Abstract
Innledning
I denne artikkelen rapporterer vi 7 nye KRAS genmutasjoner oppdaget mens retrospektivt studere utbredelsen og mønster av KRAS-mutasjoner i kreftvev innhentet fra 56 Saudi sporadiske pasienter med kolorektal kreft fra den østlige provinsen.
Metoder
Genomisk DNA ble ekstrahert fra formalinfiksert, parafininnstøpte kreft og noncancerous kolorektal vev. Vellykket og spesifikke PCR-produktene ble deretter toveis sekvensert for å påvise exon 4 mutasjoner mens Mutector II Detection Kit ble anvendt for å identifisere mutasjoner i kodon 12, 13 og 61. Den funksjonelle virkningen av de nye mutasjoner ble vurdert ved hjelp bioinformatikk og molekylmodellering.
Resultater
KRAS-mutasjoner ble oppdaget i kreftvev av 24 tilfeller (42.85%). Av disse 11 var ekson 4 mutasjoner (19,64%). De næret 8 forskjellige mutasjoner som alle unntatt to forandret KRAS proteinet aminosyresekvensen og alle unntatt en roman var som vist ved kosmiske database. De påviste nye mutasjoner ble funnet å være somatiske. En mutasjon er spådd å være godartet. De resterende mutasjoner er spådd å føre til betydelige endringer i proteinstrukturen. Av disse er det Q150X tull mutasjon den andre avkorting mutasjon som skal rapporteres i tykktarmskreft i litteraturen.
Konklusjoner
Vår oppdagelse av nye exon 4 KRAS-mutasjoner som er, så langt, unikt til Saudi pasienter med kolorektal kreft kan skyldes miljøfaktorer og /eller rasemessige /etniske variasjoner på grunn av genetiske forskjeller. Alternativt kan det være relatert til mangelen på kliniske studier på andre enn de i kodon 12, 13, 61 og 146. Ytterligere KRAS testing på et stort antall pasienter av ulike etnisiteter, særlig utover de vanligste hotspot alleler i eksoner 2 og mutasjoner 3 er nødvendig for å kartlegge omfanget og utforske den eksakte prognostisk og prediktiv betydning av de påviste nye mutasjoner samt deres mulige rolle i kolorektal kreft
Citation. Naser WM, Shawarby MA, Al-Tamimi DM, Seth A, Al-Quorain A, Nemer AMA, et al. (2014) Nye KRAS genmutasjoner i Sporadisk tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (11): e113350. doi: 10,1371 /journal.pone.0113350
Redaktør: Klaus Brusgaard, Odense Universitetssykehus, Danmark
mottatt: 12 juni 2014; Godkjent: 22 oktober 2014; Publisert: 20.11.2014
Copyright: © 2014 Naser et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra forskning på «K-ras, p53, EGFR og HER2 gen avvik i kolorektal kreft» fra deanship av Scientific Research, Universitetet i Dammam, Saudi-Arabia (tilskudd # 2011003). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne hevder at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utvikling av kreft (carcinogenese) er en flertrinns prosess som antas å resultere fra akkumulering av genetiske endringer i en enkelt celle i løpet av livet til et individ. Antallet gener funnet å være assosiert med ulike kreftformer er i sterk vekst. De hyppigst aktivert gener er medlemmer av RAS genfamilien, hvorav to (Harvey- H) og (Kirsten-K) ble først identifisert som å være homolog til virale transformerende gener, mens den tredje (NRAS) ble identifisert i en human neuroblastom . RAS-genproduktet er en monomer membran-lokaliserte G-protein av 21 kD som fungerer som en molekylær bryter bindings reseptor og ikke-reseptor-tyrosin-kinase-aktivering til nedstrøms cytoplasmiske eller kjernefysiske hendelser. Hver pattedyrcelle inneholder minst tre distinkte RAS proto-onkogener som koder for nært beslektede, men distinkte proteiner. RAS gener kan aktiveres ved hjelp av forskjellige punktmutasjoner inkludert de som påvirker kodon 12, 13, 61 eller 113-117. Signaltransduksjon av ras-proteiner innbefatter hydrolyse av GTP, og aktiverende mutasjoner inhiberer denne prosessen, låsing proteinet i «på» aliserte konformasjon [1]. Aktiverende mutasjoner i disse ras-proteiner resulterer i konstitutiv signalisering, for derved å stimulere celleproliferasjon, og inhibering av apoptose.
onkogene KRAS mutasjoner er utbredt i praktisk talt alle krefttyper, noe som gjør KRAS en av de hyppigst muterte gener i humane cancere [ ,,,0],2]. Ras-onkogener, sammen med p53 tumor-suppressor-gen, er genene mest konsekvent funnet som skal muteres i kolorektal cancer [3] – [4] hvor epitelceller i colorectum fremgang fra små adenom gjennom store adenom, og til slutt bli adenokarsinom [3].
Tallrike studier har rapportert hyppigheten av KRAS genmutasjoner i tykk- og endetarmskreft. Den største serien var «RASCAL» studie av 2721 kolorektal kreft tilfeller en forekomst på 37,7% [5]. Sammenlign frekvensene ble rapportert senere [6] – [8]
Formålet med denne artikkelen er å rapportere syv nye KRAS-mutasjoner og åpne døren for ytterligere KRAS testing på et stort antall pasienter for å vurdere. prevalens og utforske den eksakte prognostisk og prediktiv betydning av de påviste mutasjoner samt deres mulige rolle i kolorektal kreftutvikling. De nye mutasjoner ble oppdaget mens retrospektivt studere utbredelsen og mønster av KRAS-mutasjoner i kreftvev innhentet fra 56 Saudi sporadiske pasienter med kolorektal kreft fra den østlige provinsen, og samkjøre disse med kliniske funksjoner, og p53, EGFR (epidermal vekstfaktor) og HER2 ( human epidermal vekstfaktor receptor2) proteinekspresjon, og EGFR-gen-mutasjonsstatus. Det var ikke vår hensikt å utforske alle mulige KRAS mutasjoner som kan finnes i kolorektal kreft, så vi bare målrettet mutasjonene som ofte er involvert i denne sykdommen. Oppdagelsen av nye mutasjoner kom bare ved en tilfeldighet mens du utfører studien. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien på mønsteret av KRAS genmutasjoner i Saudi pasienter med kolorektal kreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Undersøkelsen ble godkjent av den faste komité for forskningsetikk på levende dyr (SCRELC) som er IRB av vår institusjon (godkjenningsnummer: IRB-2014-01-324). Det var ikke mulig å innhente skriftlig informert samtykke fra deltakerne som de fleste av pasientene ble ikke fulgt opp. Dette problemet ble diskutert med utvalget som enige om at, i tråd med «Retningslinjer for forskningsetisk praksis» [9], samtykke er ikke nødvendig i en slik retrospektiv studie som informasjonen benyttes av forfatterne allerede var tilgjengelig for publikum og gjorde ikke avsløre pasientens identitet. Videre undersøkelse ingen risiko for deltakerne.
Femti-seks sporadiske kolorektale karsinom tilfeller av Saudi pasienter ble hentet fra arkivene til Patologi Department of King Fahd Hospital ved Universitetet. Sakene ble tilfeldig valgt basert på tilgjengeligheten av kliniske data og vevsblokker representant parafin tilstrekkelige til å utføre de nødvendige prosedyrer, samt negativ familiehistorie for tykktarmskreft. Tidsrammen dekket var 11 år (1998-2008).
Klinisk og patologiske data
Klinisk og patologiske data, inkludert histologisk type, grad og stadium av kreft ble samlet inn fra pasientenes poster . Kliniske og patologiske data ble klassifisert ved bruk av WHO kriterier [10].
Immunhistokjemisk farging
Immunhistokjemisk farging ble utført for EGFR, HER2 og p53 på 4 mikrometer tykke parafinsnitt kuttet fra blokker av kolorektal carcinomatous vev. Fargingen ble utført i en Ventana Benchmark automatisert immunostainer i henhold til produsentens instruksjoner (Ventana Medical Systems Inc., Strasbourg). Kilder og fortynninger av de primære antistoffene som anvendes i undersøkelsen er vist i tabell S1. De immun Seksjonene ble undersøkt under et lysmikroskop, og evaluert manuelt av to patologer. Bestemt membran og /eller cytoplasmatisk farge var nødvendig for å vurdere en sak som EGFR eller HER2 /neu positiv, mens nukleær farging av minst 10% av de kreftceller som var nødvendig for p53 positivitet (figur S1).
Genomisk DNA-ekstraksjon
Fem til åtte 10 mikrometer tykk formalinfiksert, ble parafininnstøpte kreft vevssnitt brukes til å trekke genomisk DNA. Snittene ble deparaffinized to ganger i 5 minutter i xylen, sekvensielt rehydratiserte på 100, 96 og 70% etanol i 30 sekunder hver, farget med hematoksylin i 30 sekunder, renset med vann og inkubert over natten i 1 M NaSCN ved 37 ° C for å fjerne kryss koblinger. Platene ble skylt to ganger i 10 minutter i 1 x PBS ved romtemperatur, og helt lufttørket. Som indikert av en erfaren patolog, ble kreftvev skrapt fra glassglideflate med en skalpell for å oppnå minst 70% tumorceller, og deretter overført til 2,0 ml mikro-sentrifugerør. Genomisk DNA ble så ekstrahert med smørefritt DNA Kit (TrimGen, Maryland) implementerer standard protokollen beskrevet av produsenten med inkubering over natten i trinn 14 av protokollen. Hentet genomisk DNA ble kvantifisert med Epok spektrofotometer og analysert med 0,8% agarosegel-elektroforese til å visualisere DNA størrelsesfordeling.
For de pasientene som viste roman KRAS ekson 4 mutasjoner, vi også hentet genomisk DNA fra noncancerous kolorektal vev som beskrevet over. Den noncancerous vev ble hentet fra en svulst gratis reseksjon margin fra colectomy eksemplar av samme pasient.
PCR oppformering av KRAS ekson
Sekvense 4 ble brukt til å påvise KRAS exon 4 mutasjoner som byggesett for påvisning av A146T – som er exon 4 mutasjonen rapportert å være vanlige involvert i kolorektal cancer [11] – [12] – var ikke kommersielt tilgjengelige. En nested PCR-metode lik den som er fastsatt av Fadhil, et al [13] ble benyttet for å amplifisere og utføre smelting analyse for exon 4 av KRAS-genet for å kontrollere for vellykkede PCR-reaksjoner og spesifisitet. Den første PCR-runde ble utført i et sluttvolum på 25 pl. Hver reaksjonsblanding inneholdt 1 x QIAGEN Multiplex PCR masterblanding, 0,5 x Q-løsning, 2 primerpar (tabell 1) som dekker hotspots i KRAS exon 4 med 0,3 uM endelig konsentrasjon for hver primer og 10 ng templat-DNA. PCR ble utført ved anvendelse av ABI Veriti Thermal Cycler (Life Technologies) i 15 minutter ved 95 ° C, 40 sykluser hver på 30 sekunder ved 94 ° C, 90 sekunder ved 55 ° C og 90 sekunder ved 72 ° C, etterfulgt av 10 minutter ved 72 ° C. Etter tilsetning av 2 pl (5 x) lasting fargestoff, 10 mL av hver amplifiserte prøve ble elektroforert på en 2% agarose TBE-etidiumbromid-farget gel og visiualized med GelDoc system fra Biorad.
Høyoppløselig smeltekurve analyse (HRM) ble utført ved anvendelse av nested PCR-reaksjon i et sluttvolum på 15 ul som inneholdt 1 x HRM Master Mix (Qiagen) og en primerpar spesifikt for exon 4 (tabell 1) med hver primer ved 0,7 uM endelig konsentrasjon . Malen besto av 1,5 ul av en 1:100 fortynning av produktet fra den første runden av PCR-reaksjon. Nestet PCR reaksjonen ble utført som beskrevet i bruksanvisningen for HRM Type-it Kit (Qiagen).
HRM brukes til å vurdere dissosiasjon (smelting) karakteristikk av dobbelttrådet DNA (dsDNA). Basepar sammensetning og GC-innhold innflytelse smelting oppførsel av forskjellige dsDNA-fragmenter. Under HRM blir dsDNA utsettes for gradvis økende temperatur, i nærvær av et fluorescerende fargestoff (f.eks EvaGreen). Det fluorescerende fargestoff fluorescerer bare når det er bundet til dsDNA. Fluorescens overvåkes under overgang av dsDNA til enkelt-trådet DNA (ssDNA) som avtar som dsDNA smelter. Plotting endringer i fluorescens etter å generere spesifikke DNA-fragmenter under PCR gi opphav til enkle topper som tilsvarer bestemte amplikonene [14].
DNA-sekvense
Etter HRM, vellykkede og spesifikke PCR-produkter som viser en smeltetopp ble kolonnen renset ved anvendelse av QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. PCR-produktene ble eluert med 30 ul elueringsbuffer og fortynnet 1:10 med vann. Utvannet PCR produktene ble deretter brukt som mal for syklus-sekvensering via Big Dye Terminator v1.1 kit (Applied Biosystems). Toveissekvensering (dvs. forover og bakover) ble utført ved anvendelse syklus sekvenseringsreaksjon (10 ul sluttvolum) bestående av 1 x terminator forblanding, 1 x sekvense buffer, 0,4 pM av enten M13-F eller M13-R-primere (tabell 1) og 4- ul fortynnet mal. Reaksjonene ble kjørt på Veriti (Life Technologies) i henhold til den følgende protokoll: en syklus på 95 ° C i 15 minutter; 30 sykluser av 95 ° C i 10 sekunder, 55 ° C i 5 sekunder, 72 ° C i 4 minutter. Sekvenseringsreaksjoner ble renset med ABI BigDye xTerminator Rensing Kit (Life Technologies) og lastet på en 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies). Sekvense data ble analysert ved hjelp av sekvensering Analyse v5.4 og SeqScape v2.7 programvare (Life Technologies).
skiftet terminerings analyser (STA)
STA er basert på primer-forlengelse metoder der 3 oligonukleotider (to for forsterkning og en for mutasjon deteksjon) blir brukt til å detektere en spesifikk mutasjon. Imidlertid benytter STA inkorporering av flere merkede nukleotider til påvisning primeren sammenlignet med inkorporering av et enkelt merket nukleotid i andre primer-forlengelse-baserte metoder. Deteksjons primer hybridiserer en base før målstedet og deretter forlenges bare når målet er mutert. Forlengelse av deteksjons primer med flere merkede nukleotider forsterker signalet og øker PCR fragment lengde slik mutasjon diskriminering fra villtype via peak farge og fragment størrelse etter kapillær elektroforese [15].
Vi brukte Mutector II Mutation Detection Kits (TrimGen, Maryland) for å identifisere mutasjoner i kodon 12, 13 og 61 av den KRAS-genet, som er de KRAS mutasjoner som er rapportert å være mest involvert i kolorektal cancer [11] – [12], så vel som spesifikke mutasjoner av EGFR-genet i karakteristiske steder i eksoner 18-21, inkludert visse punktmutasjoner, slettinger og innsett som identifiserer pasienter som er mest sannsynlig å svare på målrettet lungekreft behandling, inkludert tyrosinkinasehemmere erlotinib og gefitinib. De Mutector II mutasjonsdeteksjon Kits implementere STA teknologi for samtidig påvisning og differensiering av mutasjoner som skjer på samme målområde. Mutector II Mutation Detection Kit GP05-CM oppdager og skiller alle 12 mutasjoner forekommer i kodon 12 og 13 mens Mutector II Mutation Detection Kit GP06 er designet for 5 mutasjoner forekommer i kodon 61. Mutector II Mutation Detection Kit GP07-02 oppdager mutasjoner i karakteristiske steder i eksoner 18-21 av EGFR-genet. STA teknologi forbedrer sensitiviteten betydelig. Den detekterer så lite som 1% somatiske mutasjoner sammenlignet med 15-20% via Sanger-sekvensering [15]. I korthet, 50 ng gDNA ble PCR-amplifisert ved anvendelse av reagenser levert via PCR-betingelser som er beskrevet av produsenten. PCR-produktene ble renset og mutasjoner i kodon 12, 13, og 61 ble anriket separat ved mutasjonsspesifikk primer-forlengelsesreaksjon. Prøver inneholdende anriket mutasjoner ble renset fra overskytende fluorescerende fargestoffer, fortynnet 5-10 ganger med vann. Tre mikroliter av utvannet primer extension produkter ble blandet med lasting buffer i settet og fragment størrelse via kapillær elektroforese på ABI 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies). Kapillær elektroforese driftsforhold og instrumentoppsett for datainnsamling er forklart i detalj i Mutector II Mutation Kit instruksen.
Funksjonell prediksjon og molekylær modellering av nye KRAS-mutasjoner
Den funksjonelle virkningen av den ikke -synonymous (proteinstruktur endring) ekson 4 mutasjoner ble vurdert ved hjelp POLYPHEN-2 (polymorfisme fenotyping v2) [16] og sile (sortering intolerant fra tolerante verktøy) [17]. Vi har også brukt mutasjonen assessor [18] for å forutsi den funksjonelle effekten av mutasjoner basert på evolusjonære bevaring av det berørte aminosyre i protein homologer. I tillegg ble molekylær modellering anvendt for å forutsi den funksjonelle virkningen av de nye mutasjoner som detekteres. K-ras proteinstruktur som brukes for modellering ble innhentet fra Protein Data Bank (PDB ID: 3gft). Modellering av mutasjoner ble utført og visualisert ved anvendelse PyMOL [19] – [20]. PyMOL viser informasjon om alle sterisk interferens mellom den muterte aminosyre og annen aminosyre-sidekjeder, og konfigurasjonen med den minst sterisk forstyrrelse er valgt manuelt. De mutante Sidekjedene ble modellert til posisjoner av proteinet ved hjelp av rotamerer med lavest motstridende Van der Waals radier, og konfigurasjonen med den minst sterisk interferens med andre aminosyre-sidekjeder. Den villtype og mutant proteinstruktur ble lagt for å fremheve den anslåtte konforme endringer forårsaket av hver mutasjon.
Statistisk analyse
Dataanalyse ble utført ved hjelp av SPSS for Windows versjon 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Resultatene var krysstabellform for å undersøke relasjonene mellom variablene. Statistisk analyse for kategoriske variabler ble utført ved hjelp av χ-torget for test av foreningen og Fishers eksakte test som passer. Hvor to kontinuerlige uavhengige variabler ble undersøkt, ble t-test og analyse av varians anvendt. En p-verdi på mindre enn 0,05 anses signifikant i alle statistiske analyser.
Resultater
Novel KRAS-mutasjoner
KRAS-mutasjoner ble oppdaget i kreftvev av 24 ut av 56 tilfeller studert (42,85%). Av disse 11 (19,64%) hadde ekson 4 mutasjoner lokaliserte mellom kodon 134 og 150, mens 13 (23,21%) hadde mutasjoner i ekson 2, påvirker kodon 12 og 13. Mutasjoner ble ikke oppdaget i kodon 61 av exon 3. Fordelingen av mutasjoner i vår kohort er vist i Tabell S2.
De 11 tilfellene med exon 4 avvik næret 8 forskjellige mutasjoner (tabell 2), hvorav en ble tidligere rapportert (p.Ala146Thr, en missense mutasjon) og 7 var roman som åpenbart av den kosmiske database tilgjengelig på 19/09/2014. Vi bekreftet alle nye sekvensvariasjoner oppdaget i vår kohort ved sekvensering motsatt tråd. Alle prøvene viste en identisk sekvens variasjon i den motsatte tråd. Den svakt signal i prøven 33 (figur 1) kunne tilskrives lavere tumorvev innhold; den andre (fremover) tråd viste også et svakt signal til sekvensvariasjon (c.404G A) i tillegg. Imidlertid, sekvensering av noncancerous vev til pasienten viste ikke noe signal overhodet for variasjon c.404G A indikerer at signalet i prøven er over påvisningsgrensen for sekvenseringsprotokollen. En av de nye mutasjoner (G138G) ble påvist i tre pasienter og en annen (Q150X), detektert i to andre pasienter. Fire av de syv mutasjonene var missense mutasjoner som endrer aminosyresekvensen av proteinet (A134V, R135K, E143K og R149G), mens to mutasjon vært synonymt (G138G og K147K) og en, en nonsense-mutasjon avkorting (Q150X). De missense og tøv exon 4 mutasjoner ble observert i syv pasienter (12,5% av totalt). Figur 1 er et elektroferogrammet for KRAS exon 4 nonsense og missense mutasjoner som avkortede eller endret KRAS protein aminosyresekvens, respektivt. Prøvene 32 og 45 finnes også en annen mutasjon (p.Gly12Asp) i kodon 12 av exon 2 som åpenbart av STA-analyse, som ble ofte detektert i pasienter med kolorektal kreft (figur 2). De nye exon 4 KRAS-mutasjoner ble funnet å være somatisk siden deler av noncancerous kolorektal vev fra pasienter som næret slike mutasjoner viste villtypesekvensen (figur 1).
Alle illustrert mutasjoner ble bekreftet via sekvensere fremover strand. Eksempel nummer og mutasjon nomenklatur ifølge HGVs retningslinjene vises over hver mutasjon. Piler peker til plasseringen av basepar endring
Nedre panel er for prøve 32 viser andre rød topp (GGT GAT). Og det tredje svart topp (villtype)
den funksjonelle virkningen av de ikke-synonyme mutasjoner på KRAS protein ble vurdert ved hjelp av bioinformatiske analyser og resultatene er vist i tabell 3. for eksempel er E143K og Q150X mutasjoner antas å ha en ødeleggende og høy slag på proteinet, mens R135K forventes å bli tolerert, eller å ha nøytral effekt på proteinet. I tillegg brukte vi molekylær modellering for å vurdere den funksjonelle virkningen av disse nye KRAS-mutasjoner og resultatene er vist i figur 3. Den molekylære modelleringsdata passer med prediksjon fra POLYPHEN-2 og sile, samt bevaring av data (tabell 3). For eksempel er det R135K mutasjonen anslått til å være godartet og modellering viste også liten effekt på forutsagte proteinstruktur. De resterende mutasjoner er spådd å føre til betydelige endringer i proteinstruktur i tråd med den anslåtte skadelige effekten av POLYPHEN-2.
Wild type (WT) KRAS er vist i blått og mutante proteiner er vist i gult . Sidekjedene av aminosyrer er vist i grønt for WT rester og i rødt for de mutante rester. a) WT K-RAS viser side kjede av A134 (grønn). b) Overlapping av WT og mutant A134V KRAS viser de forutsagte konformasjonsendringer forårsaket av A134V mutasjon (legg merke til endringer i heliksen og beta-ark). c) Overlapping av WT og mutant R135K KRAS viser predikerte konformasjonsendringer forårsaket av R135K mutasjon (merk endringer i helix og loop kjeder), men påvirker ikke GTP bindende lommen. d) Overlapping av WT og mutant E143K KRAS viser de forutsagte konformasjonsendringer forårsaket av E143K mutasjonen (legg merke til endringer i sløyfen i nærheten av GTP-bindende lomme). e) Overlapping av WT og mutant T144I KRAS viser de forutsagte konformasjonsendringer forårsaket av T144I mutasjonen (merk endringer i GTP bindende lommen og endringene i orienteringen av bundet GTP, grønn er vekt og rødt er mutant). f) Overlapping av WT og mutant R149G KRAS viser de forutsagte konformasjonsendringer forårsaket av R149G mutasjon (merk endringer i helix og sløyfe kjedene nærheten GTP bindende lommen). g) Overlapping av WT og mutant Q150X KRAS viser de forutsagte konformasjonsendringer forårsaket av Q150X mutasjon (merk endringer i løkken kjeden).
Point mutasjoner spesifisert av EGFR mutasjonsdeteksjon kit i eksoner 18, 20 og 21 av EGFR-genet ble ikke påvist i noen av de 56 tilfeller som ble studert. Indel mutasjoner i eksoner 19 og 20 ble heller ikke påvist.
De viktigste kliniske, patologiske og immunhistokjemiske funn i de rapporterte tilfellene er vist i Tabell 4. tabell 5 og 6 viser en forekomst av kvinnelige kjønns i tilfeller med roman KRAS-mutasjoner i forhold til saker med andre KRAS mutasjoner og KRAS mutasjonsnegative tilfeller (70%, 42,8% og 43,75%, henholdsvis). De viser også lavere Utbredelsen av lymfeknutemetastase og p53-ekspresjon, men forskjellene er imidlertid ikke statistisk signifikant (p-verdi som varierer mellom 0,078 og 1,0). Vi fant ikke EGFR eller HER2 protein uttrykk, eller EGFR genmutasjoner i noen av de 10 sakene. Det var heller ingen signifikant forskjell mellom de tre gruppene om pasientens alder, og tumor størrelse, dybde og karakter.
Tre av de fem pasienter som hadde de skadelige mutasjoner hadde mer avansert sykdom med økt tumor dybde og lymfeknutemetastase (tilfeller 32, 45 og 51), mens to hadde lokalisert sykdom (saker 41 og 48).
De to tilfeller med samtidig exon 2 mutasjon (tilfeller 32 og 45) viste større svulst størrelse og dybde i forhold til de fleste andre tilfeller med nye mutasjoner og hadde også lymfeknutemetastase.
Diskusjoner
Aktivering av KRAS onkogen har vært innblandet i kolorektal kreftutvikling, blir mutert i 30-40% av adenokarsinomer [5] – [8], en prevalens kan sammenlignes med det som ble observert i denne studien (42.85%). MRNA transkripsjon av KRAS-genet består av 5765 baser som koder for 188 aminosyrer. Eksoner 1, 2, 3, 4, og 5 inneholde 181, 122, 179, 160, og 5123 baser, henholdsvis [21]. De fleste av somatiske mutasjoner som forekommer i kodon 12 og 13 (som ligger i exon 2). Andre mindre hyppige mutasjoner forekommer i ekson 3 (kodon 59/61) og ekson 4 (kodon 117/146) [22] – [23]. Omtrent en tredjedel av kolorektal kreft næret mutasjoner på G12 og G13 kodon mens ekson 4 mutasjoner kodon 117 og 146 ble påvist i bare opp til 5,5% av svulster [24]. Vår studie viste en mye lavere forekomst av ekson 2 mutasjoner (23,21%) og en mye høyere forekomst av exon 4 mutasjoner (19,64%) med ekson 4 mutasjoner lokaliserte mellom kodon 134 og 150 i stedet for å involvere kodon 117 og 146.
exon 4 KRAS-mutasjoner er undervurdert siden alle innsats av klinisk testing fokusert på ekson 2 (kodon 12 og 13) og ekson 3 (kodon 61) mutasjoner [22] – [25]. Alle de syv nye KRAS-mutasjoner rapportert i denne artikkel skjedde i exon 4 og lokalisert mellom kodon 134 og 150. Dermed foreslår vi blant annet kodoner 134-150 som et hotspot for rutine KRAS mutasjonsanalyse i pasienter med kolorektal kreft, heller enn å fokusere bare på kodon 117 og 146. Vi oppdaget missense og nonsense exon 4 mutasjoner i 12,5% av tilfellene som er høyere enn det som tidligere ble rapportert, som utgjorde 10%, men også inkludert ekson 3 og NRAS i tillegg til ekson 4 mutasjoner [24]. Alle nye mutasjoner ble funnet å være somatisk siden alle deler av noncancerous kolorektal vev fra de 10 sakene som næret mutasjonene viste villtypesekvensen.
Den funksjonelle virkningen av de nye ikke-synonyme mutasjoner på KRAS protein var vurdert ved hjelp av bioinformatikk og molekylær modellering (tabell 2 3, figur 3). Den R135K mutasjon førte til substitusjon av Arg for tilsvarende belastet Lys som er spådd å forårsake små endringer i samspillet mellom tilstøtende rester. Bioinformatikk viste at R135K mutasjon er spådd å ha en nøytral effekt på protein. På samme måte, molekylær modellering viste en liten endring i proteinstrukturen forårsaket av denne mutasjonen (figur 3). I motsetning til dette er det E143K mutasjonen anslått til å ha en skadelig effekt på proteinet ved bioinformatikk (tabell 3) og ved molekylær modellering (figur 3). Denne mutasjonen førte til substitusjon av negativt ladet Glu for den positivt ladede Lys (tabell 2) som sannsynligvis vil føre til store endringer i interaksjonene mellom de tilstøtende aminosyrerester. Figur 3 viser at den E143K mutasjonen forårsakes vesentlige endringer i strukturen til proteinet KRAS spesielt i sløyfen i nærheten av GTP-bindende lomme. Den R149G mutasjon er spådd å være nøytral, men molekylær modellering viste at denne mutasjonen skyldes endringer i helix og sløyfe kjedene nærheten GTP bindende lommen. Dette er sannsynligvis å være på grunn av forandringer i interaksjoner mellom aminosyrerestene forårsaket av substitusjon av den positivt ladede Arg for den ikke-polare Gly (tabell 2). I tillegg er denne mutasjonen ligger nær bevart SAK motiv og en fersk undersøkelse viser at en nærliggende mutasjon (K147E) resulterer i en selvaktiverende RAS protein som kan opptre uavhengig av oppstrøms signaler og viser en lavere affinitet for RAF kinase [26]. Den Q150X mutasjon innført et for tidlig stoppkodon og er antatt å ha en effekt på stabiliteten av mRNA gjennom nonsense-mediert nedbrytning som resulterer i redusert ekspresjon av det avkortede protein. Så langt vi kjenner til, den Q150X mutasjonen påvist i denne studien er den andre KRAS avkorting mutasjon som skal rapporteres i tykktarmskreft i litteraturen. En KRAS mutasjon (CAG TAG) bestemmelse av en for tidlig stoppsignal ved kodon 22 (Gln22Stop) er tidligere blitt funnet i en pasient med metastatisk kolorektal kreft ved Palmirotta, et al [27]. BRAF og p53-gener ble ikke funnet å være endret og mikro ustabilitet var ikke til stede. Pasienten ble imidlertid funnet å være ikke svarer til et anti-EGFR-behandling. Interessant våre to pasienter som hadde den avkorting mutasjon var EGFR negativ med IHC. De hadde heller ingen EGFR genmutasjoner. Flere prekliniske [28] og klinisk [29] studier har vist at forekomsten av KRAS-mutasjoner i kolorektal kreft er en uavhengig prediktiv parameter av EGFR-målrettet terapi motstand. Til slutt, selv om de synonyme nye ekson 4 mutasjoner som er rapportert i den foreliggende undersøkelse (inkludert G138G mutasjon som ble påvist i tre pasienter) ikke endret protein aminosyresammensetning, de kan likevel vise seg å være betydelig i tumorogenesis. Det er økende bevis for at synonyme mutasjoner (ofte feilaktig betegnet som «stille») kan påvirke transkripsjon, spleising, mRNA transport og oversettelse, en hvilken som helst av disse kan forandre fenotype, hvilket gjør synonymt mutasjonen ikke-stille [30].
Vi oppdaget en av de nye mutasjoner i tre tilfeller (G138G) og en annen i to tilfeller (Q150X). Vår utvalgsstørrelsen er ganske liten til å gjennomføre frekvensanalyse og sammenligning til større publiserte studier. Men det faktum at disse nye mutasjoner ble sett i 5/56 tilfeller indikerer at ytterligere studier må gjøres.
EGFR er over uttrykt i mange typer av kreft, spesielt tykktarmskreft, og synes å gjenspeile mer aggressiv histologiske og kliniske atferd [31]. Det har også blitt vist at p53 protein i løpet uttrykk kan hjelpe i potensielt forutsi metastatisk spredning til lymfeknuter i kolorektal kreft [32]. Basert på slik informasjon, den lave forekomst av lymfeknutemetastase og p53-ekspresjon i våre pasienter som hadde de nye mutasjoner kombinert med fravær av EGFR og HER2 proteinekspresjon og EGFR gen kan mutasjoner vanligvis tyder på en lav grad av banen i tykktarmskreftutvikling i disse pasienter som sannsynligvis er også resistente mot anti-EGFR og anti-HER2-behandling. Dette spekulasjon er i tråd med funn at mutasjoner i ekson 4 av KRAS forutsi for en mer gunstig klinisk utfall hos pasienter med kolorektal kreft [24]. Ironisk nok, fire av de sju nye ekson 4 mutasjoner påvist i denne studien er spådd til å være skadelig for KRAS protein som avslørt av molekylær modellering.
