Abstract
Nyere epidemiologiske studier som innebærer forskjeller i kreft tilbakefall basert på anestesi regimer øke muligheten for at det mu opioid reseptor (MOR) kan påvirke kreft progresjon. Basert på våre tidligere observasjoner at overekspresjon av MOR i menneskelige ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler økt tumorvekst og metastasering, denne studien undersøkte om MOR regulerer vekstfaktor reseptor signalisering og epitel mesenchymale overgang (EMT) i humane NSCLC-celler. Vi benyttet spesifikk siRNA, shRNA, kjemiske inhibitorer og overekspresjon vektorer i humane NSCLC-H358-celler som enten var ubehandlet eller behandlet med forskjellige konsentrasjoner av DAMGO, morfin, fentanyl, EGF eller IGF. Cell funksjonsanalyser, immunoblot og immunoutfellingsstudier analysene ble deretter utført. Våre resultater tyder på MOR regulerer opioid og vekstfaktor-indusert EGF-reseptor-signalering (Src, Gab-1, PI3K, Akt og STAT3 aktivering) som er avgjørende for påfølgende human NSCLC celleproliferasjon og migrasjon. I tillegg humane NSCLC celler behandlet med opioider, vekstfaktorer eller MOR overekspresjon viser en økning i sneglen, slug og vimentin og redusere ZO-1 og claudin-1 protein nivåer, resulterer i samsvar med en EMT fenotype. Videre ble disse effektene reverseres med lyddemping (shRNA) eller kjemisk hemming av MOR, Src, Gab-en, PI3K, Akt og STAT3 (p 0,05). Våre data tyder på en mulig direkte effekt av MOR på opioid og vekstfaktor-signalering og påfølgende spredning, migrasjon og EMT overgang i løpet av lungekreft progresjon. En slik effekt gir en plausibel forklaring på de epidemiologiske funnene
Citation. Lennon FE, Mirzapoiazova T, Mambetsariev B, Poroyko VA, Salgia R, Moss J et al. (2014) The Mu opioidreseptoraffinitet Fremmer Opioider og Growth Factor-Induced spredning, migrasjon og epithelial Mesenchymale Transition (EMT) i Human lungekreft. PLoS ONE 9 (3): e91577. doi: 10,1371 /journal.pone.0091577
Redaktør: Olivier de Wever, Ghent University, Belgia
mottatt: 16 september 2013; Godkjent: 13 februar 2014; Publisert: 24 mars 2014
Copyright: © 2014 Lennon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Support var gitt fra institusjonelle og /eller avdelings kilder og National Institutes of Health innvilger CTSA UL1 TR000430. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Metylnaltrekson ble utviklet ved University of Chicago og lisensiert til Progenics Pharmaceuticals, deretter sub -licensed til Salix Pharmaceuticals. Dr. Moss var en betalt konsulent for Progenics Farmasi og for tiden er en betalt konsulent for Salix Pharmaceuticals. Han mottar royalties gjennom University of Chicago. Det finnes ingen patent (e) eller patentsøknader om materiale relevant for denne artikkelen. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Rollen til anestesi og analgesi i tilbakefall og metastatisk forekomsten av maligniteter har nylig fått stor oppmerksomhet [1], [2], [3], [4]. Retrospektive studier har vist en redusert forekomst av kreft tilbakefall etter regional anestesi med lavere doser av opioider etter operasjonen for bryst, prostata, tykktarmskreft og føflekkreft, selv om andre studier har ikke klart å påvise signifikante forskjeller [5], [6], [7] , [8]. Noen hypoteser for å forklare disse forskjellene i tilbakefall prisene inkluderer immunsuppressive effekter og direkte effekter på tumorcellevekst [9], [10], [11]. Vår forskning har fokusert på mu opioid reseptor (MOR) og dens rolle i direkte regulering av celleforandringer som fører til tumorvekst og metastase [4], [12], [13].
effektive terapeutiske strategier for lungekreft , den ledende årsak til kreft-assosiert dødelighet over hele verden, er svært begrenset eksemplifiserer behovet for tidlig diagnose og nye terapeutiske intervensjoner [14], [15]. Vi har tidligere rapportert at MOR blir oppregulert i flere typer human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [12]. Videre har vi vist at overekspresjon av MOR i humane NSCLC-økninger primær tumorvekst og metastase i xenograft-modeller [13]. Imidlertid er de eksakte celleforandringer regulert MOR i NSCLC ufullstendig definert [4]. For kreftceller til å vokse og metastasize, det må være et tap av celle-celle adhesjon (karakterisert ved en reduksjon av epiteliale celle adhesjon proteiner, inkludert de trange veikryss proteiner, ZO-1 og claudin-1), etterfulgt av oppkjøpet av mesenchymale egenskaper inkludert et tap av Baso-apikal polarisering, cytoskeletal ombygging og økt cellemotilitet (preget av økning i spesifikke cytoskeletal proteiner (dvs. vimentin) og transkripsjonsfaktorer (dvs. Slug og snegl) [16], [17], [18], [19] . Denne instrumentert onkogen prosessen blir referert til som epithelial mesenchymal overgang (EMT) [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22].
Vekst faktorreseptorer, inkludert epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), som ofte overuttrykt og /eller mutert i NSCLC og regulere onkogene prosesser, inkludert tumorcelle-proliferasjon, migrering og EMT overgang [23], [24], [25], [26] [27]. Flere behandlinger rettet mot EGFR i NSCLC eksisterer inkludert tyrosinkinasehemmere (gefitinib, erlotinib) og monoklonale antistoffer (cetuximab) [28], [29], [30], [31]. Men fremdeles er total overlevelsesrate for NSCLC lav [32], [33], [34]. Nylig, Fujioka et al., Har vist at morfin kan stimulere EGFR-signaliseringsveier inkludert serin /treonin-kinaser Akt og MAP kinase i NSCLC tyder på en rolle for MOR inhibering som en potensiell terapeutisk strategi for NSCLC [35].
Basert på den siste interesse av effektene av anestesi og analgesi regimer på tilbakefall og metastatisk potensial av ulike kreftformer [1], [2], [3], [4], vår tidligere publiserte data indikerer MOR er oppregulert i lunge vev fra pasienter med NSCLC [12], overekspresjon av MOR fremmer tumorvekst og metastasering i humane NSCLC xenograft modeller [13] samt data fra Fujioka et al., viser MOR regulering av EGF-indusert signale hendelser i NSCLC [35], denne studien undersøkte de funksjonelle effekter av MOR i de grunnleggende onkogene prosesser av opioider og vekstfaktor-indusert human lunge celle migrasjon, spredning og epitelial mesenchymale overgang (EMT) [16], [17], [18], [19], [ ,,,0],20]. Siden det er i dag svært lite informasjon om opioid og /eller MOR regulering av EMT og de molekylære mekanismene som integrerer kreftcelle spredning, migrasjon og EMT, denne studien undersøkte de detaljerte molekylære mekanismene for disse hendelsene som kan ha potensial klinisk nytte.
Metoder
Cell Kultur og reagenser
Den menneskelige NSCLC celle H358 er innhentet fra ATCC (Walkers, MD) og dyrket i Roswell Park Memorial Institute komplett medium (Cambrex, East Rutherford, New Jersey) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2, 95% luft, med passasjene 6-10 anvendes for eksperimentering. Med mindre annet er angitt, ble reagenser oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO). Reagenser for SDS-PAGE elektroforese ble anskaffet fra Bio-Rad (Richmond, CA) og Immobilon-P-membran overføring ble anskaffet fra Millipore (Millipore Corp., Bedford, MA). Kanin anti-MOR antistoff ble kjøpt fra GeneTex (San Antonio, Texas). Kanin anti-EGFR, kanin anti-fosfotyrosin-EGFR (pY
845, py
992, py
1045, py
1068), kanin anti-GRB-2, kanin anti-Gab-en , kanin anti-fosfotyrosin-Gab-1 (pY
307, pY
627), kanin-anti-Src, kanin-anti-fosfotyrosin-Src (pY
416), kanin-anti-P85 PI3 kinase, kanin anti-p55 PI3 kinase, kanin-anti-fosfotyrosin-P85 /p55 PI3 kinase (pY
458, pY
199), kanin-anti-STAT3, kanin-anti-fosfotyrosin-STAT3 (pY
705), kanin anti-vimentin, kanin anti-ZO-1, kanin anti-claudin-1, kanin anti-sneglen og kanin anti-Slug-antistoffer ble innkjøpt fra cellesignalisering Technologies (Danvers, MA). Mus anti-β-actin antistoff ble levert fra Sigma (St. Louis, MO). Sekundær pepperrotperoksidase-merket antistoff ble kjøpt fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). N-metylnaltreksonbromid eller metylnaltrekson ble kjøpt fra Mallinckrodt Specialty Chemicals (Phillipsburg, NJ). Den PI3 kinase inhibitor LY294002, Akt Inhibitor X, Src familien kinase inhibitor PP2 og STAT3 inhibitor Stattic ble kjøpt fra EMD Biosciences (Rica, MA).
Immunoblotting
Immunoblotting ble utført som vi er tidligere beskrevet. Cellulære materialer fra behandlede eller ubehandlede humane NSCLC-celler ble inkubert med lyseringsbuffer (50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 20 mM MgCl
2, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,4 mM Na
3VO
4, 40 mM NaF, 50 mM okadasyre, 0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1:250 fortynning av Calbiochem proteasehemmer blanding 3). Prøvene ble så kjørt på SDS-PAGE i 4-15% polyakrylamidgeler, overført til Immobilon-membraner ™, og utviklet med spesifikke primære og sekundære antistoffer. Visualisering av immunoreaktive bånd ble oppnådd ved anvendelse av forsterket kjemiluminescens (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). I noen tilfeller ble immunoreaktive band kvantifisert ved hjelp av datastøttet densitometry.
Små interfering RNA Transfeksjon i Human NSCLC Cells
Stall Kontroll og enten MOR, Gab-en, eller Src siRNA (Santa Cruz Biotechnology, ble Santa Cruz, CA) transfektert inn i H358-celler som vi har tidligere beskrevet [12]. Celler (~40% sammenflytende) var serum-sultet i 1 time etterfulgt av inkubert med siRNA i 6 timer i serumfritt medium. Serumholdig medium ble deretter tilsatt (10% serum endelig konsentrasjon) i 42 timer. Hemming av protein uttrykk ble bekreftet av immunoblot analyse med spesifikke antistoffer.
Stall Kontroll og MOR Small hårnål RNA Transfeksjon i Human NSCLC Cells
Stall Kontroll og MOR shRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ble stabilt transfektert inn i H358-celler som vi har tidligere beskrevet [12]. Celler (~40% sammenflytende) var serum-sultet i 1 time etterfulgt av inkubert med shRNA i 6 timer i serumfritt medium. Serumholdig medium ble deretter tilsatt (10% serum endelig konsentrasjon) i 42 timer og puromycin utvalg reagens ble tilsatt. Hemming av protein uttrykk ble bekreftet av immunoblot analyse med anti-MOR antistoff (GeneTex, San Antonio, Texas).
Stall vektorkontroll og MOR1 Overuttrykte i Human NSCLC Cells
Myc-DDK-merket ORF klone av Homo sapiens opioid reseptor, mu 1 (OPRM1), transkripsjon variant MOR-en (OriGene Technologies Inc, MD) ble forsterket ved hjelp av Platinum Taq DNA polymerase high fidelity enzym (Invitrogen, CA) og deretter klonet inn i en pCR8 /GW /Topo oppføring vektor (Invitrogen, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Plasmid-DNA ble ekstrahert fra utvalgte kloner ved QIAquick plasmid Mini Kit (Qiagen, CA). ORF integritet og fragment orientering ble bekreftet ved sekvensering. Den MOR1-Myc fusjonsprodukt ble deretter overført til pcDNA3.2 /v5 MÅL-vektor (Invitrogen, CA) ved LR reaksjon. Den resulterende konstruksjon (pcDNA3.2-MOR1-Myc) ble transfektert inn i H358-celler ved anvendelse Fugene HD ™ som transfeksjon reagens (Roche Applied Sciences) ifølge protokollen gitt av Roche som vi har beskrevet tidligere. Celler (~40% sammenflytende) var serum-sultet i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med pcDNA3.2-MOR1-Myc i 6 timer i serumfritt medium. Serumholdig medium ble deretter tilsatt (10% serum endelig konsentrasjon) i 42 timer og neomycin utvalg reagens ble tilsatt. Overekspresjon ble bekreftet av immunoblot analyse med anti-MOR antistoff (GeneTex, San Antonio, Texas).
Menneske NSCLC Cell Proliferation Assay
Måling av
in vitro
NSCLC cellevekst ble utført som vi har beskrevet tidligere. Kontroll eller siRNA forbehandlet H358-celler (5 x 10
3 celler /brønn) ble inkubert med 0,2 ml serumfritt medium inneholdende enten bærer (kontroll), metylnaltrekson (MNTX, 100 nM), den PI3 kinase inhibitor LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), Src-familie kinase inhibitor PP2 (100 nM) eller STAT3 inhibitor Stattic (10 uM) i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO2 /95% luft i 96-brønners kultur plater.
in vitro
celleproliferasjon Analysen ble analysert ved å måle økning i celle nummer ved hjelp av CellTiter96 ™ MTS analyse (Promega, Madison, WI) og lese ved 492 nm. Hver analyse ble satt opp i tre eksemplarer og gjentas minst fem ganger.
Menneske NSCLC Cell Migration analysen
Måling av
in vitro
NSCLC cellemigrasjon ble utført som vi tidligere har rives. Tjuefire Transwell-enheter med 8 um porestørrelse (Millipore, Billerica, MA) ble anvendt for å overvåke
in vitro
cellemigrering som vi har tidligere beskrevet [12]. Kontroll eller siRNA forbehandlet H358-celler (5 x 10
3 celler /brønn) ble inkubert med 0,2 ml serumfritt medium inneholdende enten bærer (kontroll), metylnaltrekson (MNTX, 100 nM), den PI3 kinase inhibitor LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 pM), ble den Src-familie kinase inhibitor PP2 (100 nM) eller STAT3 inhibitor Stattic (10 uM) sådd ut på det øvre kammer og medium med serum ble tilsatt til det nedre kammer. Celler ble tillatt å migrere gjennom porene i 18 timer. Celler fra den øvre og nedre kammer ble kvantifisert ved å bruke MTS CellTiter96 ™ assay (Promega, San Luis Obispo, CA) og avlest ved 492 nm. % Migrering ble definert som # av cellene i det nedre kammer delt på antall celler i både det øvre og nedre kammer. Hver analyse ble satt opp i triplikat og gjentas minst fem ganger.
Statistical Analysis
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. For dataanalyse, ble eksperimentelle prøver sammenlignet med kontroller av uparet t-test. For flere gruppesammenligninger, ble en enveis variansanalyse (ANOVA) og post hoc flere sammenligninger tester brukes. Forskjeller mellom grupper ble vurdert som statistisk signifikant når
P
verdien var mindre enn 0,05. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism-programmet (GraphPad Software Inc., USA).
Resultater
Våre resultater i figur 1 viser at hemme MOR med perifer MOR antagonist MNTX demper EGF- indusert proliferasjon (figur 1 A) og migrering (figur 1 B) av humane NSCLC-H358-celler på en doseavhengig måte. Disse dataene antyder en sammenheng mellom MOR og EGFR i H358-celler. Å mechanistically vurdere rollen til MOR på EGF-indusert EGFR dynamikk, behandlet vi H358 celler med EGF til ulike tider og immunopresipitert EGFR å fastslå potensialet MOR forening. Figur 2 A viser at EGF induserer en kompleksdannelse mellom EGFR og MOR som topper på 5 til 15 minutter etter utfordring EFG. Basert på våre resultater at en MOR /EGFR-komplekset kan oppstå med EGF stimulering av H358-celler, ved siden undersøkte vi om MOR kan regulere EGFR fosforylering. Ved å benytte et panel av anti-fosfo-EGFR-antistoff, figur 2-B viser at forbehandling av H358 humane NSCLC-celler med den periferiske MOR antagonist MNTX mislyktes i å dempe EGF-indusert tyrosinfosforylering EGFR
Panel A:. Humant H358 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler ble analysert for metylnaltrekson (MNTX) hemning av EGF-mediert proliferasjon ved hjelp av en MTS proliferasjonsanalyse. Cellene ble vekst i nærvær av 100 ng /ml EGF og /eller 0-250 nM MNTX i 72 timer. MNTX Det er en statistisk signifikant forskjell (p 0,05, angitt med en stjerne) mellom kontroll og MNTX (10, 50, 100, 250 nM) behandling med n = 3 per tilstand og feilstolper = standardavvik. Se Metoder seksjon for eksperimentelle detaljer. Panel B: Human H358 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler ble analysert for metylnaltrekson (MNTX) hemning av EGF-mediert migrering ved hjelp av en transwell assay (8 uM porestørrelse). Celler ble tillatt å migrere i nærvær av 100 ng /ml EGF og /eller 0-250 nM MNTX i 18 timer. Det er en statistisk signifikant forskjell (p 0,05, angitt med en stjerne) mellom kontroll og MNTX (50, 100, 250 nM) behandling med n = 3 per tilstand og feilstolper = standardavvik. Se Metoder seksjon for eksperimentelle detaljer
Panel A:. Menneskelig H358 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler ble behandlet uten (kontroll) eller 100 ng /ml EGF for 5, 15, eller 30 minutter. Cellelysater ble oppnådd og immunopresipitert med anti-EGFR-antistoff. Immunoblot ble utført på totale cellelysater (til venstre) og immunoutfelt materiale (høyre) ved bruk av anti-MOR (a) og anti-EGFR (b) antistoffer. Den mu opioid reseptoren er rekruttert til EGFR med EGF stimulering. Panel B: Human H358 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler var enten ubehandlet (kontroll) eller behandlet med 100 nM MNTX alene, 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter, eller 100 nM MNTX og 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter. Cellelysater ble oppnådd og immunoblottet ved anvendelse av anti-pY
845 EGFR (a), anti-pY
992 EGFR (b), anti-pY
1045 EGFR (c), anti-pY
1068 EGFR (d), anti-EGFR (e) og anti-actin (e) antistoffer. MNTX hemmer ikke EGF-indusert EGFR tyrosinfosforylering.
Vi neste undersøkt om MOR kan regulere EGFR nedstrøms signalmolekyler. Vi undersøkte først adapteren protein, vekstfaktor-reseptor-bundet protein 2 (GRB-2), som inneholder et SH2 domene og to SH3 domener, og kan direkte binde til EGFR [36]. Resultatene av figur 3-A viser, ved hjelp av immunpresipitering av EGFR og immunblotting med anti-grb-2-antistoff, som induserer EGF EGFR /grb-2-kompleksdannelse, som svekkes ved forbehandling av H358-celler med MNTX. Rekruttering av GRB-2 til EGFR er viktig for plasma membran rekruttering og påfølgende tyrosinfosforylering av stillaset protein, GRB2-assosiert-bindende protein 1 (Gab-1) [37]. Figur 3-B viser at EGF stimulering av H358-celler induserer tyrosinfosforylering av Gab-en (Tyr307 og Tyr627) som topper på ~ 5 minutter og svekkes av MOR hemming med MNTX
Panel A:. Menneskelig H358 non -små celle lungekreft (NSCLC) celler var enten ubehandlet (kontroll) eller behandlet med 100 nM MNTX (en time pre-inkubering), 10 ng /ml EGF i 15 minutter, eller 100 nM MNTX og 10 ng /ml EGF. Cellelysater ble oppnådd og immunopresipitert med anti-EGFR-antistoff. Immunoblot ble utført på totale cellelysater og immuno-materiale ved hjelp av anti-grb-2 (a, c) og anti-EGFR (b, d) antistoff. MNTX hemmer EGF-indusert rekruttering av GRB-2 til EGFR. Panel B: Human H358 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler var enten ubehandlet (kontroll) eller behandlet med 100 nM MNTX alene, 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter, eller 100 nM MNTX og 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter. Cellelysater ble oppnådd og immunoblottet ved anvendelse av anti-pY
627 Gab-1 (a), anti-pY
307 Gab-1 (b) og anti-actin (c) antistoffer. MNTX demper EGF-indusert Gab-en tyrosinfosforylering.
Siden tyrosinfosforylering av Gab-en ved ulike tyrosin kinaser inkludert Src fremmer binding til signalmolekyler inkludert phosphatidylinositol 3-kinaser (PI3Ks) som genererer PIP3 og aktivere nedstrøms effektorer inkludert Akt og STAT3 [37], [38], [39], [40], [41], [42], vi neste undersøkt om MOR hemming kan også påvirke Gab-en binding /effektor molekyler. Figur 4-A viser at, som Gab-en, EGF utfordringen med H358-celler induserer tyrosin fosforylering av Src (Tyr416), regulatoriske PI3K alfa subenheter P85 og P55 (Tyr458 /Tyr199), og transkripsjonsfaktoren STAT3 (Tyr705) som topp på ~ 5 minutter og er svekket av MOR hemming med MNTX i en statistisk signifikant måte (Figur 4-B)
Panel A:. Menneskelig H358 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler var enten ubehandlet (kontroll ) eller behandlet med 100 nM MNTX alene, 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter, eller 100 nM MNTX og 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter. Cellelysater ble oppnådd og immunoblottet ved anvendelse av anti-fosfo-Src (pY
416) (a), anti-fosfo-P85 /p55 PI3 kinase (pY
458 /pY
199) (b, c) , anti-fosfo-STAT3 (pY
705) (d) og anti-actin (e) antistoffer. Panel B: Grafisk kvantifisering av immunoreaktivitets eksperimenter utført beskrevet i figur 3-B og Panel A med normalisering til total bestemt protein og n = 3 uavhengige forsøk per tilstand. En stjerne (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) fra kontrollen. De feilfelt = standardavvik.
Vi neste undersøkt mekanismen som EGF og DAMGO ([D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol] -enkephalin), et syntetisk opioid peptid med spesifisitet for MOR) induserer spredning og migrasjon. Figur 5 illustrerer at siRNA og /eller kjemisk inhibering av MOR, GAB-1, Src, PI3K, Akt og STAT3 markert redusere EGF og DAMGO-indusert proliferasjon (figur 5-A) og migrering (figur 5-B).
Panel A: human H358 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler ble analysert for EGF og DAMGO-mediert proliferasjon ved hjelp av en MTS proliferasjonsanalyse. H358 humane NSCLC-celler som enten var ubehandlet (kontroll) eller behandlet med 100 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF) eller 100 nM DAMGO i 72 timer med eller uten forbehandling av cellene med det perifere MOR antagonist, metylnaltrekson (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-en siRNA, Src siRNA, den PI3 kinase inhibitor LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), Src familien kinase inhibitor PP2 (100 nM) eller STAT3 inhibitor Stattic (10 uM). Det er en statistisk signifikant forskjell (p 0,05, angitt med en stjerne) mellom kontroll- og behandlingsgrupper med n = 3 uavhengige eksperimenter pr tilstand og feilstolper = standardavvik. Se Metoder seksjon for eksperimentelle detaljer. Panel B: Human H358 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler ble analysert for EGF og DAMGO-mediert migrering ved hjelp av en transwell assay (8 uM porestørrelse). H358 humane NSCLC-celler som enten var ubehandlet (kontroll) eller behandlet med 100 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF) eller 100 nM DAMGO i 18 timer med eller uten forbehandling av cellene med det perifere MOR antagonist, metylnaltrekson (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-en siRNA, Src siRNA, den PI3 kinase inhibitor LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), Src familien kinase inhibitor PP2 (100 nM) eller STAT3 inhibitor Stattic (10 uM). Det er en statistisk signifikant forskjell (p 0,05, angitt med en stjerne) mellom kontroll- og behandlingsgrupper med n = 3 uavhengige eksperimenter pr tilstand og feilstolper = standardavvik. Se Metoder seksjon for eksperimentelle detaljer.
Siden svært lite er kjent om MOR regulering av epitel mesenchymale transformasjon (EMT) og de molekylære mekanismene som integrerer kreftcelle spredning, migrasjon og EMT, vi neste undersøkt om MOR1 overekspresjon regulerer lungekreft EMT. I figur 6-A, B, observerte vi at MOR overekspresjon i humane NSCLC-H358-celler indusert endring i EMT markør uttrykk som er forenlig med en epitelial mesenkymale overgang [19]. Siden MOR er hovedreseptoren for visse opioider [4], [43], ved evaluert vi hvorvidt opioider kan indusere EMT i humane NSCLC-H358-celler. Figur 6-C angir at DAMGO, morfin og fentanyl alle indusere EMT i NSCLC på en doseavhengig måte
Panel A:. Kontroll (ikke-transfekterte) (C), stabil vektorkontroll (VC) og MOR1 overekspresjon (O /E) H358-cellelinjer ble generert, cellelysater erholdt og immunoblottet med EMT markører anti-vimentin (a), anti-sneglen (b), anti-Slug (c), anti-claudin-1 (d), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) og anti-actin (g) antistoffer. En økning i vimentin, sneglen og Slug uttrykk og en reduksjon i claudin-1 og ZO-1-ekspresjon tyder på en epitelial mesenkymale overgang. Panel B: Grafisk kvantifisering av immunreaktiviteten av eksperimenter utført er beskrevet i panel A med n = 3 uavhengige eksperimenter pr tilstand. En stjerne (*) viser en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) fra kontroll med feilfelt = standardavvik. Panel C: H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlet, behandlet med 100 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF), 100 nM DAMGO, morfin eller fentanyl eller 100 ng /ml insulin vekstfaktor (IGF) i 96 timer, cellelysater erholdt og immunoblottet med EMT markører anti-vimentin (a), anti-sneglen (b), anti-Slug (c), anti-claudin-1 (d), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) og anti-actin (g) antistoffer. En reduksjon i vimentin, sneglen og Slug uttrykk og en økning i claudin-1 og ZO-1-ekspresjonen tyder på inhibering av epitelial mesenchymale overgang. Panel D: Styring shRNA eller MOR shRNA H358 cellelinjer ble generert, cellelysater innhentet og immunoblottet med EMT markører anti-vimentin (a), anti-Snail (b), anti-Slug (c), anti-claudin-en (d ), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) og anti-actin (g) antistoffer. En økning i vimentin, sneglen og Slug uttrykk og en reduksjon i claudin-1 og ZO-1 uttrykk foreslå en epitelial mesenchymale overgang.
Vurderer disse H358 humane NSCLC-celler uttrykker basale nivåer av MOR og svare på opioid behandling, undersøkte vi om lyddemping (shRNA) av MOR vil påvirke opioid og vekstfaktor-indusert EMT. Figur 6-D indikerer MOR lyddemping hemmer opioid og EGF /IGF-indusert forandringer i EMT markør uttrykk. Figur 7-A indikerer at H358-celler vokse i kolonier med godt avgrensede grenser og sterke celle-celle adhesjon. I motsetning til morfin eller IGF-behandlede H358-celler viser et underskudd på celle-celle adhesjon og en endring fra cuboidal til en langstrakt fenotype med flere cellulære anslag synlige. Disse forandringene er i samsvar med en epitelial mesenkymale overgang (EMT)
Panel A:. H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlet (kontroll), ble behandlet med 100 nm morfin eller 100 ng /ml insulin vekstfaktor (IGF) for 96 timer og lysfelt bilder ble oppnådd (20 ×). H358-celler vokse i kolonier med godt avgrensede grenser og sterke celle-celle adhesjon. I motsetning til morfin eller IGF-behandlede H358-celler viser et underskudd på celle-celle adhesjon og en endring fra cuboidal til en langstrakt fenotype med flere cellulære anslag synlige. Disse endringene er i samsvar med en epitelial mesenchymale overgang (EMT). Panel B: H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlet, behandlet med 100 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF), 100 nM DAMGO, morfin eller fentanyl eller 100 ng /ml insulin vekstfaktor (IGF) i 96 timer med eller uten forbehandling med den perifere MOR antagonist, metylnaltrekson (MNTX, 100 nM), Src-familie kinase inhibitor PP2 (100 nM) eller STAT3 inhibitor Stattic (10 uM). Cellelysatene ble deretter oppnådd og immunoblottet med EMT markører anti-vimentin (a, c, e) eller anti-claudin-1 (b, d, f) antistoffer. En økning i vimentin uttrykk og en reduksjon i claudin-1 uttrykk foreslå en epitelial mesenchymale overgang.
Vi neste undersøkt potensielle signaltransduksjon proteiner som potensielt kunne regulere opioid og vekstfaktor-indusert EMT. Figur 7-B angir forbehandling med den perifere MOR antagonist, metylnaltrekson (MNTX), Src-familie kinase inhibitor PP2 eller STAT3 inhibitoren Stattic reversere opioide og vekstfaktor-induserte forandringer i vimentin og claudin-1-ekspresjon. I tillegg, figur 8 viser siRNA og /eller kjemisk inhibering av MOR, GAB-1, Src, PI3K, Akt og STAT3 dramatisk inhiberer EMT (som bestemt ved inhibering av opioid og vekstfaktor-indusert økning i ekspresjon vimentin og reduksjon i claudin- 1 uttrykk). Både MNTX og MOR-inhibitor nalokson dempet opioid og vekstfaktor-indusert EMT indikasjon på en generell effekt av MOR antagonister på denne prosessen (figurene 7 og 8 og underliggende data, Figur S1). Til sammen våre data tyder MOR spiller en sentral rolle i prosessene for spredning, migrasjon og epitelial mesenchymale overgang alene og sammen med opioider og vekstfaktorer
Panel A:. Grafisk fremstilling av% kontroll vimentin uttrykk. H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlet, behandlet med 100 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF), 100 nM DAMGO, morfin eller fentanyl eller 100 ng /ml insulin vekstfaktor (IGF) i 96 timer med eller uten forbehandling av cellene med perifer MOR antagonist, metylnaltrekson (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-en siRNA, Src siRNA, den PI3 kinase inhibitor LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), Src familien kinase inhibitor PP2 (100 nM ) eller den STAT3 inhibitor Stattic (10 uM). Cellelysater ble deretter innhentet og immunoblottet med EMT markør anti-vimentin antistoff. Forsøkene ble gjentatt i triplikat og immunoreaktive bånd ble analysert ved hjelp av datamaskinassistert densitometri. Det er en statistisk signifikant forskjell (p 0,05 merket med en stjerne (*)) mellom kontroll- og behandlingsgrupper med feilfelt = standardavvik. En økning i vimentin uttrykk tyder på en epitelial mesenchymale overgang. Panel B: Grafisk fremstilling av% kontroll claudin-1-ekspresjon. H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlet, behandlet med 100 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF), 100 nM DAMGO, morfin eller fentanyl eller 100 ng /ml insulin vekstfaktor (IGF) i 96 timer med eller uten forbehandling av cellene med perifer MOR antagonist, metylnaltrekson (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-en siRNA, Src siRNA, den PI3 kinase inhibitor LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), Src familien kinase inhibitor PP2 (100 nM ) eller den STAT3 inhibitor Stattic (10 uM). Cellelysater ble deretter innhentet og immunoblottet med EMT markør anti-claudin-1 antistoff. Tre uavhengige forsøk per tilstand ble utført og immunreaktive bånd ble analysert ved hjelp av datastøttet densitometry. Det er en statistisk signifikant forskjell (p 0,05 merket med en stjerne (*)) mellom kontroll- og behandlingsgrupper med feilfelt = standardavvik. En reduksjon i claudin-1 uttrykk tyder på en epitelial mesenchymale overgang.
Diskusjoner
NSCLC, som står for ~80% av alle lungekrefttilfellene, er en sykdom med høy dødelighet og få behandlingstilbud [44], [45]. Vi har tidligere rapportert at MOR blir oppregulert i lungevev fra pasienter med NSCLC [12], og at overekspresjon av MOR fremmer tumorvekst og metastase i humane NSCLC-xenograft-modeller [13].
