Abstract
Bakgrunn
Opplysning av repertoar av utskilte og celleoverflateproteiner av tumorceller er relevant for molekylær diagnostikk, tumoravbildning og målrettet terapi. Vi har preget celleoverflaten proteomet og proteiner slippes ut i ekstra-cellulære miljø av tre eggstokkreft cellelinjer, CaOV3, OVCAR3 og ES2 og ovarietumorceller beriket fra ascitesvæske.
Metode og funn
for å skille proteiner slippes ut i media fra protein bestanddeler av media brukes for kultur, celler ble dyrket i nærvær av [
13C] -merket lysin. En biotinylering baserte tilnærmingen ble anvendt for å fange opp celleoverflate tilknyttede proteiner. Det generelle eksperimentelle strategi besto av fraksjonering av proteiner fra de enkelte avdelinger, etterfulgt av proteolytisk fordøyelse og LC-MS /MS-analyse. Totalt ble noen 6400 proteiner identifisert med høy tillit på tvers av alle prøver og fraksjoner.
Konklusjoner og Betydning
Protein profiler av cellelinjene hadde betydelig likhet med profiler av menneskelig eggstokkreft celler fra ascites væske og inkludert protein markører som er kjent for å være assosiert med kreft i eggstokkene. Proteomikk analyse indikerte omfattende Shedding fra ekstra-cellulære domener av proteiner uttrykt på celleoverflaten, og bemerkelsesverdig høy sekresjon priser for enkelte proteiner (nanogram per million celler per time). Celleoverflaten og utskilte proteiner identifisert av inngå proteomikk profilering av eggstokkreft celler kan gi nye mål for diagnostikk og terapi
Citation. Faca VM, Ventura AP, Fitzgibbon MP, Pereira-Faca SR, Pitteri SJ, grønn AE, et al. (2008) proteomikk Analyse av eggstokkreft celler avslører dynamiske prosesser av protein sekresjon og Shedding av Extra-Cellular domener. PLoS ONE 3 (6): e2425. doi: 10,1371 /journal.pone.0002425
Redaktør: Axel Imhof, Universitetet i München og Center of Integrated Protein Science, Tyskland
mottatt: 24 mars 2008; Godkjent: 08.05.2008; Publisert: 18 juni 2008
Copyright: © 2008 Faca et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av The Canary Foundation. Finansieringen organisasjonen ikke har noen rolle i datainnsamling eller analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er en av de mest aggressive og dødelige epiteliale kreftformer hos kvinner [1]. Det er fire store histologiske typer ovarialcancer: serøs, endometrioid, klare celle, og mucinous, som varierer i både deres kliniske atferd og molekylære egenskaper. Den serøs subtype er den vanligste diagnosen og er ansvarlig for de fleste eggstokkreft dødsfall [1]. Foreløpig er det ingen nøyaktig non-invasiv diagnostisk test for eggstokkreft; de fleste pasienter er diagnostisert på et avansert stadium [2], presenterer med metastaser og invasjon av bukhulen og ascites [3]. Derfor er identifiseringen av proteiner som er rikelig og overveiende uttrykt i eggstokkreft presenterer en verdifull oppgave, og kan gi tidlig ledetråder til tilstedeværelsen av eggstokkreft, og /eller indikasjoner på molekyl subtype som kan bidra til å styre behandlingen.
identifisering av repertoaret av proteiner som spaltes fra celleoverflaten og av proteiner som ellers slippes ut i det ekstracellulære rom kan bidra til forståelsen av tumor oppførsel, til identifisering av potensielle diagnostiske markører detekterbare i sirkulasjon og av potensial avbildning og terapeutiske mål som forblir vises på celleoverflaten. I løpet av metastasering av eggstokkreft, produksjon av matrisenedbrytende proteinaser av tumorceller bidrar til ødeleggelse av celleinteraksjoner gjennom en mekanisme for å kaste av adhesjonsmolekyler. Disse mekanismene er påvist i eggstokkreft kontekst for Alcam [4] og for epitel cadherin (CDH1) [5].
I dybden, gir kvantitative proteomikk denne avgrensning av proteiner uttrykt i tumorceller og i sub- cellulære [6]. Flere studier har proteomic analysert ovarial tumor tissue [7], [8], cellelinjer [9] – [11], ascitesvæske [12] og blod fra pasienter med ovarialcancer [13], [14]. Det er imidlertid fortsatt et behov for å systematisk karakterisere og sammenligne sett av proteiner der plasseringen gjør dem spesielt relevant for diagnose og behandling, særlig proteiner på celleoverflaten eller de slippes inn i det ekstra-cellulære miljø, og for å bestemme mekanismen og dynamikk protein utgivelsen i det ekstracellulære rom.
Vi preget tre eggstokkene adenokarsinom cellelinjer, OVCAR3, CaOV3 og ES2, samt eggstokkreft celler beriket fra ascitesvæske med en grundig proteomikk analyse av helcellelysater, den celleoverflaten proteomet og proteiner slippes ut i ekstra cellulære rommet. Detaljert undersøkelse av dataene viser flere interessante biologiske fenomener, inkludert omfattende avgivelse av ekstra-cellulære domener for proteiner uttrykt på celleoverflaten og høye sekresjon forekomst av et subsett av proteiner. Dataene omfatter også en rekke proteinmarkører som er kjent for å være assosiert med kreft i eggstokkene. Den resulterende offentlige datasett er en ressurs for oppdagelse av diagnostiske og terapeutiske mål og en rik kilde til informasjon om fordelingen av proteiner mellom cellens indre, celleoverflaten og det ekstracellulære rom.
Metoder
kultur og isotopisk merking av eggstokkreft celler
OVCAR3, CaOV3 og ES2-celler ble dyrket i DMEM-medium (Invitrogen) inneholdende 0,1% dialysert føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen) og
13C-lysin i stedet for vanlig lysin, for 7 passasjer (1:2) i henhold til standard SILAC protokollen [15]. Inkorporering av
13C Lys isotop oversteg 90% av det totale protein lysin-innhold. Den samme batch av celler ble brukt for å ekstrahere celleoverflateproteiner og for analyse av kondisjonert medium og hele celle-lysat-proteiner. De utskilte proteiner ble oppnådd direkte fra cellekondisjonerte media etter 48 timer i kultur. Celler og debris ble fjernet ved sentrifugering ved 5000 x g og filtrering gjennom et 0,22 um filter. Totale ekstrakter av celler ble oppnådd ved sonikering av ~ 2 x 10
7-celler i 1 ml PBS inneholdende detergent octyl-glukosid (OG) (1% w /v) og proteasehemmere (fullstendig protease inhibitor cocktail, Roche Diagnostics , Tyskland) etterfulgt av sentrifugering ved 20.000 x g.
Tumorceller celler~~POS=HEADCOMP ble oppnådd fra 2,2 l av ascitesvæske fra en pasient med adenokarsinom ovarial serøs. Ascites prøver ble samlet under en IRB godkjent protokoll. Etter sentrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter, ble pelleten av celler ble vasket 3 ganger med PBS, etterfulgt av sentrifugering ved 2000 rpm i 10 min. En gradient av Percoll (30 til 60%) ble anvendt for å berike preparatet i celler avledet fra tumorer og eliminere forurensnings mononukleære blodceller. Tumorceller består ~80% av levedyktige celler i den resulterende prøve, som evaluert ved mikroskopisk inspeksjon. Den ascites cellekondisjonert medium ble oppnådd etter 24 timer av kulturen i 0,1% bovint serumalbumin (BSA), uten tilsetning av føtalt bovint serum (FBS). Celler og rusk ble fjernet ved sentrifugering ved 5000 × g og filtrering gjennom et 0,22 mikrometer filter.
Ta av celleoverflateproteiner
For å isolere celleoverflateproteiner fra de tre heft eggstokkreft cellelinjer, ~ 2 x 10
8 celler ble biotinylert i kulturplaten etter omfattende PBS skylling med 10 ml av 0,25 mg /ml Sulfo-NHS-SS-biotin i PBS ved romtemperatur (23-24 ° C) i 10 min. Den gjenværende biotinylering reagens ble stanset med 10 mM lysin. Beriket tumorceller fra ascites ble vasket tre ganger i PBS og ble biotinylert i suspensjonen (2,5 x 10
8cells /ml) med 0.48mg /ml Sulfo-NHS-SS-biotin i PBS i 30 minutter ved romtemperatur (23- 24 ° C). Den gjenværende biotinylering reagens ble stanset med 10 mM lysin i både cellelinje og ascites forberedelse. Protein ekstraksjon ble gjennomført i en oppløsning som inneholdt NP-40 detergent 2% (v /v) med celleoppbrytning ved sonikering, etterfulgt av sentrifugering ved 20.000 x g. Biotinylerte proteiner ble kromatografisk isolert ved affinitets-kromatografi ved anvendelse av 1 ml av UltraLink immobilisert Neutravidin (Pierce) i henhold til produsentens instruksjon. Proteiner bundet til kolonnen ble gjenvunnet ved reduksjon av biotinylering reagens med 5 ml av en oppløsning inneholdende 65 umol av DTT og 1% octyl-glukosid (OG) vaskemiddel i 1 time ved 37 ° C. Eluerte proteiner ble deretter alkylert med 200 pmol av jodacetamid ved romtemperatur.
Fraksjonering av celleekstrakter
Celleoverflate, ble kondisjonert medium og totalt ekstrakt fraksjonert ved reversfase-kromatografi ved bruk av henholdsvis 500 ug 1 mg og 1 mg totalt protein. Alle celleekstrakter ble redusert og alkylert med iodacetamid før kromatografi. Separasjon ble utført på en POROS R1 /10-kolonne (Applied Biosystems-4,6 x 50 mm) ved 2,7 ml /min ved anvendelse av en lineær gradient av 10 til 80% av organisk løsningsmiddel i løpet av 30 minutter løp. Oppløsningsmiddelsystem som ble benyttet var: vandig oppløsningsmiddel-5% acentonitrile /95% vann /0,1% trifluoreddiksyre; organisk oppløsningsmiddel-75% acetonitril /15% isopropanol /10% vann /0,095% trifluoreddiksyre. Fraksjoner ble samlet med en hastighet på 3 fraksjoner /minutt.
Protein identifikasjon ved LC-MS /MS
Protein fordøyelse og identifisering av LC-MS /MS ble utført som beskrevet tidligere [16] . Kort beskrevet ble hver av reversert-fasefraksjonene individuelt spaltet in-løsning fordøyelsen med trypsin (400 ng /fraksjon), og gruppert i 15 til 21 bassenger for hver cellelinje og hvert kammer (dvs. celleoverflaten, kondisjonert medium, og løselige hele cellelysat), basert på kromatografiske egenskaper. Pools ble individuelt analysert med LC-MS /MS i en LTQ-ORBITRAP massespektrometer (Thermo-Finnigan) koblet til en nanoflow kromatografi system (Eksigent) med en 25 cm kolonne (Picofrit 75 mikrometer ID, nye mål, pakket i huset med MagicC18 harpiks) over en 90 minutters lineær gradient. Innsamlede dataene ble automatisk behandlet av Computational Proteomics Analysis System-CPAS [17]. Tandem-massespektra ble søkt mot versjon 3,13 av den menneskelige IPI databasen. Et fast modifikasjon av 6.020129 masseenhetene ble lagt til lysinresidier for database søker å ta hensyn til inkorporering av den tunge lysin isotopen. For å estimere betydningen av peptid og protein kampene, søkte vi verktøyene PeptideProphet [18] og ProteinProphet [19]. Identifikasjoner med PeptideProphet sannsynlighet større enn 0,75 ble valgt ut og sendt til ProteinProphet. Sistnevnte trekker slutninger et minimalt sett med proteiner som forklarer peptidet bevis, tildele en sannsynlighet til hvert protein basert på den samlede peptid sannsynligheter. De avledede protein identifikasjoner ble filtrert ved en 1% feilrate basert på sannsynligheten for at den beste kampen innhentet ville falle i fordelingen av tilfeldige database kampene [20]. Den spektrale tellemetoden [21] ble brukt til å beregne protein anrikning for hvert kammer. Det totale antall spektrale teller for hvert protein gruppe utgang av ProteinProphet ble anvendt for semikvantitativ analyse. Hvert datasett ble normalisert med det totale antall tellinger i hele eksperimentet. Den anrikningsfaktor ble beregnet etter følgende formel: [(C
xp /Nf) 1] /(C
te p + 1), hvor C
x representerer tellinger av hvert protein (p) i sub-proteome (sekresjon eller celleoverflate); Nf er normaliseringsfaktoren (presentert i toppen av tabell S1); C
te er tellingene for det samme protein (p) observert i totalt ekstrakt av den respektive celle. Tilsetningen av en til de tellinger ble beregnet å ta hensyn til de proteiner som ingen observasjon ble gjort i en av de sub-proteom og representerer den minste anrikningsfaktor for det aktuelle protein.
Resultatene
proteomikk Analyse av eggstokkreft celler
en omfattende proteomikk profil av OVCAR3, CaOV3 og ES2 cellelinjer, og eggstokkreft celler fra ascites av en pasient med serøs eggstokkreft ble utført. Den generelle eksperimentelle arbeidsflyten besto av intakt protein fraksjonering etterfulgt av massespektrometrisk datainnsamling ved LC-MS /MS og dataanalyse, slik som beskrevet i figur 1. Totalt, utførte vi 215 LC-MS /MS løper, noe som tilsvarer mer enn to millioner MS skanninger.
Totale cellelysater.
A reversert-fase kromatogram som representerer fraksjonering av intakte proteiner i hele cellelysatet av ES2 celler er presentert i figur 2. Samlet analysen ga noen 3000 høy tillit protein identifikasjon for hver celle populasjon analysert (figur 3). Antallet av protein identifikasjoner fra totalcelleekstrakter felles mellom de tre cellelinjene var 1179, og varierte 2011-2267 for to cellelinjer (figur 3a). I gjennomsnitt ble 655 proteiner entydig identifisert i en cellelinje. I tillegg til biologisk heterogenitet, kan en del av variasjonen i identifiserte proteiner mellom cellelinjer som tilskrives massespektrometrisk undersampling av lav overflod proteiner.
Kromatogrammet viser profilen til fraksjonering av 1 mg av hele cellelysatet. Vi har samlet 18 fraksjoner av denne prøven for ytterligere protein identifikasjon av LC-MS /MS. Den decomplexing av prøver før LC-MS /MS analyse av intakt protein fraksjone forbedrer identifisering av lav overflod proteiner [16]. Boksene under kromatografiske profilen angitte fraksjoner analysert. Den faste mørk linje indikerer gradient brukes i separasjon.
Venn-diagrammer viser overlapp mellom proteiner identifisert i forskjellige cellepopulasjoner analysert. A. Identifikasjons fra helcellelysater av de tre cellelinjene som ble analysert. B. Proteiner identifisert i de tre under proteom (helcelle lysat, klimaanlegg medier og celleoverflaten). C. Proteiner identifisert i tumorceller beriket fra ascites stiller ut 80% samstemmighet med proteiner som er identifisert i de tre eggstokkreft cellelinjer. D. antall proteiner som er identifisert i hvert datasett. Tabell S1 viser proteiner identifisert i denne studien.
Cell overflateproteiner.
Vi er avhengige av en merking strategi med lipid ugjennomtrengelig biotin til å merke og ta proteiner eksponert på celleoverflaten av OVACAR3, CaOV3, ES2 cellelinjer og ascites-avledet tumorceller (figur 1). Fra omtrent 2 x 10
8 celler, erholdt vi noen 500 pg av biotinylerte proteiner, som representerer ~1-2% av det totale celleproteinmasse. Listen av protein identifikasjoner er presentert i tabell S1.
Proteiner som slippes ut i mediet.
Cellelinjer ble dyrket i dyrkingsmedier som inneholder tunge isotoper av lysin. Isotop merking av proteiner var ment å diskriminere mellom proteiner frigjøres fra celler i vekst og proteiner iboende til supplert media. Etter 48 timer av kulturen, er konsentrasjonen av proteiner øket fra 100 ug /ml til 225 ug /ml i det kondisjonerte medium av OVCAR3 celler. På grunn ~15% av forventet humane tryptiske peptider med mer enn 6 aminosyrer som er identiske mellom humane proteiner og deres motstykker storfe, isotopisk merking av celleproteiner ga et middel for å skille mellom humane proteiner utskilt av dyrkede celler fra bovine proteiner tilstede i mediet. For ascites avledede celler, ble mediet samlet opp etter 24 timer i kultur i nærvær av 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Omtrent 1 mg av proteiner fra det kondisjonerte medium fra cellelinjer og kreftceller fra ascites ble fraksjonert ved bruk av den samme reversfase-kromatografi-metoden som anvendes for helcellelysater, og individuelle fraksjoner ble analysert ved LC-MS /MS. For dyrkede cellelinjer, proteiner som ble identifisert utelukkende av peptider uten merkede lysinrester og som var identiske i sekvens mellom human og bovin, ble tilskrevet kulturmedium og ble ikke inkludert i listen av proteiner frigjøres fra cellene.
den proteomikk profilen til eggstokkreft celler føre til identifisering av 6,462 proteiner (Figur 3D). Vi brukte strenge kriterier for protein identifikasjoner, vurderer bare gyldige disse proteinene med minimum ProteinProphet sannsynlighet terskel på 0,9. For denne grensen, er estimert falsk identifikasjon hastighet mindre enn 1%. Dette datasettet representerer den mest detaljerte og omfattende proteomikk studie av cellepopulasjoner for eggstokkreft. Dybden av analyse og dekning oppnås på proteinnivået i denne studien tilsvarer dybden av analyse for å avdekke uttrykte gener på RNA-nivå.
Protein fordeling mellom det intracellulære, celleoverflate og ekstracellulære kamrene
En sammenlignende analyse av proteiner i forskjellige kamre tillater vurdering av graden av anrikning av proteiner på celleoverflaten og i det ekstracellulære rommet. Vi er avhengige av spektrale tellemetoden [21] for å beregne protein berikelse for hvert rom. Etter normalisering til det totale antall tellinger spektrale, proteiner med større antall tellinger i et kammer (celleoverflate eller kondisjonert medium) i forhold til de totale cellelysatene ble vurdert anriket ved at rommet (figur 3). De tilsvarende berikelse faktorer observert for alle proteiner er identifisert er presentert i tabell S1.
Proteiner tilskrives de tre cellulære avdelinger ble analysert med oppfinnsomhet Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com), og med algoritmer for prediksjon av transmembran-alfa-helix-domener (TMHMM) [22], og for tilstedeværelse av signalpeptider (SignalP) [23] (figur 4A). Denne analysen viste betydelig samsvar mellom demonstrert plassering basert på vår proteomikk profil og spådommer fra databasen analyse. Dette konkordans var spesielt tydelig for de beste 10% anriket proteiner når kontrast med de 10% minst beriket proteiner (Figur 4B og 4C), støtter strategien benyttes for å analysere spesifikke avdelinger. Den betydelige antall proteiner kommenterte som kjernefysisk eller cytoplasma og nåtid blant identifikasjoner i begge de betingede media og celleoverflateunder proteom er bemerkelsesverdig. Til en viss grad, kan forekomsten av disse overveiende intracellulære proteiner være på grunn av cellelyse siden rundt 1% av cellene i kultur ble anslått til å være døde på grunnlag av trypan blå farging. Det er imidlertid tidligere bevis for forekomsten av cytoplasmiske proteiner bundet til det ekstracellulære membranen, spesielt i kreft [24], [25].
A. Den cellulære lokalisering klassifisering brukt en kombinasjon av merknader fra Oppfinnsomhet Pathway Analysis programvare og beregningsorientert prediksjon av trans alfa-helix (TMHMM) og signalpeptider (SignalP). B. og C. Sammenligning av de beste 10% anriket proteiner i kondisjonert medium eller celleoverflaten (henholdsvis B og C,) med minst beriket 10% demonstrere sterk samstemmighet mellom spådd cellular plassering og den spesifikke under proteomet analysert.
Proteiner utskilt av cellene er forventet å diffundere gjennom vev og angi sirkulasjon. Derfor, i motsetning til intracellulære proteiner, kan det utskilte proteiner være mer sannsynlig påvises i plasma. Vi sammenlignet eggstokkene celle protein profiler etter rommet med proteiner som er oppført i Human Plasma Peptide Atlas [26]. Av totalt 6,462 proteiner identifisert i denne studien, 2341 (36%) skjedde i Human Plasma Peptide Atlas (tabell S1). De 100-proteiner som ble anriket i kondisjonert media for hver av de cellepopulasjoner som ble analysert var mer høyt representert i Peptide Atlas (65 til 78%) i forhold til den totale 36% representasjon. Disse resultatene tyder på at utskilte proteiner er mer rikelig i plasma som ikke-utskilte proteiner.
Likheter mellom cellelinjer og ascites tumorceller
De tre cellelinjer i denne studien representerer godt karakterisert
in vitro
modeller for eggstokkreft. OVCAR3 og CaOV3 er avledet fra humant ovarie serøs adenokarsinom [27], [28] og ES2 er avledet fra klar karsinom [29]. Forskjeller i histologi er Parallelt med forskjeller i proteinprofiler, noe som reflekteres i clustering analyse ved hjelp av de spektrale teller som tiltak av protein overflod (figur S1). Det er tydelig fra observasjoner om at de utskilte og overflaten under proteom av ES2 er vesentlig forskjellige fra de av de to andre cellelinjene som ble analysert.
tumorceller anriket fra ascites vi analysert ble avledet fra en pasient med serøs ovarial adenokarsinom. Åtti prosent av proteinene identifisert i ascites tumorceller ble også identifisert i ett eller flere av de cellelinjer (figur 3C). Som antydet i fig S1, mønstre for pasientens tumorceller isolert fra ascites har større likhet med CaOV3 og OVCAR3 enn med ES2.
En annen måte å ta hensyn til likheter kan stole på observasjon av proteiner som allerede er kjent for å være forbundet med sykdommen. Flere kallikreins tidligere er blitt assosiert med serøs eggstokkene adenokarsinom [30]. KLK6, KLK7 og KLK 9 var rikelig i kondisjonert medium fra ascites avledet tumorceller, OVCAR3 og CaOV3, men ikke i ES2 celle betinget media (tabell S2). Disse observasjonene tyder på nytt større likheter mellom den serøs adeonocarcinoma cellelinjer OVCAR3 og CaOV3 og tumor avledet celler samt forskjellene i forhold til fjerne celle avledet ES2 cellelinje.
Det ble ikke observert noen forskjeller mellom ascites avledet celler og cellelinjer. Noen proteiner ble kun påvist og anriket på overflaten eller i dyrkningsmedier av ascites-avledet tumorceller. Disse inkluderer proteiner slik som ABP1 (amilorid-sensitiv aminoksidase) og MMP7 (og matrise mettaloprotease 7), transkripsjonene for som er spesielt rik på forskjellige sub-typer av ovarial kreft, og andre som kodes for av mRNA med høye ekspresjonsnivåer i spesifikke histologiske typer kreft i eggstokkene (tabell S3). Av notatet er det faktum at flere av proteiner beriket utelukkende i tumorceller fra ascites har svært lav vev uttrykk i normal eggstokk [31] (tabell S3). Disse proteinene er muligens avledet fra leukocytter og mesothelial celler som ville vært co-renset fra ascitesvæske.
Shedding av overflatemembranproteiner i den ekstra-cellulære rommet
Til støtte for vår eksperimentelle og analytisk metode, har vi funnet at en vesentlig andel av proteiner kommentert som membranproteiner ble identifisert i kulturmedium, som representerer mer enn 25% av alle identifiserte proteiner som for eksempel i OVCAR3 og ascites-avledet tumorceller (figur 4a). Flere av disse proteiner ble betydelig anriket både på celleoverflaten og i dyrkningsmediet (tabell S4). Analyse av peptider identifisert indikerte at for det meste er disse peptidene ble avledet fra ekstracellulære domener av celleoverflateproteiner som vist i figur 5A, noe som tyder ectodomain avgivelse.
A. Identifisering av peptider som spenner ekstracellulære domener av trans proteiner påvist i de betingede media, i samsvar med en Shedding prosessen. CDH1 (epitelial cadherin) illustrerer også denne fremgangsmåte, ettersom peptider som strekker seg over bare det ekstracellulære domene blir fulgt i kondisjonert medium mens peptider som strekker seg over både intracellulære og ekstracellulære regioner ble detektert på overflaten av Ovcar3 og ascitesceller. Røde spor tyder ekstracellulære domener og blå spor tyder intracellulære domener. Transmembrane regionene er angitt i den gule boksene. Mørke boksene indikerer peptider identifisert. B. Western blotting av CDH1 ved hjelp av et spesifikt antistoff mot det intracellulære domenet (mus anti-E-cadherin klon 36, # 610181, BD Biosciences) viser spaltning av full lengde CDH1. Det var ingen peptider som stammer fra det intracellulære domenet i kondisjonert media.
epithelial cadherin (CDH1) illustrerer tydelig Shedding prosessen, siden sekvens dekning av ekstracellulære domenet er dominerende i det utskilte fraksjonen, mens peptid dekning som strekker seg over både intra og ekstra cellulære domener ble observert for proteinet isolert fra celleoverflaten fraksjonen. Vi sammenlignet massespektrometri basert funn med western blot-analyse av ovarie cellelinje og ascites-avledet tumorceller. Intakte former CDH1 ble observert i helcellelysater, sammen med lavere molekyl fragmenter inneholdende det intracellulære domenet. Men i ascitesceller det er en overvekt av lavmolekylære fragmenter inneholdende bare det intracellulære domenet både totalt celleekstrakt og celleoverflaten, noe som indikerer at avgivelse prosessen er mer omfattende i tumorceller enn i cellelinjer. Former for CDH1 inneholder det intracellulære domenet ble ikke oppdaget i det kondisjonerte medium av disse cellene (figur 5b). Prosessen med Shedding av CDH1 har nylig blitt beskrevet for eggstokkreft celler [5], til støtte for våre massespektrometri baserte undersøkelser. Av notatet er observasjonen i vår studie av ekstra proteiner fra cadherin familie av adhesjonsmolekyler i kondisjonert medium, for eksempel nevrale cadherin (CDH2), calsyntenin-en (CLSTN1), alcadein beta (CLSTN3), desmoglein-en (DSG1) og desmoglein-2 (DSG2). Basert på oppfinnsomhet Pathway Analysis annotering, er de fleste av disse membranproteiner som er identifisert anriket i det kondisjonerte media relatert til prosesser for celleadhesjon og cellebevegelse (tabell S4). Prosessen med spaltning og avgivelse ikke er ensartet for alle proteiner som vi har observert et signifikant antall proteiner anriket på celleoverflaten fraksjonen som ikke oppdages i cellekulturmediet (tabell S4).
proteinsekresjon priser
Analysere proteiner sluppet inn i mediet av dyrkede celler er en attraktiv strategi for å identifisere potensielle sirkulerende markører. Potensialet for gjenkjenning av økte nivåer av et protein i omløp er avhengig delvis av den hastighet med hvilken proteinet blir frigjort inn i det ekstracellulære rom og til slutt blodrommet ved tumoren i forhold til andre vev. I listen over proteiner mest beriket i kultur media i forhold til helcellelysater var to vev metallprotease hemmere (TIMP en og TIMP2) (Tabell S2). Disse proteinene har direkte diagnostikk potensielle i eggstokkreft [32].
Vi vurderte berikelse faktor for TIMP1 av Western blot analyse (figur 6a). TIMP1 skjedde hovedsakelig i utskilt avdeling av alle cellelinjer, i samsvar med forutsigelser basert på spektral telling. Vi utførte også en tidsforløpet måling av TIMP1 og TIMP2 konsentrasjon i det kondisjonerte medium for å estimere sekresjon frekvensen av disse proteiner for alle tre cellelinjer (figur 6b). TIMP1 ble vist å ha en lav hastighet i sekret OVCAR3 celler i forhold til andre cellelinjer, som er i overensstemmelse med våre Western blot-analyse. Vi beregnet sekresjon priser av TIMP1 og TIMP2 å være i størrelsesorden nanogram protein per million celler per time. Basert på en sekresjon hastighet på 3 ng TIMP1 per million celler per time, og uten å ta hensyn til nedbrytningshastigheten og klaringen i serum, vil det ta omkring 10
8-10
9 tumorceller og flere dagers utgang for å endre nivåene av TIMP1 som forekommer i normalt humant serum, som er 87-524 ng /ml.
A. Western blot viser tilstedeværelsen av TIMP1 bare i det kondisjonerte medium for alle de 4 eggstokkreft celler. OVCAR3 uttrykte betydelig mindre TIMP1 i forhold til de andre celler. Samme mengde protein (5 ug) ble fylt i hver kolonne av gelen for denne analysen. std tilsvarer rekombinant TIMP1 anvendt som en standard kontroll; TE tilsvarer hele cellelysat; SE til kondisjonert medium; og SU til celleoverflateproteiner. B. utskillelsen måling av TIMP1 og TIMP2 brukes kommersielt ELISA-sett (R & D-systemer). Kondisjonerte medier ble fortynnet 1:15 og 1:60 for analyse av TIMP1 og TIMP2, respektivt. Sekretet Hastigheten ble estimert basert på skråningen av kurven ved lineære tidspunkter.
Diskusjoner
Vi presenterer her en grundig proteomikk analyse av eggstokkreft cellelinjer og eggstokkreft tumorceller, deriblant separate analyser av celleoverflate og utskilte proteiner. Studien var basert på intakte proteinfraksjonering, fulgt av trypsin og LC-MS /MS [16], [33], som tillater sensitiv påvisning av lav overflod proteiner. Til sammen har vi generert en omfattende profil av proteiner som består av mer enn 6500 unike identifikasjoner med en feilrate mindre enn 1%. En fersk studie av ascitesvæske som består av proteiner fra blandede bestander av celler [12] identifisert 2,737 proteiner. 2307 (84%) av proteinene som er rapportert i denne studien var omfattet blant proteiner identifisert i vår undersøkelse.
Bruken av spektral-teller som et mål på overflod kombinert med sammenlikning av proteiner som finnes i celleoverflaten eller ekstracellulære kamre og i helcelle lysat-profiler, tillot identifisering av proteiner anriket i spesielle kammere. Peptide telling gir overflod estimater som korrelerer rimelig godt med de som ble bestemt av andre metoder [34]. I vår studie har vi også observert en god korrelasjon mellom estimater av overflod av vev hemmer av metalloproteinase 1 (TIMP1) og epitel cadherin (CDH1) basert på spektral telling og vurdering basert på Western blot analyse. Isotop merking med SILAC [15] også et effektivt middel for å skille proteiner i kondisjonert medium som er gitt ut fra dyrkede celler fra proteiner bidratt med bovint i kulturmediet.
Våre analyser har gitt innsikt i bidrag overflateprotein Shedding og slipp til protein sammensetningen av den ekstra-cellulære rommet. Proteiner høyanriket i kulturmedier utgjør en potensiell kilde for sirkulerende markører for ovarian cancer. Transkripter som korresponderer til noen av disse proteiner (f.eks KLK6, 7 og 9) er forholdsvis rik på ovarietumorer forhold til de fleste normale vev [35]. Det er allerede bevis for opptreden av de fleste av disse proteiner i normalt humant plasma. Av de 60 proteinene som er oppført i Tabell S2, 48 (80%) var tilstede i Human Plasma Peptide Atlas [26].
