Abstract
SUMOylation er en post-translasjonell ubiquitin-lignende protein modifikasjon sti som regulerer viktige cellulære prosesser inkludert kromosom struktur, kinetochore funksjon , kromosom segregering, kjernekraft og sub-kjernefysiske organisasjon, transkripsjon og DNA-skade reparasjon. Det er økende bevis for at SUMO veien er dysregulerte i kreft, øke muligheten for at modulering av denne veien kan ha terapeutisk potensial. For å undersøke betydningen av SUMO sti i sammenheng med kreftcelle spredning og tumorvekst, søkte vi lentivirus-basert kort hårnål RNA (shRNA) for å knockdown SUMO pathway gener i humane kreftceller. shRNAs for SAE2 og UBC9 redusert SUMO-konjugering aktivitet og hemmet spredning av humane kreftceller. For å utvide på disse observasjonene, genererte vi doxycycline induserbare betingede shRNA cellelinjer for SAE2 å oppnå akutt og reversibel SAE2 knockdown. Betinget SAE2 knockdown i U2OS og HCT116 cellene redusert cellevekst
in vitro
, og SAE2 knockdown indusert flere terminal utfall inkludert apoptose, endoreduplication og begynnende alderdom. Multinucleated celler ble senescent og farget positivt for senescence markør, SA-β Gal, og vises forhøyede nivåer av p53 og p21. I et forsøk på å forklare disse fenotyper, fikk vi bekreftet at tap av SUMO pathway aktivitet fører til et tap av SUMOylated Topoisomerase IIα og utseendet av kromatin broer som kan nedsette riktig cytokinese og føre til multinucleation. Videre knockdown av SAE2 induserer forstyrrelse av PML atom organer som kan ytterligere fremmer apoptose eller alderdom. I en
in vivo
HCT116 xenograft tumor modell, betinget SAE2 knockdown sterkt svekket tumorvekst. Disse data viser at den SUMO reaksjonsveien er nødvendig for kreftcelleformering
in vitro
og tumorvekst
in vivo
, impliserer SUMO reaksjonsveien som et potensielt terapeutisk mål kreft.
Citation: Han X, Riceberg J, Pulukuri SM, Grossman S, Shinde V, Shah P, et al. (2015) Karakterisering av Tap av SUMO Pathway Funksjon på kreftceller og tumor spredning. PLoS ONE 10 (4): e0123882. doi: 10,1371 /journal.pone.0123882
Academic Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 24 november 2014; Godkjent: 23 februar 2015; Publisert: 10 april 2015
Copyright: © 2015 Han et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Takeda Pharmaceuticals International Co. gitt full økonomisk støtte til studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, utarbeidelse av manuskriptet, og lønn for forfattere XH, JR, SP, SG, VS, PS, JB, LD, JN, og NB, i løpet av tiden da studier ble utført. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Takeda Pharmaceuticals International Co. gitt full økonomisk støtte til studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, utarbeidelse av manuskriptet og lønn til forfatterne XH, JR, SP, SG, VS, PS, JB, LD, JN, og NB, i den tiden da det ble gjort undersøkelser. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
SUMOylation er en evolusjonært konservert ubiquitin-lignende protein modifikasjon prosessen som regulerer et mangfoldig sett av biologiske prosesser [1, 2]. SUMO (small ubiquitin-relaterte modifiserings) proteiner er ~ 10 kD-ubiquitin-lignende proteiner som er kovalent bundet til substratet lysinrester via en enzymatisk kaskade analogt protein ubiquitinering. Det menneskelige genom koder fire SUMO familie proteiner: SUMO1-SUMO4. SUMO1-SUMO3 er allestedsnærværende uttrykt i alle vevstyper, mens SUMO4 uttrykkes hovedsakelig i nyrene, lymfeknute og milt [1]. De modne former for SUMO2 og SUMO3 er 97% identiske og bare dele ~ 50% sekvens homologi med SUMO1. SUMO1 konjugeres til målet proteiner som monomer, mens SUMO2 og SUMO3 kan danne poly SUMO kjeder som følge av akseptor lysinrester til stede ved N-terminus. Funksjonen til SUMO4 er mindre klar som bevis tyder på at det ikke er behandlet til en moden, conjugatable skjema som de andre SUMO isoformer [1, 2].
SUMOylation er en dynamisk og reversibel proteinmodifisering. Begynnende SUMO forløpere blir proteolytisk prosessert av SUMO-spesifikke isopeptidases (sentrin-spesifikke proteaser; SENPs) for å avdekke en C-terminal glysin rest. Disse modne SUMO proteiner blir aktivert av E1 heterodimeren SAE1 (AOS1) -SAE2 (SUMO Aktivere Enzym 2 eller UBA2) i en ATP-avhengig reaksjon som fremmer tioester bindingsdannelse mellom SUMO c-terminal glycin og et cystein i SAE2. SUMO blir så overført til den katalytiske cysteinrest av sålen E2 enzymet UBC9 (også kjent som UBE2I). Endelig SUMO E3 ligaser, inkludert Pias familie proteiner, RanBP2 og Polycomb gruppemedlem PC2 [1], letter dannelsen av en isopeptide bindingen mellom SUMO Ubl og et mål lysin rester på underlaget. Den kanoniske SUMO-modifikasjon nettstedet inneholder den konsensus motiv ΨKxE (der x refererer til en aminosyre, er Ψ en alifatisk forgrenet aminosyre). SUMOylation er en dynamisk prosess som til slutt reverseres ved SUMO proteaser eller SENPs, som tillater gjenbruk av SUMO proteiner for påfølgende konjugering sykluser [2]. I likhet med ubiquitin samspill domener knyttet til ubiquitin vei, har SUMO samspill motiver (SIMS) blitt identifisert som fremmer protein SUMOylation eller forbedre SUMO avhengige protein-protein interaksjoner. Kanoniske SIMS er generelt preget av en kort strekning av hydrofobe rester med en konsensus sekvens og /eller fosforylerte serinresidua [3]. Potensialet biologiske nytten av flere SUMO Ubls kombinert med utbredelsen av SIM kan bidra til å forklare det store mangfoldet av biologiske prosesser hvor SUMOylation er involvert.
De biologiske konsekvensene av SUMOylation inkludere endringer i subcellulære lokalisering, endret protein- proteininteraksjon, endret aktivitet og stabilitet substrat [1, 2]. Tallrike SUMO mål har blitt identifisert gjennom celle og biokjemiske studier og mange av disse substrater er involvert i viktige cellulære prosesser og strukturer, inkludert cellesyklus, kromosom struktur og segregering, ribosomal biogenese, nucleocytoplasmic transport, sub-kjernestruktur, DNA-reparasjon, og genuttrykk [4-8]. Flere transkripsjonsfaktorer, som for eksempel KAP1, SP3, p300, c-Jun og c-Myb, har blitt rapportert som SUMO underlag der SUMOylation er i stand til å fremme både transkripsjonen aktivering og undertrykkelse [6, 7, 9]. I tillegg er SUMOs involvert i nukleær transport via den SUMOylation avhengig atom pore lokalisering av RanGAP1, som muliggjør vedlikehold av RAN GTP gradient som er viktig for aktiv kjerne import og eksport [4]. I kjernen, er SUMOylation også rapportert å spille viktige roller i PML atom kroppen (NB) dannelse og rekruttering av PML forbundet proteiner inkludert Daxx og SP100 [10, 11].
Av særlig interesse fra en kreft perspektiv er den betydelige bevis for at SUMOylation er viktig for en rekke prosesser kritiske for mitose. I
S
.
cerevisiae
, cohesin er SUMOylated, og SUMOylation er nødvendig for søsterkromatidutveksling samhold [12]. Den mitotiske kinase Aurora B, Topoisomerase IIα, og mange centromeric og kinetochore proteiner er også rapportert SUMO substrater [13]. Blastocyster isolert fra mus Ubc9 knockout embryoer vise hypocondensed kromatin og kromosom segregering defekter [14]. Lignende effekter på kromosom segregering har også blitt observert i genetiske studier i
S
.
cerevisiae
, Sebrafisk og Drosophila, noe som tyder på et evolusjonært konservert rolle for SUMO i mitose. Forbløffende nok studier i Drosophila indikerer at dele celler er spesielt følsomme for tap av SUMO pathway funksjon i forhold til ikke-dele, differensierte celler [15].
Det er nye forbindelser mellom protein SUMOylation og kreft. I genom-wide RNAi skjermer, flere SUMO sti komponenter scoret som viktige gener for celleproliferasjon [16]. Begge
UBC9 Hotell og
SENP1
kreves for museembryoutvikling [14, 17]. Videre er SUMO E1 enzym (SAE1 /2), ble identifisert som syntetisk dødelig med c-myc i et genom-wide RNAi skjerm, og SAE2 er nødvendig for vekst av Myc-avhengig brystkreft i mus [18]. I samsvar med dette funnet, en fersk studie fant tap av SUMOylation indusert rask tilbakegang av Myc-drevet lymfom [19]. Forhøyede nivåer av UBC9 har blitt observert i flere maligniteter og er forbundet med dårligere pasient utfall; inkludert lunge, colorectal, prostata, eggstokk, brystkreft og føflekkreft [20-24]. I tillegg er forhøyede nivåer av SUMO E1, SAE, har også blitt rapportert å være assosiert med dårligere resultat ved brystkreft. Disse funnene garanterer den videre evaluering av SUMOylation pathway enzymer som potensielt kreft terapeutiske mål.
Validating potensial til å finne små molekyl modulatorer av SUMO vei, hemmere av SAE og UBC9 [25-28] Det er rapportert selv om ingen er nå i klinisk utvikling. Imidlertid, en inhibitor av en forbindelse E1 enzym, den NEDD8 aktiverende enzym (NAE), er i klinisk utvikling [29, 30]. Denne inhibitor, MLN4924 (pevonedistat), binder til adenylat-bindingssetet av NAE-NEDD8 tioester og anvender et substrat assistert mekanisme for inhibering hvorved NAE katalyserer dannelsen av en NEDD8-MLN4924 addukt som virker som en potent inhibitor av enzymet. SAE ble vist å være i stand til å danne SUMO sammensatte addukter med en ikke spesifikk E1 inhibitor (forbindelse 1), noe som viser biokjemisk bevis på konseptet som SAE kan være målrettet på denne måte [31].
Gitt den voksende forholdet mellom protein SUMOylation og kreft, forsøkte vi å karakterisere virkningene av tap av SUMO pathway funksjon i kreftcelle spredning og tumorvekst. Vi søkte stabile og betingede shRNA systemer for å knockdown SUMO E1 og E2 enzymer, SAE2 og UBC9, i humane kreftcellelinjer og SAE2 i xenograft tumormodeller. SUMO vei knockdown resulterte i flere terminal utfall inkludert senescence og apoptose, noe som førte til kraftig spredning arrest og celledød i dyrkede kreftceller. For å studere mulige mekanismer vi bekreftet tapet av TopoIIα SUMOylation og forstyrrelse av PML NBs i HCT116. I tillegg er våre data tyder på tap av SUMOylation forsinket tumorprogresjon hos xenograft modeller, noe som tyder på SUMO veien er en potensiell onkologi mål.
Materialer og metoder
Cell Kultur og reagenser
HCT116, U2OS og HeLa-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection. HCT-116 og U2OS celler ble dyrket i McCoys 5A medium supplert med varmeinaktivert 10% føtalt bovint serum. Hela-celler ble dyrket i DMEM-medium supplert med varmeinaktivert 10% føtalt bovint serum. P300-celler ble oppnådd fra Dr. Ron Hay og dyrket i DMEM-medium supplert med varmeinaktivert 10% føtalt bovint serum, 0,5 mg /ml G418 (Geneticin) og 0,5 mg /ml zeocin.
Alle cellelinjene ble smittet for å uttrykke en ikke-måls shRNA, SAE2 shRNA eller UBC9 shRNA hjelp pakket lentiviral partikler (Sigma Mission shRNA bibliotek klone #: SAE2 SH1: TRCN0000007470; SAE2 sh2: TRCN0000007472; Ubc9 SH1: TRCN0000007205; Ubc9 sh2: TRCN0000007206; Ubc9 SH3: TRCN0000011077). Infiserte celler ble valgt ved puromycin i 2 dager, til venstre for å komme seg i 24 timer og deretter anvendt for western blot og en rekke vekstmålinger. P300 cellene ble lysert å måle ildflue luciferase aktivitet med Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega).
HCT116 og U2OS celler ble konstruert for å inneholde en vektor som uttrykker en Tet-induserbar promoter ikke-måls shRNA eller en hårnål målretting menneskelig SAE2. For disse celler, shRNA var en 22-mer stem-loop klonet under kontroll av en Tet-induserbar promoter og blir transportert inn i pTRIPZ vektoren (Open Biosystems). De konstruerte linjer ble generert av stabil transduksjon med pakkede lentiviral partikler. Infiserte celler ble valgt ved puromycin i 2 dager, til venstre for å komme seg i 24 timer og deretter behandlet med 1 ug /ml Doksycyklin (Sigma). SH1: TATTCCTACTTTCAATACAGCA; SH2: TTCAATTTGGACATCTGGTGCT; SH3: TTGACTTTGTACTTCAGCCCAG; SH4. TTTACATCTAGAACCTGCTGGT
Western-analyse
helcellelysater eller tumorekstrakter ble fraksjonert ved hjelp av ikke-reduserende SDS-PAGE og immunoblottet med antistoffer mot SAE2 (for cellelysater: polyklonalt kaninantistoff genereres av Millennium , antistoff ble validert på cellelinjer overekspresjon SAE2, for svulst extract: epitomics T0083, kanin), Ubc9 (epitomics 2426-1, kanin), SUMO1 (epitomics S2227, kanin), SUMO2 /3 (cellesignalisering Technologies 4971, kanin), RanGAP1 (Abcam ab2081, geit), p53 (Cell signal Technologies 9282, kanin), p21 (Santa Cruz sc-397, kanin), kløyvde caspase 3 (Cell Signa Technologies 9661, kanin), TopoIIα (Cell signale Technologies 12286, kanin) . Alle primære antistoffer ble brukt 1: 1000 fortynning. Sekundære HRP-merket antistoff til geit IgG (Millipore, 1: 2000 fortynning) ble anvendt for RanGAP1 primært antistoff og Blottene ble utviklet med ECL-reagens (Amersham). For andre primære antistoffer, det sekundære antistoff var Alexa-680-merket antistoff til kanin /mus IgG (Invitrogen, 1: 5000 fortynning) og blotter ble avbildet med Li-Cor Odyssey Infrared Imaging system. Tubulin (Sigma) ble utslettet etter en lasting kontroll.
immunfluorescens og kjernefysisk avbildnings
HCT-116 celler ble dyrket på poly-D-lysin-belagt dekkglass (BD Biosciences) med medium + eller-doxycycline og inkubert i 5 dager. For PML farging ble cellene fiksert med 2% paraformaldehyd i PBS i 3 min, permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i PBS i 10 minutter og deretter fast igjen med 4% paraformaldehyd i PBS i 5 minutter og vasket i PBS. For Daxx farging ble cellene permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i PBS i 2,5 min først, deretter fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter og vasket i PBS. For immunfluorescens farging ble cellene behandlet med Blokkering reagens (Roche) i 1 time ved romtemperatur og farget med primære antistoffer: PML (Santa Cruz sc-966), Daxx (Santa Cruz sc-7152) i Blocking Reagens over natten ved 4 grader. Cellene ble vasket med PBS og farget med Alexa 488-konjugert geit-anti-mus IgG (1: 2000; Invitrogen) eller Alexa 488-konjugert geit-anti-kanin-IgG (1: 2000; Invitrogen) i Blocking Reagens i 1 time ved romtemperatur . Cellene ble vasket med PBS, farget med Hoechst 33342 (1: 10.000, Invitrogen) i 5 minutter og vasket i PBS. Glassene ble montert på glassplater med Vectashield (Vector Laboratories). Fluorescensmerkede celler ble visualisert ved hjelp av et Nikon TE 300 fluorescerende mikroskop og bildene ble tatt med et digitalt kamera (Hamamatsu).
spredning og cellesyklusanalyse
Etter valget ble cellene sådd ut i seks- brønners plater (2000 celler /brønn) med middels + eller-doksycyklin og inkubert i 12 dager. Celler ble fiksert ved bruk av 4% para-formaldehyd og deretter farget med en 0,5% krystallfiolett oppløsning for å identifisere tilstedeværelsen av cellekolonier.
HCT116-celler som bærer tet-induserbare hårnåler ble behandlet med doxycycline i 6 dager og oppsamlede celler ble løst i 70% etanol over natten ved 4 ° C. Fikserte celler ble sentrifugert for å fjerne etanol, og pelletene ble resuspendert i propidiumjodid og RNase A i PBS i 1 time på is beskyttet mot lys. Celle-syklus fordelinger ble bestemt ved bruk av strømningscytometri (FACS Calibur, Becton Dickinson) og analysert ved bruk av Winlist programvare (Verity).
SA-β-Gal-farging ble utført ved bruk av senescens deteksjonssett (Abcam) i henhold til instruksjonene produksjons~~POS=TRUNC.
U2OS celler behandlet med Doxycycline 7 dager ble merket med BrdU i 0,5 timer, og G1, S og G2 /M-populasjoner ble målt ved hjelp av BrdU APC strømnings kit (BD Biosciences). Representative data ble vist fra uavhengige forsøk.
Tumor xenograft eksperimenter
Denne studien ble godkjent av Takeda Oncology selskapet Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) (protokoll 09-011). 8 uker gammel kvinne NCR nu /nu mus (Taconic Farm Inc.) ble brukt i alle in vivo studier. Alle dyr gjennomgikk en akklimatiseringsperiode på minst 3 dager før de blir brukt til eksperimentelle formål (4 mus plassert per bur). For alle prosedyrer utført i denne studien ble dyrene bedøvet ved hjelp av en induksjons av et isoflorane /oksygenblanding 4-5% i en boks kammer og deretter opprettholdt ved 1-2% isoflorane /oksygen. Riktig dyr sedasjon ble bekreftet av tå knipe. For tumorvekst progresjon studier ble mus inokulert med 2 x 10
6 HCT116 eller HT29-celler som ikke-målretting eller SAE2 shRNAs subkutant i høyre flanke, og tumorvekst ble overvåket med kalibermålinger (for hver gruppe, total 4 -6-mus ble brukt). Når gjennomsnittet tumorvolumet nådd ca 200 mm
3, dyrene ble behandlet med bestrålte 0,0625% Doxycycline Diet (Lab Diet) kontinuerlig, som ga 1-6 mg Dox per mus /per dag. RFP fluorescerende bildebehandling ble utført på bedøvede dyr med en Xenogen kamera før og etter Doxycycline diett startet. I løpet av studien ble alle dyr som møtte følgende kriterier fjernet fra studien og avlives: 1. Vekttap: Kroppsvekten av alle dyrene ble overvåket gjennom hele studien, og dyrene ble avlivet hvis de påløper 15% vekttap mellom observasjoner. 2. Tumor størrelse: Dersom svulsten volumet nådde 10% av kroppsvekten, tumor størrelse større enn 2 cm forstyrrer spising, drikking, urinering, avføring eller går. 3. Sår /nekrose av svulsten nettstedet. 4. Lammelse: Tap av funksjon i enten forbein eller bakbena. 5. Andre kriterier som vil initiere daglig overvåking og aktiv dødshjelp dersom ikke responderer på palliativ behandling inkluderer: Dehydrering, hypotermi, unormal pust, lavt aktivitetsnivå, åpenbare smerter, og generelt dårlig kroppens tilstand. På slutten av studien ble alle dyrene avlivet med CO2 kvelning fulgt av torakotomi å bekrefte dødsfallet.
Resultater
Lentivirus basert SUMO sti genet knockdown hemmer kreftcelle spredning
in vitro
for å bekrefte at SUMO pathway er nødvendig for kreft celle overlevelse, søkte vi et lentivirus basert shRNA system til stabilt knockdown SUMO pathway gener i menneskekreftcellelinjer. To uavhengige shRNAs målretting SAE2 (SUMO E1) eller UBC9 (SUMO E2) ble smittet i U2OS celler (fig 1A). Ved immunoblotting, SAE2 shRNAs (SH1 og SH2) effektivt redusert SAE2 protein nivå og dermed nedregulert UBC9-SUMO tioester nivåer (fig 1A), noe som indikerer SUMO E1 hemming funksjonelt nedsatt SUMO E2 aktivering. Tilsvarende to UBC9 shRNA (SH1 og SH2) reduseres både den totale UBC9 og UBC9 SUMO tioester nivåer (fig 1A). I samsvar med de reduserte SUMO E1 og E2 nivåer, vi observerte reduserte nivåer av SUMO2 /3 konjugerte proteiner (fig 1A, nedre panel), noe som tyder SAE2 og UBC9 shRNAs er funksjonelt hemme SUMOylation i cellene.
(A) SAE2 eller UBC9 knockdown redusert SUMO pathway aktivitet. U2OS celler ble stabilt infisert med lentivirus uttrykker shRNAs, valgt med puromycin og immunoblottet for indikerte proteiner. SH1 og SH2 er to shRNAs for hvert gen. (B) SAE2 eller UBC9 knockdown de-trykt en SUMO-undertrykkende reporter. Stabile U2OS celler som inneholder et SUMO-undertrykkende luciferase reporter (P300 celler) ble infisert med angitt shRNAs. Luciferase-aktivitet ble målt på dag 5 etter valg puromycin. (C) SAE2 eller UBC9 knockdown redusert UBC9 tioester nivå i P300 reporter celler. (D) SUMO inhibering trykkes kolonidannelse. Cellene ble sådd ut i 6-brønners plater og farget for krystallfiolett etter 12 dager.
For å kvantitativt måle SUMOylation hemming i SAE2 eller UBC9 knockdown i celler, søkte vi et cellebasert reporter analysen for å måle SUMO aktivitet. Vi utnyttet stabile U2OS celler med en SUMO undertrykkende luciferaserapportørplasmid [5]. Cellene uttrykte en GAL4-p300 N-terminale fusjonsprotein (betegnet som GAL4-p300N etterpå) og næret en GAL4 bindingssete foran promotoren av et luciferase-gen. P300 N-terminale inneholder to kjente SUMOylation nettsteder. Når SUMOylated, rekrutterer GAL4-p300N transkripsjons repressors til GAL4 nettstedet som hemmer luciferase transkripsjon. De-SUMOylation av GAL4-p300N de-undertrykker luciferase reporter. Som vist i figur 1B, SAE2 shRNAs og UBC9 shRNAs øket luciferase signal sammenlignet med en kontroll shRNA. Concordantly, SAE2 og UBC9 proteinnivåer ble effektivt redusert i disse cellene (figur 1C) bekrefter at SAE2 og UBC9 knockdown funksjonelt redusert SUMOylation aktivitet.
For å studere effekten av SUMO hemming på celleproliferasjon, belagt vi U2OS celler uttrykker SAE2 eller UBC9 shRNAs og utført en 2D kolonidannelse analysen. Som vist i figur 1D, SAE2 og UBC9 shRNAs (SH1 og SH2) potent blokkert kolonidannelse
in vitro
. Vi målte også celleveksten med populasjons-fordoblings assay. I samsvar med figur 1D, SAE2 knockdown resulterte i bremset cellepopulasjon dobling (S1A fig). Lignende resultater ble observert i HCT116 og HeLa-celler (data ikke vist). Disse data bekrefter at SUMOylation er nødvendig for kreftcelle spredning.
Betinget SAE2 knockdown demper SUMO pathway aktivitet
Når voksende U2OS celler med SAE2 shRNAs, la vi merke til at celler som overlevde etter flere passeringer viste en mye lavere SAE2 knockdown sammenlignet med tidlig passasje celler, noe som indikerer at SUMO shRNAs var negativt valgt i dette prolifererende cellepopulasjon. For å oppnå akutt og regulerbar SAE2 knockdown, genererte vi fire miR30 basert SAE2 shRNAs (SH1-SH4) [32] med en RFP (rød fluorescerende protein) reporter under kontroll av promoteren TRE. Den lentiviral vektor har også en rtTA transaktivator for å danne en tet-on shRNA system som er induserbar med doksycyklin (Dox) [32]. U2OS-celler ble infisert med den betingede SAE2 shRNAs og behandlet med Dox i 5 dager. Som vist i figur 2A (øvre panel), ved Dox behandling, betinget av SAE2 shRNAs effektivt redusert SAE2 og SAE2-thioster nivåer, mens en kontroll shRNA (c) påvirket ikke nivået av uladede og tioester SAE2. Ved immunoblotting for UBC9, viste vi at betinget SAE2 knockdown reduserte nivåer av de UBC9-SUMO tioestere (figur 2A, midt panel). Gjennom overvåking av RFP reporter co-uttrykt fra TRE arrangøren, vi har oppdaget RFP induksjons på Dox behandling i 36 timer (S2 Fig), noe som indikerer effektiv induksjon av tet-on shRNA system.
(A) U2OS celler ble infisert med Dox induserbar SAE2 shRNAs (SH1-SH4) eller kontroll shRNA (c). Celler ble behandlet med Dox i 5 dager (+) eller ubehandlet (-). Protein lystes ble immunblottet for angitt proteiner. Tubulin fungerer som lasting kontroll. (BD) U2OS celler som uttrykker betinget SAE2 shRNAs ble behandlet med Dox og immunoblottet med RanGAP1 (B), SUMO1 (C) og SUMO2 /3 (D) antistoffer.
For å undersøke om betinget SAE2 shRNAs trykt SUMOylation i celler, målte vi totale SUMO konjugater så vel som den kjente SUMO målgenet RanGAP1 [4] i SAE2 knockdown cellen. Begge SUMO1 og SUMO2 konjugater var betydelig redusert i SAE2 knockdown celler på dag 5 med Dox behandling (figur 2C og 2D, + Dox baner, sh2 og SH3). I tillegg, ved akutt SAE2 knockdown, ble nivået av SUMOylated RanGAP1 redusert på 5 dager etter behandling Dox og reduksjonen nådde en topp på dag 8 (figur 2B). Denne observasjonen er i overensstemmelse med rapportert forlenget halveringstid SUMO modifisert RanGAP1 [33]. Vi testet også den betingede shRNA system i HCT116-celler og observert lignende akutt knockdown av SAE2 og ledsaget SUMOylation hemming (S3 fig). Våre resultater viser at betinget shRNAs kan akutt slå ned SAE2 å dempe SUMO pathway aktivitet i kreftceller.
Betinget SAE knockdown indusert apoptose, endoreduplication og senescence
For å ta opp hvordan akutt SAE2 knockdown konsekvenser celleproliferasjon
in vitro
, utførte vi en koloni formasjon analysen i Dox behandlet HCT116 og U2OS celler uttrykker betinget SAE2 shRNAs (fig 3A). I samsvar med stabil knockdown, Dox behandling signifikant blokkert kolonidannelse i tre SAE2 shRNAs grupper (SH2-SH4), men ikke i kontroll shRNA-gruppen (fig 3A og S4A figur).
(A) HCT116-celler ble infisert med Dox induserbar SAE2 shRNAs eller kontroll shRNA (ctrl). Celler ble sådd ut i 6-brønns plater i Dox medium inneholdende (0,5 pg /ml) og farget for krystallfiolett etter 12 dager. (B) knockdown av SAE induserer apoptose. Sub G1 populasjonen ble analysert ved hjelp av FACS med og uten Dox behandling. Feilfelt betegne S.D. (C) SAE2 knockdown indusert mobilnettet senescence. Celler ble farget for SA-β-Gal-aktivitet etter 9 dager Dox behandling. (D) PI farging og FACS-analyse av HCT116-celler følgende SAE2 knockdown. Sub G1 og mutil-kjernedannelse cellepopulasjon ble indikert.
For å utforske de potensielle fenotyper som fremmer SAE2 knockdown-mediert vekst arrest, vi analysert apoptose og cellesyklus markører i SAE2 knockdown celler. Ved PI farging og flowcytometri, observerte vi økt sub-G1 cellepopulasjonen i HCT116 cellene ved betinget SAE2 knockdown (Fig 3B), noe som tyder på noen celler gjennomgår apoptose. Av BrdU-inkorporering assay, observerte vi en redusert prosentandel av celler i S-fasen i SAE2 knockdown U2OS celler (Fig S4B). I tillegg til apoptose og redusert cellevekst, fra 6 dager etter kontinuerlig Dox behandling, SAE2 knockdown HCT116-celler viste også en multi-kjernedannelse fenotype med forstørret og flatet morfologi som vanligvis observert i senescent celler. Denne cellepopulasjonen farget positivt for SA-β-Gal-aktivitet (figur 3C), som indikerer at disse cellene har satt i gang en begynnende alderdom program. Videre flowcytometrisk analyse av kjernefysiske DNA-innhold i Dox behandlede celler viste økt 8N DNA innhold fra HCT116 celler som SAE2 shRNAs, noe som tyder på at svekket SUMOylation fører til endoreduplication (Fig 3D). Disse resultatene tyder på at redusert SUMOylation fører til en mitotisk defekt svekket cytokinese, noe som trolig bidrar til observerte apoptose og senescence.
SAE2 shRNA fenotype blir reddet av en ikke-silencible cDNA
For å utelukke off-target effekter av RNAi, utførte vi en rednings eksperiment med siRNA ildfast cDNA-konstruksjoner. Celler som uttrykker tet-on shSAE2 ble infisert med tom vektor, ikke-silencible hvete SAE2 (SAE2
wt), eller en ikke-silencible inaktive SAE2 C173A mutant cDNA (SAE2
Mut). Uten Dox behandling, de SUMO konjugerte nivåene er lik innenfor disse infiserte cellelinjer, undersøkt ved western blot (S5 fig). Etter 6 dager kontinuerlig Dox behandling, sammenlignet med vektor kontroll, SAE2
WT delvis reddet nedregulering av SAE2-SUMO og UBC9-SUMO tioester nivåer og delvis gjenopprettet SUMO2 /3-konjugater i shSAE2 uttrykkende celler. I motsetning til den uttrykte inaktive SAE2
mut ikke klarte å redde SAE2-SUMO tioester, den Ubc9-SUMO tioester og SUMO konjugater (fig 4a). Som ytterligere bekreftelse på at den ikke-silencible SAE2 kan funksjonelt redde SUMO pathway aktivitet, utførte vi den samme sub-G1 apoptose analyse og SA-β-Gal farging. Villtype SAE2, men ikke den C- A-enzym død SAE2 mutant, delvis reddet shSAE2 indusert multinucleation og begynnende alderdom, og tilhørende celledød (figur 4B og 4C). Disse data støtter at mitotiske feil og apoptose fenotyper av SAE2 shRNA er sannsynligvis forårsaket av på målet nedskrivning av SUMO pathway aktivitet.
(A) HCT116-celler som uttrykker tet-on induserbar shSAE2 (C = ctrl shRNA, 2 = sh2, 4 = SH4) ble infisert med vektor, ikke-silencible hvete SAE2 eller ikke-silencible C- Et enzym døde SAE2 mutant. Celler ble behandlet med Dox i 6 dager. Protein lysates ble immunoblottet med angitte antistoffer. (B) ikke-silencible hvete SAE2 redder shSAE2 indusert celledød. Sub G1 populasjonen ble analysert ved FACS. Feilfelt betegne S.D. (C) SA- β-Gal farging av celler som uttrykker indikerte retrovirus kombinasjon.
Hemming av SUMO sti fører til DNA decatenation defekt og PML NB avbrudd
Et sentralt spørsmål er hvordan tap av SAE2 aktivitet fører til endoreduplication og apoptose. Etter 5 dagers kontinuerlig behandling med doksycyklin, celler som uttrykker SAE2 shRNAs utviklet unormale kjernemorfologi (figur 5A). Celler ofte utviklet forstørrede kjerner og vises ofte multi-flikete kjerner (Fig 5A), tynne DNA broer forbinder to kjerner (Fig 5A, pil) og mikrokjerner (Fig 5A, Arrowhead). Mitotiske abnormiteter, inkludert multipolar spindler ble også observert (figur 5B). Disse resultatene husker fenotype observert med feil i DNA decatenation, der segregering svikt viklet kromosomer kan generere DNA broer som fører til unormal celledeling, nedsatt cytokinese og kan redusere spredning og levedyktighet [34]. Tidligere studier har rapportert at Topoisomerase IIα (TopoIIα) er en SUMO substrat og SUMOylation er viktig for TopoIIα aktivitet in vitro [35-37]. Western blot i HCT116-celler som uttrykker kontroll eller SAE2 shRNA avslørte endogent SUMOylated TopoIIα arter, og knockdown av SAE2 hemmet TopoIIα SUMOylation (Fig 5C).
(AB) HCT116-celler som uttrykker tet induserbar SAE2 shRNA (SH2) eller kontroll shRNA (ctrl) ble behandlet med Dox medium inneholdende (0,5 pg /ml) i 5 dager. Cellene ble fiksert og farget med DAPI å vise kjerner morfologi. (C) HCT116-celler som uttrykker tet induserbar SAE2 shRNA (SH2) eller kontroll shRNA (ctrl) ble behandlet med Dox for 4 dager da immunoblottet med TopoIIα antistoff. (D-E) immunofluorescence bilder av HCT116 celler som induserbar shRNA med 5 dager behandling av Dox. Cellene ble farget med (D) PML eller (E) Daxx antistoffer. (F) SAE2 knockdown er assosiert med økt p53-nivåer. U2OS celler som uttrykker betinget SAE2 shRNAs ble behandlet med Dox og immunoblottet med p53 og p21 antistoffer.
Siden SUMOylation er involvert i mange cellulære prosesser, og vi har observert tegn på både apoptose og senescence undersøkte vi effekten av SUMO pathway verdifall på PML atom organer. PML atom kropper er atommatrise arrangørene som regulerer viktige prosesser som apoptose og senescence.
