Abstract
Selv om multiresistens-assosiert protein-1 (MRP1) er en stor bidragsyter til multi-legemiddelresistens ( MDR), fortsatt reguleringsmekanisme for Mrp1 uklart. Nrf2 er en transkripsjonsfaktor som regulerer cellulær forsvar respons gjennom antioksidant responselementer (Ares) i normalt vev. Nylig har Nrf2 dukket opp som en viktig bidragsyter til cellegift-motstand i tumorvev. I denne studien, ble rollen som Nrf2-ARE sti på regulering av Mrp1 undersøkt. Sammenlignet med H69 lungekreftceller, H69AR celler med MDR viste signifikant høyere Nrf2-ER sti aktivitet og ekspresjon av Mrp1 også. Når Nrf2 ble slått ned i H69AR celler, redusert MRP1 uttrykk tilsvarende. Videre disse H69AR celler med redusert Nrf2 nivå restaurert følsomhet for chemo-legemidler. Å utforske hvordan Nrf2-ARE pathway regulerer Mrp1, ble arrangøren av Mrp1 genet søkte, og to antatte Ares-are1 og ARE2-ble funnet. Ved hjelp av reporter gen og chip-analysen, både are1 og ARE2 viste respons og interaksjon med Nrf2. I 40 tilfeller av kreft vev, ble uttrykket av Nrf2 og MRP1 målt ved immunhistokjemi (IHC). Som kvantitative data for IHC er angitt, både Nrf2 og MRP1 viste signifikant høyere ekspresjon i svulstvev enn tilstøtende ikke-tumorvevet. Og enda viktigere, korrelasjonsanalyse av de to genene bevist at deres uttrykk var samsvarende. Til sammen teser data antydet at Nrf2-ARE pathway er nødvendig for regulatorisk uttrykk for Mrp1 og innblandet Nrf2 som et nytt terapeutisk mål for MDR
Citation. Ji L, Li H, Gao P, Shang G, Zhang DD Zhang N et al. (2013) Nrf2 Pathway Regulerer multiresistensassosierte Protein 1 i småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (5): e63404. doi: 10,1371 /journal.pone.0063404
Redaktør: Oliver Eickelberg, Helmholtz Zentrum München /Ludwig-Maximilians-universitetet München, Tyskland
mottatt: 03.02.2013; Godkjent: 02.04.2013; Publisert: 07.05.2013
Copyright: © 2013 Ji et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Bevilgninger gitt av Science and Technology Commission av Shanghai kommune (11ZR1402400 til TJ), https://www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm; Natural Science Foundation National of China (30900538 til HL), https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm; National Institute of Environmental Health (2R01 ES015010 til DDz), https://www.niehs.nih.gov/; og National Cancer Institute (R01 CA154377 til DDz), https://www.nci.cu.edu.eg/. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
multiresistens (MDR) er en stor hindring for behandling av ondartet kreft. Det er et fenomen hvor kreftcellene utviser redusert sensitivitet overfor en stor gruppe av ikke-relaterte legemidler med forskjellige virkningsmekanismer av farmakologisk aktivitet uansett om det skjer i primærbehandling (intrinsic) eller er ervervet under eller etter behandlingen [1]. Mekanistisk kan de motstands fenomener kan forklares ved en rekke aspekter, som inkluderer redusert akkumulering av legemidlet på grunn av over-ekspresjon av transportproteiner, økt avgiftning, endret mål og svekket apoptose sti [2]. En av de mest studerte aspekter av MDR er reduksjon av intracellulær akkumulering av legemidlet, hvor ATP bindende kassett (ABC) transportører uttrykt på plasmamembranen er notoriske mediatorer av MDR [3].
multilegemiddelresistens tilknyttede proteints (MRP) tilhører underfamilien C i ABC transportør super (ABCC). Hos menneske er MRP-familien består av flere elementer (MRP1-MRP9), av hvilke, spiller MRP1 en meget viktig rolle i MDR. Som en av medikamentet transport av ABCC proteiner, ble først klonet MRP1 høyt over-uttrykt i en doksorubicin-valgt multimedikamentresistent human lunge-carcinom-cellelinje H69AR [4]. I tumorceller, kan 190 kDa MRP1 gi resistens mot ikke bare doxorubicin, men også mange andre brukte anti-neoplastisk medikament, så som metotreksat (MTX), daunorubicin, vincristin og etoposid [5].
Selv om MRP1 har dukket opp som en viktig bidragsyter til chemoresistance, har den molekylære mekanismen for induksjon av MRP1 ikke avklart. Flere regulatoriske elementer som allerede har blitt identifisert til å styre ekspresjonen og induserbarhet av et maskinlesbart pass [6], [7], [8]. Det er imidlertid betydelig bevis som viser induksjon av fase II-enzymer og et maskinlesbart pass er lik. [9], [10], [11]. Som induksjon av fase II-enzymer er hovedsakelig formidlet gjennom antioksydant responselementer (ER eller EpREs) [12], tyder det på at den mest sannsynlige kandidat for en felles regulering av ekspresjon av et maskinlesbart pass er også ER [13], som har en felles 5 «- (G /A) TGACnnnGC (G./A) -3» motiv [14]. Nylig, i musen MRP2 [15], [16], MRP3 og Mrp4 genet [16], ER-lignende sekvenser ble identifisert, noe som tyder på en mulig rolle ARE motiv i den regulatoriske uttrykk for Mrp1. For eksempel er både γ-GCS, er velkjente anti-oxidant-enzym og MRP1 alle indusert av oksidativt stress [17]. Det vist at ekspresjon av MRP1 kan være oppregulert ved redoks-aktive forbindelser, quercetin i MCF-7-celler [18]. Imidlertid er ytterligere rapportørgenet analyse indikerte at en kandidat ER motivet lokalisert i den proksimale promoteren til genet Mrp1 syntes å være irrelevant for induksjon. Senere, en antatt ER /AP-en bindingssetet på -511 til -477 oppstrøms for transkripsjonsstartplassen i menneskelig Mrp1 genet ble identifisert og fungerte som en transkripsjons Enhancer [19]. Imidlertid, er det fremdeles ikke mediere induksjon av et luciferase reporter-gen ved β-naphthoflavone behandling, noe som antyder at det kan en annen ER (e) eksistere [19]. Selv om studien ved bruk av Nrf2 villtype og knockout mus embryo-fibroblaster bekreftet at Nrf2 er nødvendig for den konstitutive og induserbare ekspresjon av MRP1 [20], hvor Nrf2 medierer den transkripsjonelle aktivering av Mrp1 er uklar, siden den nøyaktige ARE (e) ikke ble identifisert ennå.
Nrf2 ble identifisert som den viktigste transkripsjonsfaktor som formidler ARE-drevet transkripsjon [12]. Den regulerer antioksidant respons ved å innføre uttrykket av gener som bærer en er i sitt regulatoriske regioner som NQO1, GCS, og HO-1 [21], [22], [23], det er negativt regulert av Kelch lignende ECH -associated protein 1 (Keap 1), et substrat adapter for Cul3 avhengige E3 ubiquitin ligase kompleks [24]. Aktivering av Nrf2 pathway komponerer et celledelt beskyttende system som fremmer celleoverlevelse i henhold skadelige miljøer [25], [26]. Imidlertid har nyere studier vist at konstitutivt høyt nivå av Nrf2 fremmer kreft dannelse og bidrar til chemoresistance [27], [28], [29], [30], som kalles mørke siden av Nrf2 svei. Nedregulering av Nrf2 sensitizes celler overfor kjemoterapeutiske midler, mens opp regulering forbedrer motstand i forskjellige kreftceller [31], [32], [33], [34]. I ytterligere støtte fra en rolle for Nrf2 i chemoresistance, er uttrykk for Nrf2 i kreftceller økte i oppkjøpet av legemiddelresistens [35], [36]. Sammen er disse resultater viser at Nrf2 bidrar til chemoresistance observert i mange typer kreft. Men hvordan Nrf2 spiller en rolle er fremdeles ukjent. For eksempel, som molekylær som er tett regulert av Nrf2 veien er ansvarlig for chemoresistance? Er MRP1 en av kandidatene?
I denne studien undersøkte vi den regulerende rolle Nrf2 på Mrp1 uttrykk ikke bare i dyrkede cellenivå, men også i kreftpasienter «vev. Vi demonstrerte Mrp1 er en av de Nrf2 nedstrøms gener, som vi ARE bekreftet to motiver i promoterregionen av Mrp1 genet. Det er dessuten en høy korrelasjon mellom Mrp1 og Nrf2 ekspresjon i forskjellige typer av maligne svulster. I et ord, som mer og mer oppmerksomhet ble betalt til rollen Nrf2 i chemoresistance, vår studie viste den detaljerte mekanismen for hvordan Nrf2 spiller sin negative rolle.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
tillatelse til å bruke vev seksjoner for forskningsformål ble innhentet og godkjent av etikkomiteen fra Shanghai Medical College, Fudan University, Kina, og en skriftlig samtykkeerklæring ble innhentet fra alle pasienter.
reagenser
polyklonale antistoffer, inkludert anti-Nrf2, Mrp1, MRP2, Tubulin, β-actin ble alle kjøpt fra Santa Cruz Inc. (CA, USA). Tert-butylhydrokinon (TBHQ), sulforaphane (SFN) og alle kjemikalier inkludert cisplatin, doksorubicin og etoposid var kjøp fra Sigma Co. (St. Louis, Missouri, USA). Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem ble kjøpt fra Promega (Madison, WI, USA). Alle reagenser var analysekvalitet.
Cellelinjer, cellekultur og cellelevedyktigheten analysen
Småcellet lungekreft cellelinje H69, multiresistent småcellet lungekreft cellelinje H69AR, og MDA-MB -231-cellelinjen ble anskaffet fra ATCC (Manassas, VA, USA). H69 og H69AR celler ble opprettholdt i ATCC-formulert RPMI-1640 medium, supplert med 10% og 20% (v /v) føtalt bovint serum hhv. MDA-MB-231 ble dyrket på ATCC-formulert Leibovitz L-15 medium med 10% (v /v) føtalt bovint serum. Alle kulturer ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO2-atmosfære. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) assay basert på den funksjonelle endring av mitokondrier i løpet av celledød.
Rekombinant DNA
Et par av primere designet inneholder Xho i og Hind III nettsider for å oppnå 992 bp promoter-regionen, -817 til 175 med nummerering i forhold til transkripsjonsstartsetet (1), av den menneskelige Mrp1 gen fra humant genomisk DNA ved PCR. Ytterligere fire par av primere ble utformet for å klone de to mulige er elementer innenfor promoter regionen Mrp1 genet og deres mutanter deretter. De amplifiserte produkter ble renset og spaltet med restriksjonsendonuklease, og deretter klonet inn i pGL3-basis (Promega, Madison, WI). Sekvensene av primere ble oppført i tabell 1.
siRNA transfeksjon og luciferasereportergenet analysen
Nrf2 siRNA og Hiperfect transfeksjon reagens ble kjøpt fra Qiagen (Valencia, CA) og transfeksjon av Nrf2 siRNA ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. For luciferase reportergen-analyse ble celler transfektert med luciferase reporter-plasmider for Mrp1 genpromoter, Ares, mutanter og Renilla luciferase, sammen med en ekspresjonsvektor for HA-Nrf2. Firefly og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved hjelp av en dual-luciferasereportergenet analysesystem (Promega, Madison, WI) og analysert på en GloMax 20/20 luminometer (Promega, Madison, WI).
Chromatin immunoprecipitation (Chip )
ChIP analyse ble utført i henhold til protokoller som tilbys av Upstate (en del av Millipore, MA). I korthet, MDA-MB-231 celler eller H69AR celler eller H69-celler (ca. 4 x 10
7) ble kryssbundet med formaldehyd, oppsamlet i PBS, resuspendert i SDS-lyseringsbuffer og sonikert på is. Lysatene ble deretter fortynnet med Chip fortynningsbuffer, pre-erte protein med Agarose, og deretter inkubert med angitte antistoffer (4 ug /prøve) over natten. Immunkompleksene ble samlet opp med protein A-agarose, vasket og eluert. DNA-proteinkryssbindinger ble reversert og DNA ble gjenvunnet. Relative mengder av DNA i komplekset ble kvantifisert ved real-time PCR ved hjelp LightCycler 480 DNA SYBR grønn jeg kit (Roche). Primerne vist i tabell 2 ble utformet i henhold til er sekvenser innenfor promoter-regionen i Mrp1 genet. Den klare, ER sekvens av NQO1-genet ble anvendt som positiv kontroll for Nrf2 interaksjon og promotersekvensen av Tubulin-genet som negativ kontroll. Brikken analysen ble gjentatt 3 ganger.
kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR), immunoblot analyse
Når cellene ble høstet, totalt RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol løsning ( Invitrogen, Carlsbad, California). Like mengder av RNA (2 pg) ble revers-transkribert ved hjelp av Transcriptor First Strand cDNA syntese-sett (Roche, IN, USA). Primerne anvendt i neste PCR-analyse ble oppført i tabell 2. Den qPCR Betingelsene var som følger: en innledende syklus på denaturering (95 ° C i 30 s), 40 amplifikasjonssykluser (denaturering ved 95 ° C i 5 s, annealing ved 60 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 30 s), etterfulgt av en avkjølingsperiode (50 ° C i 5 s). Relativ mRNA uttrykk ble bestemt ved bruk av Rotor-Gene 3000 som sysselsetter en endring av delta-deltaet Ct metode som justerer for forsterkning effektivitet mellom mål og husholdningsgener. PCR-data ble uttrykt som relativ ganger endring av målgenet mellom behandlede og kontrollgrupper. Syklusen punkt (CP) verdier ble analysert ved t-test for å bestemme en P-verdi.
For immunoblot-analyse ble celler homogenisert i lyserings smør (0,1 M Tris-buffer (pH 7,4), 0,1 mM EDTA) i nærvær av 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og protease-inhibitor cocktail (Roche, iN, USA). Den tilsvarende mengde av prøven ble applisert i hver brønn av en 7,5% gel og underkastet SDS-PAGE. Geler ble overført til nitrocellulosemembran. Membranen ble deretter inkubert med primære antistoffer til 4 ° C over natten mot Nrf2 (110 KD), MRP1 (190 KD), og MRP2 (~170 KD). Etter vasking med TBS-T, ble membranen inkubert med sekundært antistoff mot kanin-IgG, og mus, og de signaler som ble visualisert ved anvendelse ECL western blotting pluss system. Alle forsøkene nevnt ovenfor ble utført i tre eksemplarer med mindre annet er angitt.
Pasienter og immunhistokjemisk analyse
vev (n = 40), inkludert magekreft (n = 10), brystkreft (n = 10 ), ble tykktarmskreft (n = 10) og småcellet lungekreft (n = 10) hentet fra Avdeling for patologi, Shanghai Huashan Hospital, Kina, innen 2007. Alle saker ble diagnostisert med 2 patologer individuelt i en dobbeltblind måte . De parafinsnitt ble farget med hematoksylin og eosin (H E). For immunhistokjemisk analyse, ble deparaffinized seksjonene utført antigen gjenfinning ved oppvarming i natriumcitratbuffer, pH 6,0. Det primære antistoff ble anvendt i en fortynning på 1:100 (NQO1 og Nrf2) og 01:50 (Mrp1) i 1 time ved 37 ° C og 4 ° C over natten. Anti-Nrf2 polyklonale antistoff (ab76026) og anti-Mrp1 monoklonalt antistoff (ab24102) ble kjøpt fra Abcam. Monoklonalt antistoff mot NQO1 (SC-271116) ble kjøpt fra Santa Cruz. De fargede seksjonene ble fotografert under et lysmikroskop ved 400x forstørrelse, og ble analysert ved i-Solution programvare (IMT i-løsning INC., Vancouver, BC, Canada). Fem tilfeldig synsfelt i hvert snitt ble utvalgt og analysert, og det positive område ble beregnet, som er viste i prosent (forholdet mellom positive område til hele synsfeltet).
Statistisk analyse
Resultatene ble uttrykt som middel ± SD. Statistiske tester ble utført ved anvendelse av SPSS Statistisk 19. Uparet Student t tester ble benyttet for å sammenligne hjelp av to grupper. Enveis ANOVA ble brukt til å sammenligne hjelp av tre eller flere grupper. The Pearson korrelasjonsanalyse ble utført for å sammenligne uttrykket nivået av Nrf2, Mrp1 og NQO1 av toere. De eksperimentelle forskjeller ble bestemt av tosidige t-test og p 0,05 ble tatt som signifikant forskjell i alle tilfeller
Resultater
I motsetning til H69 celler, har H69AR celler høyere Nrf2. pathway aktivering og Mrp1 uttrykk nivå
på basal nivå, ble aktivering av Nrf2 sti forhold mellom H69 og H69AR celler. Nedstrøms gener av Nrf2, slik som NQO1, HO-1 og GST viste økt mRNA-ekspresjon i H69AR celler, men det var ingen signifikant forskjell i TXN mRNA ekspresjon (figur 1, felt A, * P 0,05 vs. H69-celler). Interessant er det var en høyere Nrf2 mRNA-nivået i cellene H69AR enn H69-celler, uten noen forskjell i Keap1-genet (figur 1, felt A, * P 0,05 vs. H69-celler). Både Mrp1 og MRP2 gen viste høyere mRNA-nivå i H69AR celler, spesielt Mrp1 hadde mer enn 70 ganger i H69AR celler til H69-celler (figur 1, felt A, * P 0,05 vs. H69-celler). Neste proteinnivået av Nrf2 ble målt i de to cellelinjene. I samsvar med endringene i mRNA nivå, H69AR cellene hadde høyere Nrf2 pathway aktivering enn H69 celler (Figur 1, panel B) i proteinnivå. Videre Mrp1 og MRP2 viste også øket ekspresjon i H69AR-celler (figur 1, felt B). Interessant, de store negative regulator av Nrf2, Keap1 viste ingen forskjell mellom de to cellelinjene (Figur 1, panel B). Tatt i betraktning de viktige rollene som Mrp1 og MRP2 spille, H69AR celler har multi-chemo narkotika motstand på grunn av det høye nivået av Mrp1 og MRP2. Som våre MTT data indikerte, H69AR cellene hadde mer levedyktighet hastighet med behandling chemo narkotika, slik som doxorubicin, Cisplatin og Etoposid (Figur 1, panel C, D og E, * P 0,05 vs. H69 celler).
(A) Relativ mRNA nivå av Nrf2, Keap1, Mrp1, MRP2, sammen med NQO1, HO-1, GST og txn ble sammenlignet i H69 og H69AR celler ved real-time RT-PCR bruker ΔΔCt metoden med GAPDH som en intern kontroll. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (B) Protein nivået av Keap1, Nrf2, Mrp1, MRP2 ble sammenlignet i H69 og H69AR celler ved Western blotting ved hjelp Tubulin som intern kontroll. Eksperimenter ble utført tre ganger og en representativ immunoblot ble vist her. (C), (D) og (E) Levedyktigheten av H69 og H69AR celler med behandling av Dox, Cisplatin og Etoposid i forskjellige doser i 24 timer ble bestemt ved MTT-assay. De eksperimentelle forskjeller ble bestemt av tosidige t-test og p 0,05 ble tatt som en betydelig forskjell i alle tilfeller
knockdown av Nrf2 fører til redusert Mrp1 uttrykk og sensitive H69AR celler til multi. -chemo narkotika
for å analysere regulering av Mrp1 av Nrf2, ble bestemt siRNA brukt til å slå ned Nrf2 uttrykk. Som dataene viser, ble ekspresjonen av Nrf2 redusert mer enn 50% i motsetning til den mock-gruppen (figur 2, felt A). Enda viktigere, proteinnivået av MRP1 ble også redusert tilsvarende (figur 2, felt A), noe som betyr at Mrp1 kan reguleres ved Nrf2 pathway. Som H69AR viste motstand multi-chemo narkotika, neste motstanden ble målt igjen når uttrykk for Nrf2 ble slått ned. Som forventet, H69AR celler gjen følsomhet for alle de tre chemo legemidler inkludert doksorubicin, cisplatin og etoposid, når det bestemte siRNA ble brukt til å redusere i betydelig grad ekspresjonen av Nrf2 (figur 2, felt B, C og D, * P 0,05 vs. mock-gruppen). Sammen er disse dataene indikerte mulige rolle Nrf2 på regulering av Mrp1 og bekreftet rollen Nrf2 i chemo-motstand.
(A) H69AR celler ble utført transfeksjon av Nrf2 siRNA (10 nM og 50 nM) for 72 timer. Protein uttrykk for Nrf2 og Mrp1 ble bestemt ved western blotting ved hjelp av β-actin som intern kontroll. Eksperimenter ble utført tre ganger og en representativ immunoblot ble vist her. (B), (C) og (D) H69AR celler ble underkastet knockdown av Nrf2 med siRNA transfeksjon. Førti-åtte timer senere ble cellene behandlet med Dox, cisplatin og Etoposid i forskjellige doser i ytterligere 24 timer, og de ble deretter utsatt for MTT-analyse for å måle cellenes levedyktighet. De eksperimentelle forskjeller ble bestemt av tosidige t-test og p 0,05 ble tatt som en betydelig forskjell i alle tilfeller
5′-flankerende område av den menneskelige Mrp1 genet inneholder to er. sekvenser
for å bestemme nærværet av ARE-sekvensen i 5′-flankerende region av det humane Mrp1-genet, ble et 992 bp langt fragment klonet og sekvensert fra nukleotidene -817 til 175 med nummerering i forhold til transkripsjons startsetet (angitt som en i figur 3). Nukleotidsekvensen av den 5′-flankerende region av det humane Mrp1-genet ble vist i figur 3. transkripsjonsstartsetet ble satt til å være ved 5′-enden av mRNA-sekvensen Mrp1 med den lengste 5′-utranslaterte område, og er lokalisert 175 basepar oppstrøms av oversettelsen startwebstedet (uthevet i figur 3). En rekke cis-virkende sekvenser ble identifisert. Interessant, to ER-lignende sekvenser ble funnet i isolerte områder: en i posisjonene -499 til -490 (ER-1; gTGActcaGC, med små bokstaver indikerer ikke-konservert baser) og den andre i posisjoner -66 til -57 (ER-2; gTGAgcggGC). De to er sekvensene var identiske med de som tidligere er rapportert minimal ARE enhancer sekvens (a /g) TGA (C /T /G) nnnGC [37]. Nukleotidene som skal muteres ble fremhevet i fet kursiv i Figur 3.
nukleotider ble nummerert i forhold til transkripsjon start stedet (1). Translasjons-initierings-kodonet (ATG) var i fet skrift. Boxed region indikert are1 og ARE2 hhv. Nukleotidene som skal muteres i denne studien var i fet kursiv.
Nrf2-mediert induksjon av Mrp1 promoter aktivitet avhenger både av are1 og ARE2
For å undersøke responsen til 5 « tilgrensende område av Mrp1 til Nrf2, ble dobbelt luciferase reportergen-målingen ble utført. For det første ble det 992-bp-fragmentet amplifisert ved hjelp av PCR av humant genomisk DNA med primere som var oppført i tabell 1, og deretter PCR-produktet ble klonet inn i pGL3-basisvektor og navngitte pGL3-wt. For det andre, basert på pGL3-vekt, de to antatte Ares og muterte Ares ble forsterket og klonet inn pGL3-basisvektoren, som ble kåret til pGL3-are1, pGL3-ARE2, pGL3-ΔARE1 og pGL3-ΔARE2 (det muterte nukleotider ble fremhevet i fet kursiv i tabell 1). Reporteren analysen viste at Nrf2 indusert arrangøren aktiviteten Mrp1 gen etter co-transfeksjon av pGL3-vekt med Nrf2 uttrykker plasmid (figur 4, panel A, * P 0,05 vs. kontroll). Det viste også at induksjon av Mrp1 promoter aktivitet var assosiert med de to antatte Ares, siden begge var oppregulert ved overekspresjon av Nrf2. Videre mutasjon av dem ablateres induksjonstilsvarende (figur 4, panel A, ** P 0,05 vs. kontroll, *** P 0,05 vs kontroll). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i induksjon mellom de to Ares. I tillegg NQO1 ER-Luc ble anvendt som en positiv kontroll for å sikre gyldigheten av hele analysen, og immunoblot assay ble utført for å sikre at overekspresjon av Nrf2 var ganske tilsvarende (figur 4, A, øvre panel).
(A) 231 celler ble transfektert med fem luciferaserapportørplasmid konstruksjoner (wt-Luc, are1-Luc, ARE2-Luc, ΔARE1-Luc og ΔARE2-Luc), og promoterless pGL3-basic (pGL3-Luc) NQO1-ARE-Luc og PRL-TK ble brukt som negativ kontroll, positiv kontroll og intern kontroll, henholdsvis. De foran nevnte plasmidene ble ko-transfektert med eller uten Nrf2-ekspresjonsplasmid. Etter 48 timer ble cellene høstet og luciferase-aktivitet ble målt med en dual-luciferase-analysesystem (nedre panel). Data var middel ± SD av verdier fra tre uavhengige forsøk. Den lik mengde transfeksjon av Nrf2 ble forsikret av western Blot (øvre panel). (B) 231-celler ble behandlet med 40 uM TBHQ for det angitte tidspunkt, og deretter ble høstet for å bli utsatt for immunblot for å måle Nrf2 proteinnivå. Eksperimenter ble utført tre ganger og en representativ immunoblot ble vist her. (C), (D), (E) og (F) for 231-cellene ble behandlet eller ikke med 40 uM TBHQ i 24 timer og ble tverrbundet med formaldehyd. Sonikert kromatin ble underkastet immunoutfelling med antistoffer mot Nrf2 eller normal IgG. Utfelt DNA ble etterfulgt av realtime PCR-analyse med primere mot Mrp1 are1 (panel C), Mrp1 ARE2 (panel D), NQO1 ER (panel E) og Tubulin promoter (panel F). Eksperimenter ble utført tre ganger og en representant for tre forsøk ble vist her.
Neste, for å bekrefte den sanne binding av Nrf2 med de to antatte Ares, ble ChIP analyse utført både i 231 celler og småcellet lungecancerceller. I henhold til immunoblot-analyse av Nrf2 behandlet med TBHQ i 231-celler, den velkjente Nrf2 veien inducer, en passende behandlingstiden av TBHQ, ble 24 timers innstilt (figur 4, felt B). Så 231 celler (4 × 107) ble behandlet med 40 mikrometer TBHQ i 24 timer, og deretter ble høstet til gjenstand for ChIP analysen. Sammenlignet med den negative kontroll, bindingen med are1 ved Nrf2 ble økt signifikant (figur 4, felt C, * P 0,05). Videre behandling med TBHQ gjort bindende økt mye mer høyere (figur 4, panel C,
# P 0,05). Tilsvarende ARE2 viste også bindende med Nrf2 med eller uten TBHQ behandling (figur 4, panel D, * P 0,05,
# P 0,05). Imidlertid er bindingen av Nrf2 med ARE2 var lavere enn are1 i både basal nivå og TBHQ behandlingsnivå. Som uttrykk for Nrf2 var mye høyere i H69AR celler enn H69-celler (figur 1, felt B), ved utførte vi en komparativ CHIP analyse for å teste om økt Nrf2 i H69AR-celler ble bundet til are1 og ARE2 elementer i Mrp1 promoter. I samsvar med våre forventninger, bindingen med are1 av Nrf2 ble økt betydelig i H69AR celler sammenlignet med H69 celler (Figur 5, panel A, * P 0,05). Tilsvarende bindingsresultater med ARE2 ble også funnet (figur 5, panel B, * P 0,05). Dette kan tyde på en molekylær forklaring for økt MRP1 uttrykk i H69AR celler. Dessuten, bindingen av Nrf2 med ARE2 var lavere enn are1 i begge H69 og H69AR celler, som var i samsvar med resultatene i 231-celler. De positive og negative kontroller chip assay sikre forsøket var troverdig og dataene ble faststoff (figur 4, panel E og F, og figur 5, panel C og D). Sammen er disse data viser at de to antatte Ares innenfor Mrp1 gen promoter-regionen var virkelige Ares som kan reguleres av Nrf2.
H69 og H69AR celler ble tverrbundet med formaldehyd. Sonikert kromatin ble underkastet immunoutfelling med antistoffer mot Nrf2 eller normal IgG. Utfelt DNA ble etterfulgt av realtime PCR-analyse med primere mot Mrp1 are1 (panel A), Mrp1 ARE2 (panel B), NQO1 ER (panel C) og Tubulin promoter (panel D). Eksperimenter ble utført tre ganger og en representant for tre forsøk ble vist her.
Den uttrykk for Nrf2 og Mrp1 var samsvarende og høyere i ondartede svulster enn ved ikke-svulstvev
Helt , 40 tilfeller av ondartede tumorer, inkludert lungekreft, brystkreft, magekreft og kreft i tykktarmen, ble valgt for å måle
in vivo
ekspresjon av Nrf2, Mrp1, og NQO1 samt av IHC. For lungekreft, bare de sakene som ble diagnostisert med småcellet lungekreft (SCLC), hvor både H69 og H69AR celler stammer form, ble valgt. Sammenlignet med den tilstøtende ikke-svulstvev, kreft vev lunge viste dramatisk høyere uttrykk for Nrf2, Mrp1 og NQO1 (Figur 6, sammenligne panel b2 til A2, B3 til A3, B4 til a4). HE flekker i panelet igjen meste avslørte ondartet hyperplasi og tilstøtende ikke-svulstvev, som er nyttig for å lokalisere den positive signal i IHC-farget seksjoner. I tilstøtende ikke-tumorvev, Nrf2 hovedsakelig uttrykt i kjernen av epiteliale celler (figur 6, panel a2), og ekspresjonen av Mrp1 ble vist både på cellemembraner og i cytoplasma (figur 6, panel a3). For å vise den kjernefysiske lokalisering av Nrf2, et valgt område innenfor hvert bilde av Nrf2 flekker var forstørret og fusjonert inn i det originale bildet øverst i venstre hjørne (Figur 6, panel a2-h2, svart pil). Det var vanskelig å se noen åpenbar NQO1 uttrykk unntatt svak positivt signal i spredte celler i tilstøtende ikke-svulstvev (Figur 6, panel a4). I kreftvev lunge, var uttrykk for Nrf2 begrenset i kreftcelle knuter unntatt nekrotiske senter celler. Både cytoplasma og kjerner viste Nrf2 uttrykk, som var mye sterkere enn tilstøtende ikke-tumorvevet (figur 6, panel b2). I en tilsvarende uttrykker mønster med Nrf2, Mrp1 også uttrykt åpenbart og diffust i knuter av lungekreft (figur 6, panel b3). Som en nedstrøms gen av Nrf2, den uttrykker mønster av NQO var lik med Nrf2 (figur 6, panel b4). Det var vanskelig å se noen uttrykk for Nrf2, Mrp1 og NQO1 i interstitiell vev. Brystkreft vev, er ekspresjonen av Nrf2, Mrp1 og NQO1 var signifikant høy (figur 6, panel d2, d3 og d4), selv om mild ekspresjon av dem kan sees i tilstøtende ikke-tumorvevet (figur 6, panel c2, c3 og c4). De tre gener i magekreft og kreft i tykktarmen var like i å uttrykke mønster, nemlig ekspresjonen av dem i tumorvev var mye høyere enn i tilstøtende ikke-tumorvevet (figur 6, panel e1 til h4). Videre IHC flekker data indikerte en mulig sammenheng mellom Nrf2 og Mrp1 uttrykk.
ufargede vev lysbilder fra småcellet lungekreft, magekreft, brystkreft og tykktarmskreft var gjenstand for HE flekker (a1 til H1) og IHC farging med antistoffer mot Nrf2 (a2 til H2), Mrp1 (a3 til h3) og NQO1 (a4 til h4). Baren vekter ble merket nederst i høyre hjørne på hver bilder.
Deretter IHC flekker seksjonene ble analysert og målt ved programvare, i-løsning for å kvantifisere uttrykk for Nrf2, Mrp1 og NQO1 i alle tilfeller. Uttrykket ble presentert som forholdet mellom positive område for hele området. I alle de fire kreftvev, Nrf2, Mrp1 og NQO1 viste signifikant høyere ekspresjon i kontrast med tilstøtende ikke-tumorvevet (figur 7, panel A, * P 0,05 vs normalt vev, henholdsvis). For å bekrefte sammenhengen av deres uttrykk ved toere, ble Pearson korrelasjon test neste utført. I lungevev, inkludert både tumorvev og tilstøtende ikke-svulstvev, Pearsons korrelasjonskoeffisient (r) mellom Nrf2 og Mrp1 tilsvarer 0,899 (Figur 7, panel B, øverst til venstre, ** P 0,001), noe som betyr uttrykket av de to genene var samsvarende. Som en av de nedstrøms gener Nrf2, er ekspresjon av NQO1 regulert av Nrf2, slik at r er lik 0,820 (figur 7, panel B, øverst til venstre, ** P 0,005), noe som bekreftet regulering av NQO1 ved Nrf2. I likhet med korrelasjon av Nrf2 og Mrp1 i lungevev, alle andre 3 vev viste dette signifikant korrelasjon også, for eksempel magen vev (Figur 7, panel B, øverst til høyre), brystvevet (Figur 7, panel B, nederst til venstre) og tykktarms vev (Figur 7, panel B, nederst til høyre). Derfor er disse flekker data og statistisk analyse viste både Nrf2 og Mrp1 ble uttrykt mye høyere i svulstvev enn ved ikke-svulstvev, og mer viktig, uttrykket av de to genene var samsvarende.
Fem tilfeldige synsfelt
