser dermed lar den klare utvalg av 2-antistoffer, av 40, som potensielt mest effektive verktøy for å samtidig hindre adhesjon, migrasjon og overlevelse av MFGE8- og αvβ3 /5-uttrykke ovarialcancer.
Effekt av MFGE8 og MFGE8 blokkerende antistoffer på andre ovarian carcinoma celler
for å avgjøre om resultatene som oppnås med Skov-3 var representative for andre ovarian carcinoma cellelinjer utførte vi de samme tre analysene ved hjelp IGROV-en og Shin-3, som, som vist i figur 2, enten uttrykt MFGE8 og αvβ3 /5 inte på nivåer tilsvarende Skov-3 (IGROV-1), eller ikke uttrykke MFGE8 eller αvβ3 inte (Shin-3). Tre antistoffer representant for de tre typene effektivitet observert i Skov-3 ble brukt her: 399A12, 311A7 og 346B6, henholdsvis høy, middels og lav blokkering effektivitet. I xCELLigence baserte adhesjonsassayet (figur 5a, b), SHIN-3 ga en 20-ganger lavere impedans signal enn SKOV-3 eller IGROV-1 (sammenlign helling verdier i fig 5b og 5a), men som i SKOV-3 , ble adhesjonen øket for begge cellelinjer i nærvær av 5 ug /ml MFGE8, og hemmet på en doseavhengig måte ved hjelp av de 3 antistoffer. I migreringsanalyse (figur 5c, d), hvor SHIN-3 vises en hastighet på migrasjon i likhet med SKOV-3 og IGROV-1, de tre antistoffene også hemmet MFGE8-avhengig migrering av IGROV-1 og SHIN-3 i en dose -avhengig måte, og med den samme høy-, middels- og lav effektivitet som i SKOV-3. I motsetning til dette overlevelse analyse (figur 5e, f) en annen effekt av MFGE8 på de tre cellelinjer: SHIN-3 ikke viser noen økt overlevelse i nærvær av MFGE8, og heller ikke noen effekt av de MFGE8-blokkerende antistoffer i denne analysen, mens IGROV-1 oppførte seg som SKOV-3.
(a-b) Klebe IGROV-1 (a) og SHIN-3 (b) til 5 ug /ml MFGE8, sammenlignet med PBS, kvantifisert ved helling verdi mellom 0 og 2 timer. Effekten av tre utvalgte antistoffer levert på to doser (2,5 og 10 ug /ml) på MFGE8-belagte brønner er også vist. (C-d) IGROV-1 (c) og SHIN-3 (d) migrering analysen til 5 ug /ml MFGE8 som i figur 3-4, og hemming av antistoffer som i panelene a og b for adhesjon. Skråninger beregnet verdier mellom 0 og 18 timer. (D-e) IGROV-1 (d) og SHIN-3 (e) overlevelse analyse i nærvær av 10 ug /ml MFGE8, som i figur 3-4, og hemming av 2,5 eller 10 ug /ml antistoff. 100% overlevelse tilsvarer 10 ug /ml MFGE8 uten antistoffer. Box-og-whiskers grafer som i figur 3. N = 4 (bortsett fra i (b): 399A12 -2,5 ug /ml, 346B6 -10 ug /ml, 311A7 -10 ug /ml: N = 3; i (e, f) PBS og MFGE8: N = 5; i (f) MFGE8 + 311A7: N = 3). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P. 0,05, sammenlignet med Ctrl = MFGE8
MFGE8 overekspresjon i trippel negative brystkreft
Til slutt, for å avgjøre om nye MFGE8-blokkerende midler, for eksempel antistoffer identifisert ovenfor, kan benyttes for behandling av andre tumorer, analyserte vi MFGE8 ekspresjon av immunhistokjemi i vår kolleksjon av brysttumor biopsier generert fra pasienter som er behandlet ved Institut Curie (tabell S2). MFGE8 ble sterkere uttrykt i pasienter med avanserte grader av brystkreft (figur 6a), og mer spesifikt i trippel-negativ HR- /HER2- subtype av disse kreftformene (som er i flertall av grad 3): 13/20 = 65 % av trippel-negative biopsier viste MFGE8 nivåer rangert som to eller tre, mens bare 5/36 = 13,8% av hormon reseptor (HR) og /eller HER2-positiv tumor viste nivå 2 eller 3 av MFGE8 uttrykket (figur 6b). Disse observasjonene dermed bekrefte resultatene nylig publisert av Yang og kolleger [13].
(a-b) Scoring av MFGE8 uttrykk, analysert ved immunhistokjemi som i figur 1, i 59 brystkreft biopsier fra Institut Curie-pasienter, som en funksjon av tumor klasse (a) eller fenotype når det gjelder hormon reseptor (HR) eller HER2 uttrykket (b). ***: P = 0,0001 for distribusjon av svulster overekspresjon (skår 2-3) eller ikke (0-1) MFGE8 mellom grad 2 versus klasse 3 svulster (a), eller mellom HR + /HER2- versus trippel-negativ tumorer ( b). (C) Analyse av mRNA uttrykk nivåer (Log
2 (Affymetrix U133plus2.0 signal)) av
MFGE8
i felles resultatene av Affymetrix microarray data for Bred Novartis Cancer Cell linje Encyclopedia som i figur 2 . Svart pil indikerer MDA-MB-231 cellelinje (HR /HER2- trippel negativ fenotype) valgt for etterfølgende eksperimenter. (D) Kvantifisering av MFGE8 ved ELISA i MDA-MB-231 kondisjonert medium (24 timer). Utskilt MFGE8 er uttrykt i ng /ml pr 10
6 dyrkede celler. Gjennomsnitt av to eksperimenter + SD. (E) FACS-analyse av αvβ3 (venstre panel) og αvβ5 (høyre panel) integrin ekspresjon på overflaten av MDA-MB-231-celler. Spesifikke antistoff (blå linje). Isotypekontroll (rød linje). (F) MDA-MB-231 adhesjonsassayet på 5 ug /ml MFGE8, som i figur 3-5, og hemming av 10 ug /ml hMC3, representert som skråningen verdier mellom 0 og 1 time. (G) MDA-MB-231 migrering analysen til 5 ug /ml MFGE8 som i figur 3-5, og hemming av 10 ug /ml 215A9 antistoff. Data representeres som skråningen verdier beregnet mellom 0 og 18 timer. (H) MDA-MB-231 overlevelse analyse i nærvær av 10 mikrogram /ml MFGE8, som i figur 3-5, og hemming av 10 ug /ml 399A12. 100% overlevelse tilsvarer 5 ng /ml MFGE8 uten antistoffer. Box-and-kinnskjegg grafer som i figur 3. N = 4 (unntatt i (g): PBS N = 6, MFGE8 + 215A9 N = 5, og i (h): ctrl N = 6, MFGE8: N = 5) . ***: P 0,001, **. P 0,01, sammenlignet med Ctrl = MFGE8
Jevnt, analyse av Bred Novartis Cancer Cell linje Encyclopedia ekspresjonsdata av brystkreftcellelinjer viste uttrykk for
MFGE8
over sikkerhetsnivå (Log
2 Affymetrix U133plus2.0 signal fra MAS5 «fravær» flagg = 6,1 for
MFGE8
) i de fleste trippel-negativ bryst-celler (24/29 = 82%), mens bare 2/23 = 9% av HR og /eller HER2 + celler som uttrykte genet (figur 6c). Endelig testet vi effekten av MFGE8 og blokkerer antistoffer på adhesjon, migrasjon og overlevelse av trippel-negativ MDA-MB-231 cellelinje som utskiller MFGE8 og uttrykker αvβ3 og αvβ5 griner som Skov-3 og IGROV-en (figur 6d, e). Som vist i figur 6f-h, vist MDA-MB-231 MFGE8-indusert adhesjon (figur 6f), migrasjon (figur 6g), og overlevelse (figur 6h). Videre anti-MFGE8 antistoffer vises tilsvarende effekter på MDA-MB-231 som de gjorde på SKOV-3 celler.
Våre resultater bekrefter således MFGE8 som et lovende mål for et antistoff-basert strategi med sikte på å blokkere svulst vekst av trippel-negativ brystkreft
Diskusjoner
resultatene som presenteres her markere en ny type kreft som et potensielt mål for MFGE8-blokkerende behandling. ovarialcancer. Videre beskriver vi nye analyser tilpasningsdyktig til storskala screening, og til kreftcellelinjer i forskjellige vev opprinnelse, som vil tillate å identifisere de mest nyttige MFGE8-blokkerende midler for å bli neste som brukes i pre-klinisk
in vivo
tumorvekst analyser.
kombinert analyse av 3 fysiologiske virkningene av MFGE8 /lactadherin på kreftceller, dvs. adhesjon, migrasjon og overlevelse, tillot oss å rangere 5 forskjellige MFGE8-spesifikke antistoffer, og å sammenligne dem med referansen antistoff hMc3. MC3 ble beskrevet for 30 år siden for sin evne til å binde til sirkulerende mammary epiteliale celleantigener hos kreftpasienter [18]. Det ble snart etter vist å hemme veksten av humane brystsvulster i nakne mus, enten alene [15], eller mer effektivt, som et konjugat med
131I [19]. Den antigen gjenkjennes av MC3 ble klonet som MFGE8 (på den tiden kalt BA46) et par år senere [3], og epitop kartlegging identifisert RGD-holdige EGF domene som mål for MC3, mens et annet antistoff, Mc8, anerkjent en epitop i C2 domene og ikke vise antitumor aktivitet
in vivo product: [20]. I våre tre analysene, MC3 inhiberte effektivt virkningene av rekombinant MFGE8, noe som tyder på at den RGD-domenet og dets interaksjon med αvβ3 /5-integriner er nødvendig for adhesjon, migrasjon gjennom transwell, og celleoverlevelse. Siden vi observert at blant våre to anti-MFGE8 kaninantiserum, bare den ene erkjenner RGD domeneblokker vedheft, kan vi utelukke en rolle andre områder av MFGE8 i denne type funksjon. Men vi kan ikke utelukke at migrasjon og overlevelse kan også være mediert av andre typer interaksjoner av MFGE8 med målcellen, eventuelt via en annen reseptor, som foreslått for spermier binding til egg mediert av SED1 (et annet navn på MFGE8) [21]. Blant de 40 nye MFGE8-spesifikke monoklonale antistoffer generert under dette prosjektet, kan noen vise en RGD-uavhengig migrasjon eller overlevelse hemmende aktivitet, men vi gjorde ikke analysere dem, siden den første runden av screening og utvelgelse var basert utelukkende på vedheft analysen.
