Abstract
En scene-forbundet genuttrykk signaturen coordinately uttrykte gener, inkludert transkripsjonsfaktor Slug (SNAI2 ) og andre epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) markører er funnet i prøvene fra offentlig tilgjengelige genuttrykk datasett i flere krefttyper, inkludert nonepithelial kreft. Uttrykket nivåer av co-uttrykte gener som varierer på en kontinuerlig og koordinere måte på tvers av prøvene, som strekker seg fra fravær av ekspresjon til sterk ko-ekspresjon av alle gener. Disse dataene tyder på at tumorceller kan passere gjennom en EMT-lignende prosess med mesenchymale overgang i varierende grad. Her viser vi at i glioblastoma multiforme (GBM), er denne signaturen forbundet med tid til tilbakefall etter første behandling. Ved å analysere data fra Kreft Genome Atlas (TCGA), fant vi at GBM pasienter som responderte på behandlingen, og hadde lang tid til tilbakefall hadde lave nivåer av signaturen i sine tumorprøver (
P
= 3 × 10
-7). Vi fant også at signaturen er sterkt korrelert i gliomer med den antatte stamcelle markør CD44, og er sterkt beriket blant de differensielt uttrykte gener i glioblastomas kontra lavere klasse hjernesvulst. Våre resultater tyder på at lang forsinkelse før tumorresidiv er forbundet med fravær av mesenchymale overgang signatur, øke muligheten for at hemme denne overgangen kan forbedre holdbarheten av terapi i glioma pasienter
Citation. Cheng WY, Kandel JJ, Yamashiro DJ, Canoll P, Anastassiou D (2012) En Multi-Cancer Mesenchymale Transition Gene Expression Signatur er assosiert med lengre tid til tilbakefall med glioblastom. PLoS ONE 7 (4): e34705. doi: 10,1371 /journal.pone.0034705
Redaktør: Jeffrey K. Harrison, University of Florida, USA
mottatt: 02.12.2011; Godkjent: 06.03.2012; Publisert: 06.04.2012
Copyright: © 2012 Cheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert fra Columbia University oppfinnerens patent royalty provenyet. Patentet er relatert til forskning beskrevet i avisen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
A multi-trinns kreft-assosiert genekspresjon signatur er nylig blitt identifisert [1], som består av et sett av gener som er koordinert å overuttrykt bare i prøver av kreft som har overskredet en bestemt scene som er spesifikk for hver krefttype . Tabell 1 inneholder en liste over de 64 gener som korresponderer til de 100-probe-sett (som vist i [1]) av signaturen. Signaturen inneholder mange epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) markører [2], [3], [4], som EMT-induserende transkripsjonsfaktor Slug (SNAI2), samt COL5A2, FAP, POSTN, COL1A2, COL3A1, FBN1, TNFAIP6, MMP2, GREM1, BGN, CDH11, SPOCK1, DCN, COPZ2, THY1, PCOLCE, PRRX1, PDGFRB, SPARC, INHBA, COL6A2, FN1, ACTA2. Imidlertid er signaturen også tilstede selv i noen nonepithelial kreftformer, som neuroblastom og Ewings sarkom. I hvert datasett, ekspresjonsnivået av co-uttrykte gener som varierer på en kontinuerlig måte på tvers av prøvene. I et nylig eksperiment også bekreftet vi at de fleste av gener av signaturen, inkludert α-SMA, er uttrykt i enkelte xenopodet humane kreftceller seg
in vivo
, men ikke i vertsmuseceller [5]. Disse resultatene indikerer at kreftceller kan passere gjennom en mesenchymale overgangsprosess i varierende grad som strekker seg fra total mangel på ekspresjon av sterk ko-ekspresjon av genene av signaturen, og derfor tilsvarende underliggende veier er aktivert i løpet av kreftceller, i forbindelse med andre baner i svulstens mikromiljø som gir kontekstuelle interaksjoner.
den gjennomsnittlige uttrykk nivået av disse 64 genene kan betraktes som uttrykk nivået av en metagene representerer signatur, som vi refererer som «mesenchymale overgang metagene. «Vi antok at denne verdien er assosiert med kliniske data i glioblastoma multiforme (GBM) som det er rik slike data tilgjengelig på The Cancer Genome Atlas (TCGA). Vi fant ut at det var faktisk sterk tilknytning til metagene med fenotype «Dager til tumorresidiv», definert som perioden fra første behandling til dato for diagnose eller anerkjennelse av tilstedeværelse og natur retur av tegn og symptomer på kreft etter en periode med forbedring. Pasienter som ikke opplever bedring etter behandling har en «null» oppføring i det tilsvarende feltet.
Metoder
For statistisk analyse vi brukte rang summen av pasientene med lang tid til tilbakefall etter vurdering pasientene i form av mesenchymale overgang metagene. For å vurdere statistisk signifikans, beregnet vi
P
verdi fra sin definisjon bruker empiriske fordelingsfunksjonen. I tillegg, utførte vi Cox regresjon mellom dager til tumorresidiv og ekspresjonsnivået av signaturen.
Vi utførte multivariat Cox regresjon på dager til tumorresidiv ved bruk av både de uttrykk verdiene av mesenchymal overgangen metagene og fire glioblastom undergrupper som kovariater.
Resultater
Figur 1 viser et spredningsdiagram hvor hver av de 99 prøvene som de «Dager til tumorresidiv» fenotype har en ikke-null oppføring er representert av en prikk som viser uttrykket nivået av mesenchymale overgang metagene og antall dager til tumorresidiv. Figuren viser at, innenfor gruppen av pasienter som opplevde bedring etter behandling, de åtte pasienter med tumorer dukket mer enn tre år etter terapi har svært lave verdier av uttrykk for metagene. Figur 2 viser et varmekart over de 64 gener, hvor prøvene er rangert i forhold til uttrykk for metagene og de åtte pasientene som tid til tilbakefall var mer enn tre år er markert med grønt. Rang sum for disse åtte pasienter er 1 + 2 + 6 + 7 + 9 + 11 + 16 + 18 = 70. rang summen er spesielt godt egnet som et mål på denne observerte aspekt av foreningen av «Dager til Tumor tilbakefall «fenotype med ekspresjonen av et gen, hvor fravær av gen-ekspresjon er nødvendig for usedvanlig lang tid til tilbakefall. Sannsynligheten for rangeringen summen blir ≤70 skyldes rene tilfeldigheter er beregnet som den relative hyppigheten av slike hendelser etter tilfeldig permutasjon fenotypene ti millioner ganger og rekalkulerer rang sum, avslutt at
P
= 3 × 10
-7, som også er sannsynligheten for å finne at summen av åtte tilfeldig plukket forskjellige tall mellom 1 og 99 er mindre enn eller lik 70.
Hvert punkt i spredningsdiagrammet representerer en av de 99 pasienter som de «Dager til tumorresidiv» fenotype har en ikke-null oppføring. Den horisontale aksen måler gjennomsnittet av RMA-normaliserte uttrykk nivåer av de 64 gener som er vist i tabell 1. Den vertikale aksen måler dager for å tumorresidiv og den horisontale stiplede linje trekkes på tre år cutoff-punkt.
de 99 prøvene er rangert i forhold til gjennomsnittlig uttrykk nivå av genene vist i tabell 1. de åtte pasienter som tid til tilbakefall ble mer enn tre år er markert med grønt på en
st, 2
nd,
th 6,
th 7,
th 9,
th 11, 16
th, og 18
th stilling, noe som resulterer i rang sum av 70 .
Vi har også skilt hele settet med 545 tumorprøver i to grupper av lik størrelse, som inneholder høye kontra lave nivåer av mesenchymale overgang metagene. Innenfor de 99 prøvene som inneholdt en «Dager til tumorresidiv» -feltet, var det 48 «low level» og 51 «high level» prøver. Vi utførte Cox regresjon mellom dager til tumorresidiv og ekspresjonsnivået av signaturen. Figur 3 inneholder de tilsvarende Kaplan-Meier-overlevelseskurver som resulterer i en tydelig sammenheng med statistisk signifikans på p = 0,0054 ved anvendelse av en chi-squared-testen.
545 tumorprøver ble oppdelt i to grupper av lik størrelse avhengig deres nivå av mesenchymale overgang metagene. Vist er Kaplan-Meier kurver for de tilsvarende prøver med oppføringene i «Dager til tumorresidiv» -feltet.
Vi brukte deretter rang summen metriske å identifisere hvilke blant de enkelte 64 gener Table 1 definerer metagene har best poengsum, forventer at noen av dem ville ha rang summen lavere enn 70. Bemerkelsesverdig, den beste scoring genet var COL5A1 med rang sum tilsvarende 78 etterfulgt av COL6A2 med rang sum lik 82. med andre ord, poengsummen for metagene er betydelig bedre enn noen av de enkelte komponent gener. Enda mer påfallende, etter å gjøre uttømmende søk blant alle 12,042 gener, de beste rangerte genet (EFEMP2) hadde rang sum lik 75, enda verre enn det (70) av metagene. Disse resultater antyder at signaturen er identifisert i [1] omfatter en synergistisk samling av gener som korresponderer til en biologisk mekanisme av mesenchymale overgang, som, når fraværende, er assosiert med øket tidsperiode for å tumorresidiv i GBM.
Tabell 2 viser en liste over de 30 beste enkeltgener i form av deres rang sum for «Dager til tumorresidiv» fenotype. Ni av disse 30 gener, uthevet i tabell 2, er blant de 64 genene i tabell 1, som viser sterk berikelse (
P
= 3 × 10
-14) av EMT markører i dette objektivt samlingen av gener assosiert med fenotype.
Mens alle tilfeller i TCGA datasettet har blitt diagnostisert som glioblastom, forsinket tilbakefall i disse åtte tilfellene er mer karakteristisk for lavere klasse hjernesvulst. Derfor undersøkte vi om lavere klasse hjernesvulst er også preget av lavere nivåer av signaturen ved å analysere NCI Repository for Molecular Brain neoplasi Data (Rembrandt) datasettet, som inkluderte genuttrykk fra både glioblastom samt ulike typer av lavere klasse hjernesvulst. Tabell 3 viser at, ja, det er sterk berikelse (syv av de 64 genene i tabell 1 er blant de topp-rangert 30 differensielt uttrykte gener,
P
= 10
-13). Videre har vi funnet sterk sammenheng mellom uttrykket nivåer av metagene og kreftstamcelle markør CD44 (
P
= 5 × 10
-56 basert på montering Pearson korrelasjon til t-distribusjon). Figur 4 viser den tilsvarende spredningsdiagram. Nyere studier har vist at høye nivåer av CD44 blir uttrykt i cancer stamceller isolert fra flere forskjellige typer av tumorer [6], selv om dette konseptet er fortsatt i evolusjonen, og CD44 uttrykkes også i en rekke andre celletyper. CD44 er blitt funnet i en cellepopulasjon anriket for gliom stamceller [7]. Det er også mye uttrykt i glioblastom, og økte nivåer er assosiert med glioma progresjon og motstand mot terapi [8].
Hver prikk i spredningsdiagram representerer en glioma prøve fra NCI Repository for Molecular Brain neoplasi Data ( Rembrandt) datasett. Dots er fargekodet rødt for glioblastom og blått for lavere klasse hjernesvulst. Expression nivåer er RNA normalisert.
analyse av genuttrykk data har resultert i inndeling i ulike undergrupper av glioblastomas [9], [10], også til stede i lavere klasse hjernesvulst [11], med forskjellige funksjoner, er hver av disse, karakterisert ved nærvær av bestemte gener. Interessant, CD44 ble funnet anriket i mesenkymale subtypene i alle disse tilfellene. Funksjonen av vår nåværende resultater, er imidlertid at den mesenchymale overgang signatur som brukes i denne publikasjonen inneholder en biologisk prosess brukes for flere krefttyper, da det ble utledet ved å analysere dets nærvær i mange forskjellige krefttyper [1], i motsetning til ved bruk av klassifiserings metoder på glioma prøver alene for å identifisere undergrupper. Videre er samarbeid med fenotype funnet i fravær, heller enn tilstedeværelse, av signaturen.
For å bekrefte at den observerte assosiasjon med «Dager til tumorresidiv» fenotype er mer relatert til tilstedeværelsen av den mesenchymale overgang signatur, snarere enn til klassifiseringen til en mesenchymale subtype, utførte vi multivariat Cox regresjon på dager til tumorresidiv ved bruk av både de uttrykk verdiene av mesenchymal overgangen metagene og de fire subtyper [9] som kovarianter. Den undertype variabelen er en kategorisk variabel med fire typer (Mesenchymale, Klassisk, Neural og Proneural). Å antyde prøvene som subtyper ble ikke gitt i den opprinnelige papir, utførte vi en ti nærmeste nabo imputering basert på signatur gener av de fire undertyper som er gitt i [9]. Resultatet viser at mesenchymale overgang metagene uttrykk variabel er den eneste betydelige kovariat (med
P
= 0,049), mens resten av de kategoriske variablene ikke bestod signifikansnivå på 0,05 (minimum var 0.160 for mesenchymale subtype), som viser at de «Dager til tumorresidiv» fenotype er mest signifikant assosiert med mesenchymale overgang signatur. Resultatene av Cox regresjon er vist i tabell 4.
Å sammenligne direkte mesenchymale overgang signatur videre med at av Mesenchymale subtype av [9], vi opprettet en metagene for sistnevnte, slik at vi kan evaluere sin tilknytning til den «Dager til tumorresidiv» fenotype målt ved rang sum. Dette ble opprettet ved hjelp av genet liste som beskrevet i tilleggsinformasjon på papiret, tilgjengelig på https://tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/gbm_exp. Spesielt i den tilknyttede datafilen som inneholder uttrykket verdier og subtype samtaler for Core TCGA prøvene ved hjelp av enhetlig skalert data, er det 216 gener merket som mesenchymale. Disse genene ble rangert i form av deres kraft til å representere mesenchymale fenotype, som bestemmes av forskjellen mellom hvert gen er mesenchymale Tyngdepunktet komponent og sentroiden komponenten av de øvrige subtyper, som også kan betraktes som den log-gangers forandring mellom genets midlere verdi i mesenchymale subtype og genet samlede gjennomsnitts [12] (som sitert i datafilen inneholder ClaNC840 genet listen og centroids). Basert på denne rangering, valgte vi toppen 64, slik at størrelsen på de to metagenes som skal sammenlignes er identiske. Verdien av rang summen var 142 (det ville ha vært 151 hvis du bruker alle 216 gener). Dette bør sammenlignes med den tilsvarende verdi av 70 for mesenchymale overgang metagene og med de andre inntastinger av individuelle gener i tabell 2. Disse resultatene bekrefter ytterligere at den observerte assosiasjon med dager for å tumorresidiv er på grunn av den multi-kreft mesenchymale overgang signatur , som har den bemerkelsesverdige egenskapen at den tilsvarende metagene har lavere rang sum enn noen individuell genet.
Diskusjoner
Fordi hjernesvulst er ikke epiteliale kreftformer, og signaturen er også funnet i andre nonepithelial kreft , slik som neuroblastom og Ewings sarkom, representerer signatur en mer generell biologisk prosess av mesenchymale overgang, gjelder for alle faste kreft som vi prøvde. Faktisk, når sett av gener i tabell 1 er inngangen for Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [13] mot Molecular Signatures Database (MSigDB), er det mange resultater med
P
verdi nøyaktig lik » null, «tilsvarer gener uttrykt i høyere stadium prøver fra mange krefttyper, som nasopharyngeal, hode og nakke, urothelial, lymfomer, etc. slike typer kreft hadde ikke deltatt på noen måte i avledning av signaturen. Denne bemerkelsesverdige validering av signaturen ved å peke på alle slags typer kreft i MSigDB tyder på at signaturen kan gjenspeile en universell biologisk mekanisme av mesenchymale overgang til stede i invasiv stadium av alle solide kreftformer inkludert glioblastom. Analyse av relaterte datasett tyder på at det er flere berørte veier som består av en spesielt komplisert biologisk mekanisme som ser ut til å reaktivere embryonale utviklingsprogrammene. Faktisk, når du analyserer den 64-genet signatur mot MSigDB Gene Ontologi biologisk prosess datasett, de fem beste resultatene ble alle relatert til utvikling (skjelett, orgel, flercellet organisme, system, anatomisk struktur). Den fremtredende GO cellulære komponent var ekstracellulær matriks, og den fremstående GO molekyl funksjonen ble kollagen-binding.
Det har nylig blitt foreslått at «stemness» i tumorceller (kjennetegnes ved evnen til både å fornye seg selv, så vel som generere differensierte etterkommere) kan nært sammenvevd med passerer gjennom en EMT. For eksempel, ble EMT i noen modeller funnet å generere celler med egenskaper av stamceller [14], [15], [16], [17], [18]. Spesielt er det blitt vist at stilk-liknende celler isolert fra human brystcancer ko-uttrykker høye nivåer av CD44 og høye nivåer av mesenchymale markører, inkludert Slug [14]. Videre indusere EMT i udødeliggjorte humane bryst epitel-celler fører til høye nivåer av CD44 ekspresjon i mesenchymale-lignende celler [14]. Resistens har også vært knyttet til tilstedeværelsen av kreft stamceller [16], [18], [19], [20], som støtter forestillingen om at kreft stamceller kan være ansvarlig for tilbakefall etter terapeutisk intervensjon. Derfor, og gitt den sterke korrelasjonen av mesenchymale overgangs signatur med CD44, en mulig forklaring på fravær av mesenchymale overgang signatur hos pasienter med usedvanlig lang tid til å gjentakelse kan skyldes en tilsvarende mangel på stemness i kreftcellene i disse pasientene noe som gjør det mer sannsynlig for kreft å komme tilbake etter behandling. En alternativ forklaring på den observerte foreningen kan gis av omleggingen mot et mer mesenchymale fenotype [21].
Selv om det er flere EMT-induserende transkripsjonsfaktorer [22], hvorav noen er også funnet noen ganger oppregulert i den mesenchymale overgang signaturen karakterisert ved genene i tabell 1, er Slug den eneste funnet konsekvent oppregulert. Det var også bare slike transkripsjonsfaktor oppregulert i våre eksperimentelle xenotransplantater [5]. Slug har også nylig blitt funnet å være assosiert med invasivitet i glioma [23], i samsvar med de resultatene som er presentert her. Videre, når vi rangert alle gener i form av deres korrelasjon (med mulig gjensidig informasjon [24]) av deres uttrykk med at av Slug i de 99 prøvene som vi analysert her, fant vi at bemerkelsesverdig, de åtte oppføringer ( COL6A3, COL3A1, LUM, COL5A1, COL1A2, COL6A2, COL1A1, PCOLCE) var alle gener som inngår i begge tabellene 1 samt tabell 2, ytterligere støtte hypotesen om at Slug kan være en mester regulator av biologisk mekanisme ansvarlig for signaturen. Det ble nylig funnet [25], men at indusert overekspresjon av transkripsjonsfaktoren Twist i glioblastom fører til økt invasivitet og ekspresjon av flere av genene i tabell 1, omfattende Slug, noe som tyder på at vri kan spille en forårsakende rolle for mesenchymale overgang i glioblastom
Det samme signaturen ble også funnet å være prediktive for neoadjuvant terapi ved brystkreft -. se f.eks ytterligere fil 6 fra [1], hvori 7 av 8 prøver i klynge på venstre side av kartet varme (med lave nivåer av signaturen) hadde god respons på behandling, mens 12 av 14 prøver i den andre gruppen ( med høye nivåer av signaturen) var resistente.
de observasjoner som (a) alle GBM pasienter med usedvanlig lang tid å tilbakefall hadde ekstremt lave nivåer av mesenchymale overgang genet signatur, og (b) mesenchymale overgang signatur er sterkt beriket blant genene underexpressed i lavere klasse hjernesvulst i forhold til glioblastomas, tyder på at målretting den underliggende biologiske mekanismen kan levere en ny tilnærming for adjuvant behandling av hjernesvulst. Videre, evnen til å nøyaktig identifisere komponenter av genet signatur gir unike muligheter for å identifisere potensielle mål for slik behandling.
Takk
Vurdering uttrykkes professor Tian Zheng of Columbia University Department of Statistics for nyttige diskusjoner.
