Abstract
Hemming av ubiquitin-proteasome system (UPS) av protein degradering er en gyldig anti-kreft strategi og har ført til godkjenning av bortezomib for behandling av myelomatose. Imidlertid er det alternativ tilnærming for å øke nedbrytningen av oncoproteiner som ofte overuttrykt i kreft mindre utviklet. Betulinsyre (BA) er en plante-avledet lite molekyl som kan øke apoptose spesielt i kreft, men ikke i normale celler, noe som gjør det til et attraktivt middel mot kreft. Våre resultater i prostata kreft antydet at BA hemmet flere deubiquitinases (Dubs), noe som resulterte i akkumulering av poly-ubiquitinmolekyler, redusert nivå av oncoproteiner, og økt apoptotisk celledød. I normale fibroblaster, men BA hemmet ikke DUB aktivitet eller økte totale poly-ubiquitinmolekyler, som var forbundet med manglende effekt på celledød. I TRAMP transgen musemodell for prostatakreft, behandling med BA (10 mg /kg) hemmet primære svulster, økt apoptose, redusert angiogenese og proliferasjon, og senkes androgen-reseptoren og cyklin D1 protein. BA behandling inhiberte også DUB aktivitet og økt ubiquitinmolekyler i TRAMP prostata cancer, men hadde ingen effekt på apoptose eller ubiquitinering i normalt musevev. Alt i alt tyder våre data på at BA-mediert inhibering av Dubs og induksjon av celledød ved apoptose spesielt i prostata cancer, men ikke i normale celler og vev kan tilveiebringe en effektiv ikke-toksisk og klinisk selektivt middel for kjemoterapi.
Citation : Reiner T, Parrondo R, de las Pozas A, Palenzuela D, Perez-Stabil C (2013) Betulinic Acid selektivt Øker protein degradering og Forbedrer prostatakreft Spesifikke Apoptose: Mulig rolle for Hemming av Deubiquitinase aktivitet. PLoS ONE 8 (2): e56234. doi: 10,1371 /journal.pone.0056234
Redaktør: Paul J. Galardy, Mayo Clinic, USA
mottatt: 12. april 2012; Godkjent: 11 januar 2013; Publisert: 12 februar 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Veterans Affairs Merit omtale 6996,06 MR https://www.research.va.gov/programs/blrd/merit_review.cfm. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i kraft av deres høye proliferative kapasitet, kreftceller ofte svare til akkumulering av ufoldete proteiner eller proteotoxic belastning ved å øke ubiquitin-proteasom system (UPS) for å motstå apoptotisk celledød [1]. UPS er den viktigste cellulære bane som degraderer proteiner utfoldete og styrer uttrykket nivåer av spesifikke proteiner er viktige i cellesyklus, proliferasjon, apoptose og [2]. Proteiner er målrettet for UPS-mediert nedbrytning ved tilsetning av flere ubiquitin-enheter (poly-UB), noe som letter gjenkjenning og degradering av UPS-komplekset. Inhibering av UPS og påfølgende økning i flere proteiner er en gyldig anti-kreft strategi som har ført til utviklingen av bortezomib, godkjente FDA et medikament for behandling av multippel myelom [3]. Klinisk er imidlertid bortezomib alene viser ikke vesentlig aktivitet i kastrering resistent prostatakreft (CRPC) og er ofte forbundet med dosebegrensende bivirkninger slik som nevropati [4].
En alternativ, men mindre utviklet terapeutisk strategi er å utnytte UPS ved å forbedre dens aktivitet og spesifisitet for å øke nedbrytningen av spredning og pro-overlevelse proteiner som ofte overuttrykt i kreftformer, dvs. oncoproteiner. En mulig og klinisk relevante metode er å forfølge identifisering av små molekyler som kan aktivere UPS-mediert nedbrytning av proteiner slik som androgen reseptor (AR) i prostatakreft (PC). Betulinsyre (BA) er en plante-avledet lite molekyl som kan øke apoptose i kreftceller, og dermed gjøre det til et attraktivt middel mot kreft [5]. I dag er BA en av bare to små molekyler som rapporteres til direkte aktivere chymotypsinlignende UPS aktivitet
in vitro product: [6], [7]. En annen rapport viser at BA hemmer veksten av LNCaP-celler PC ved selektiv aktivering UPS-avhengig nedbrytning av AR, så vel som spesifisiteten protein (Sp) transkripsjonsfaktorer som regulerer VEGF ekspresjon [8]. Imidlertid er mekanismene som BA aktiverer spesifikt UPS-avhengig nedbrytning av AR og andre faktorer er kjent.
I tillegg til å stimulere UPS aktivitet, en annen mulig måte BA kan øke degraderingen av spesifikke proteiner er ved å hemme deubiquitinases ( Dubs). Reversible ubiquitinering er en viktig mekanisme i reguleringen av UPS og i vedlikehold av mange cellesyklus og pro-overlevelses-proteiner [9] – [11]. Nyere funn tyder på at Dubs spille viktige regulatoriske roller i de fleste veier som involverer Ub [9] – [11]. Omtrent hundre mennesker Dubs faller inn i fem klasser, de beste kjennetegnet blir ubiquitin-spesifikke proteaser (USP) og ubiquitin C-terminal hydrolaser (UCH). DUB-mediert fjerning av poly-Ub fra viktige proteiner gjør dem mindre utsatt for nedbrytning på grunn av UPS og øker dermed nivåene. Faktisk er flere Dubs overexpressed i kreft og anses å være onkogener [9] – [11]
Fordi Dubs har en rolle i onkogene transformasjon, har nylig oppmerksomheten fokusert på identifisering av små molekyl hemmere av. Dubs. Tanken er at hemmer Dubs vil heve poly-Ub på teinene og øke sin anerkjennelse og nedbrytning av UPS vei, noe som resulterer i større apoptose og forbedret legemidlets effekt [12]. Flere lavmolekylære inhibitorer av DUB-aktivitet har blitt identifisert for å øke akkumuleringen av poly-UB proteiner og øke apoptose i kreftceller, tyder på at DUB-inhibitorer er lovende antikreftmidler [13] – [18]. I denne rapporten viste vi at evnen til BA for å øke nedbrytningen av flere sprednings- og pro-overlevelse proteiner i PC-celler ble korrelert til hemming av Dubs. I motsetning til PC-celler, BA hadde ingen effekt på DUB aktivitet og degradering av proteiner i normale celler, noe som resulterer i ingen toksisitet. Våre resultater antydet at PC-spesifikk effekt levert av BA terapi var på grunn av sin evne til å hemme Dubs i kreft, men ikke i ikke-kreftceller.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyrestudier ble utført med godkjenning av Institutional Animal Care og bruk Committee (protokoll # 6996,06 MR) av Miami Veterans Affairs Medical Center (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care akkreditert) og gjennomføres i samsvar med NIH retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr
Reagenser
BA for cellekultur eksperimenter ble kjøpt fra AG Scientific.; digitonin og polyvinyl-pyrrolidon (PVP) fra Sigma-Aldrich; MG132, doxorubicin, og Coomassieblå fra EMD Biosciences; N-etylmaleimid (NEM) fra Sigma; og trypanblått (0,4%) fra Invitrogen.
Behandling av TRAMP mus med BA
TRAMP transgene mus (Jackson Laboratories) ble identifisert ved halebiopsi og PCR ved hjelp av Veiviser SV Genomisk DNA rensing (Promega ) og DNA grunning PB-1 frem 5′-CCGGTCGACCGGAAGCTTCCACAAGTGCATTTA-3 «og Tag omvendt 5′-CTCCTTT CAAGACCTAGAAGGTCCA-3». BA ble hentet fra Ze-Qi Xu på Avanserte biovitenskap og forberedt som tidligere beskrevet [19]. Mus med palpable prostatatumorer ble tilfeldig delt i eksperimentelle og kontrollgrupper og injisert i.p. 11 ganger i løpet av 14 dager med BA (5 [BA5] eller 10 [BA10] mg /kg kroppsvekt, n = 10 for hver dose) eller bærerkontroll (n = 12). På dag 15, ble primær prostatakreft fjernet og deres vekter bestemt. Et ytre parti av primærprostatatumor ble fiksert i formalin for immunhistokjemi. TRAMP hanner uten følbar prostatakreft ble behandlet på lignende måte med BA10 eller kjøretøy kontroll (n = 3, hver gruppe), prostata, milt, thymus fjernet og analysert ved immunhistokjemi.
Immunohistochemistry
farging for apoptotisk (kløyvet caspase-3, Cell Signaling Technology, ApopTag Peroxidase In Situ apoptose Detection, Millipore) og voksende (Ki67, NCL-Ki67p, Leica Microsystems, PCNA [PC10], Santa Cruz Biotechnology) ble cellene utført ved hjelp av kanin polyklonale, monoklonalt , og biotinylert geite-anti-kanin /mus sekundære antistoffer (Vector Laboratories), som tidligere beskrevet [20]. Blodåre tetthet ble bestemt ved farging for CD-31 bruker en geitepolyklonalt antistoff (M20, Santa Cruz Biotechnology) og en biotinylert kanin anti-geit sekundært antistoff eller for CD-34 ved hjelp av en rotte polyklonale (RAM34, BD Biosciences) og geit anti -rat sekundært antistoff. Antallet spaltet caspase-3 eller Ki67-positive celler og CD-31 positive skip ble bestemt for BA10 og kjøretøy kontroller (n = 5 i hver gruppe), som tidligere beskrevet [20]. Tilsvarende AR (N-20), cyklin D1 (DCS-6), og ubiquitin (P4D1) fra Santa Cruz Biotechnology ble immunfarget; antallet av AR-positive celler ble bestemt for BA10 og kjøretøy-styre prostatakreft.
Cellelinjer
Menneskelige PC-cellelinjer LNCaP, DU145 og PC3 [21] ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og brukes innen 6 måneder etter gjenoppliving av originale kulturer. Alle PC-celler ble holdt i RPMI 1640 medium (Invitrogen) med 5% føtalt bovint serum (Hyclone), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 0,25 ug /ml amfotericin (Invitrogen). Prec normale humane prostata epitelceller ble oppnådd fra Lonza, og opprettholdt i PrEGM media. RWPE-1 normale prostata epitelceller (hentet fra Dr. Bal Lokeshwar, Universitetet i Miami og opprinnelig fra ATCC) ble opprettholdt i keratinocyte-SFM media (Invitrogen). Human foreskin fibroblast-celler BJ (passasje 24) og føtale lungefibroblaster (IMR-90, MRC-5) ble erholdt fra Dr. Priyamvada Rai (University of Miami) og opprinnelig erholdt fra ATCC (CRL-2522, CCL-186, og CCL -171). BJ, IMR-90, og MRC-5-celler ble opprettholdt i DMEM-medium (Invitrogen) med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.
BA celleproliferasjonsanalyse
CellTiter vandige celleproliferasjon kolorimetrisk metode fra Promega ble anvendt for å bestemme celle-levedyktighet av PC-celler i medium inneholdende BA (2,5, 5, 7,5 og 10 uM) eller kontroll (0,5% DMSO). Cellelevedyktigheten ble normalisert mot bærerkontrollen og dataene uttrykt som en prosentandel av kontroll fra tre uavhengige eksperimenter utført in triplo.
medikamentell behandling
PC-celler ble dyrket i media inneholdende BA (10 pM ), MG132 (1 uM), docetaxel (1 nM), eller DMSO kontroll for varierende tider (24-72 timer). BJ, IMR-90, MRC-5, prec, og RWPE-1-celler ble dyrket i media inneholdende BA, doksorubicin (1 uM), eller DMSO kontroll for varierende tider (24-72 timer). I alle forsøkene ble flytende og trypsinert festede celler oppsamlet for videre analyse.
Western blot-analyse
Fremstilling av total protein lysater og western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [22]. Følgende antistoffer ble brukt: spaltet PARP (9541), CoxIV (4844), AKT (9272), og Survivin (71G4B7) fra Cell Signaling Technology; cytokrom c (7H8.2C12), Smac (612 245), BCL-XL (610 211) og Rb (544144) fra BD Biosciences; AIF (e-1), aktin (C-11), cyklin A (H432), cyklin B1 (GNS1), cyklin D1 (DCS-6), Cdk1 (17), Cdk2 (D-12), Cdk4 (M2) , p21 (C-19), p27 (C-19), E2F1 (KH95), AR (N-20), Mcl-1 (S-19), Bcl-2 (N-19), HA (Y-11 ), Ub (P4D1), Rb (C-15), og pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff fra Santa Cruz Biotechnology. Vårt ønske var å bruke Coomassieblå farging av total protein som lastekontroll fordi medikamentelle behandlinger ofte påvirke nivåene av typiske housekeeping proteiner som aktin eller tubulin.
trypanblått eksklusjon analysen
Behandlet og kontroll PC, BJ, IRM-90, MRC-5, prec, eller RWPE-1 celler ble høstet, resuspendert i PBS, fortynnet 1:01 i 0,4% trypanblått, døde blå og lever ikke-blå celler umiddelbart telles ved hjelp av en hemacytometer, og% døde blå celler bestemt fra minst tre uavhengige eksperimenter utført i duplikat.
Annexin-FITC /propidiumjodid (PI) flowcytometri
behandlede og kontroll PC-celler ble resuspendert i bindingsbuffer etterfulgt av tilsetning av annexin V-FITC og PI (Annexin V Kit sc-4252 AK, Santa Cruz Biotechnology). Etter 20 min., Ble cellene analysert ved flowcytometri ved hjelp av en Coulter XL strømningscytometer og andelen av Annexin + celler etter retningslinjer WinMDI versjon 2.8 fra to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
Mitokondrie protein utgivelsen analysen
behandlede og kontroll PC-celler ble resuspendert i en buffer inneholdende 100-200 pM digitonin, 20 mM Hepes, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 250 mM sukrose, og proteasehemmere (Roche) 50 mL /1 × 10
6 celler. Etter 5 min. på is ble cellene sentrifugert 5 min, og supernatanten benyttet for Western blot-analyse. Digitonin er et vaskemiddel som fortrinnsvis permeabilizes plasma membran i forhold til mitokondriemembranen [23].
Flowcytometrisk cellesyklusanalyse
Propidium /hypoton citrate metoden ble brukt til å studere cellesyklus distribusjon av BA behandlet PC celler [24]. Seks til åtte prøver ble analysert fra minst tre uavhengige eksperimenter og DNA distribusjons histogrammer generert som tidligere beskrevet [22], [25].
Transient transfeksjon av AR, cyclin D1 villtype og T286A mutant
CMV /AR-ekspresjonsplasmid ble transfektert inn i PC3-celler i 24 timer ved bruk av Fugene HD-(Roche), etterfulgt av BA (24, 48, 72 timer) eller kontroll (24 h) behandling og AR-protein analysert ved hjelp av western blot. Cyclin D1 ekspresjonsplasmider pBABE /cyklin D1 villtype (9050) og pcDNA /cyklin D1 T286A mutant (11182, kan ikke brytes ned av UPS; [26]) ble oppnådd fra Addgene. Disse plasmidene ble transfektert inn i LNCaP-celler i 24 timer fulgt av BA eller kontroll behandling i 24 timer. Protein nivåer av transfektert cyclin D1 protein ble bestemt ved western blot analyse ved hjelp av anti-HA og cyclin D1.
Proteasome analysen
Proteasome-Glo chymotypsinlignende Cell-baserte analysen (Promega) var anvendes for å bestemme effekten av BA på proteasom-aktivitet i PC-celler. Celler ble behandlet med BA BA + MG132, eller kontroll av 8, 24, 48 og 72 timer ble celletall bestemt, og proteasom-aktivitet målt med et luminometer (TD-20/20, Designs Turner). Lys enheter ble normalisert til celle nummer (kontroll behandling = 1) og 6-8 prøver ble analysert fra minst fire uavhengige forsøk.
DUB analysen
DUB-Glo Protease Assay (Promega) ble anvendt for å bestemme effekten av BA på DUB-aktivitet i PC, BJ, IRM-90, og RWPE-1-celler. Celler ble behandlet med BA, 1 nM docetaxel, eller kontroll etter 8, 24, 48, og 72 timer, lysert i DUB-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% NP-40, 5 mM MgCl
2 , 250 mM sukrose, 1 mM DTT, 1 mM PMSF), sentrifugert 10 min., og 10 ug protein som brukes for å bestemme DUB aktivitet. Kontroll lysater ble pre-inkubert med 4 mM NEM, en kjent inhibitor DUB, i 1 time før tilsetning av substrat. Lysenheter (kontroll behandlings = 1) fra 6-8 prøver ble bestemt fra minst tre uavhengige eksperimenter. DUB-aktivitet ble også målt i bærerkontrollen (n = 4) og BA10 (n = 5) TRAMP prostatakreft.
DUB merkingsassay
Cellelysater ble fremstilt som beskrevet ovenfor for DUB analysen , 20 ug protein ble inkubert med 500 ng HA-Ub vinylsulfon (VS), en irreversibel spesifikk inhibitor av et Dubs (Boston Biochem) i 1,5 timer ved romtemperatur, og prøvene analysert ved western blot ved anvendelse av anti-HA-antistoff for å påvise DUB merking.
Statistisk analyse
statistiske forskjeller mellom legemiddelbehandlede og kontroller ble bestemt av tosidige Student
t
-test (ulik varians) med
P
. 0,05 ansett som signifikant
Resultater
BA hemmer veksten av TRAMP prostatakreft ved å øke apoptose og mink angiogenese og spredning
Vi har tidligere benyttet BA (fig. 1) som et middel som kan øke følsomheten av PC-cellelinjer til celledød når den kombineres med antimitotiske midler ved å øke NF-kB aktivitet, delvis på grunn av økt nedbrytning av IκBα [27], [28]. For å evaluere
in vivo
terapeutiske effekten av BA, vi utnyttet TRAMP transgen musemodell for PC [29], [30]. Tramp mus inneholder prostata-spesifikt probasin promotoren forbundet med SV40 T-antigen onkogen, noe som resulterer i utviklingen av metastatisk aggressive PC. Våre resultater indikerer at BA (5 og 10 mg /kg) i betydelig grad redusert de endelige vekter av primær prostata tumorer sammenlignet med vehikkel kontrolltumorer (fig. 2A). Det var ingen forskjeller i de endelige kroppsvekt mellom BA behandlet og kontrollmusene (data ikke vist). Immunhistokjemi (IHC) av spaltet (aktiv) caspase-3, en markør for apoptotiske celler, viste en betydelig økning i BA10 sammenlignet med vehikkel kontrolltumorer (Fig. 2B og supplerende Fig. S1A). IHC av CD31, en markør for blodårer, og Ki67, en markør for prolifererende celler, viste en signifikant reduksjon i BA10 sammenlignet med vehikkel kontrolltumorer. Ytterligere bekreftelse ved hjelp TUNEL for apoptose, CD34 for angiogenese, og PCNA for spredning er vist i Tilleggs fig. S1B. Resultatene indikerte at BA indusert apoptose og hemmet angiogenese og spredning i tramp prostatakreft.
(A) Vekt primære prostatakreft var betydelig mindre i BA (5, 10 mg /kg) i forhold til kjøretøy kontroll [C] behandlede Tramp mus (*,
P
0,03; **
P
0,002). (B) BA10 behandlingen økte spaltes kaspase-3 + celler og nedsatt CD31 og Ki67 + celler sammenlignet med kontroll prostatakreft. (C) Representative immunofarging for cyklin D1 og AR (x 200) viste mindre protein i BA10 sammenlignet med kontroll prostatakreft (PT). AR protein nivåer var lik i normale prostata (Pr) fra mus behandlet med BA eller kontroll (× 200). (D) betydelig redusert antall AR + celler i BA10 sammenlignet med kontroll prostatakreft (*,
P
4 × 10
-7).
BA avtar nivåene av AR i Tramp prostatakreft, men ikke i normal prostata
Vi ønsket å finne ut om BA kan redusere uttrykket nivåer av AR og cyclin D1 proteiner i tramp prostatakreft. IHC og telling av AR + celler viste en signifikant reduksjon i BA10 sammenlignet med vehikkel kontrolltumorer (fig. 2C, D). IHC av cyclin D1 viste også en signifikant reduksjon i BA10 sammenlignet med vehikkel kontrolltumorer, korrelerer med reduksjon i Ki67 og PCNA sprednings markører (fig. 2B, C). Vi neste søkt å finne ut om den BA-formidlet reduksjon i AR også forekommet i ikke-kreft prostatavevet. I motsetning til resultatene i prostatakreft, nivåene av AR i normal prostata var lik i BA10 forhold til kjøretøykontroll, noe som tyder på at BA-mediert degradering av AR skjedde bare i tumorceller (Fig. 2C).
BA hemmer spredning og øker apoptose av PC-celler
for å løse mekanismene for BA som monoterapi i PC, brukte vi androgen-avhengige LNCaP og kastreringsresistent DU145 og PC3 celler. Ved hjelp av en tre-dagers celleproliferasjon analysen, fant vi at 10 mm BA hemmet veksten av alle PC-celler, inkludert mer kjemoterapi motstandsdyktig DU145 og PC3 celler (fig. 3A). Alle etterfølgende eksperimenter ble utført ved anvendelse av 10 uM BA. BA anti-PC-celle effekt skyldes økt apoptotisk celledød, bestemt ved trypan blå eksklusjon assay, western blot analyse av spaltede-PARP (substrat for aktivert kaspaser), og annexin V-FITC /PI strømningscytometri (fig. 3B , C). BA er rapportert å målrette mitokondriene til å initiere den indre vei av apoptose ved å øke frigjøring av mitokondrielle proteiner så som cytokrom c, som aktiverer caspase kaskade [5]. Våre resultater i PC3 celler viste at BA økt frigjøring av cytokrom c, Smac (blokker inhibitor av apoptose [IAP] familie; [31]), og apoptose-induserende faktor (AIF, translocates til kjernen for å øke DNA-fragmentering, [32] ) fra mitochondria (fig. 3D). Lignende resultater ble oppnådd i BA behandlet LNCaP og DU145 celler (Supplementary fig. S2). Således BA-formidlet frigjøring av pro-apoptotiske proteiner fra mitochondria sammenfalt med den observerte økning i apoptose i PC-celler.
(A) Celle proliferasjonsanalyse viser at økende konsentrasjoner av BA (2,5 til 10 pM) hemmet LNCaP, DU145 og PC3 celler. (B) Trypan blå eksklusjon analyse viste at 10 uM BA (B) øket total celledød i LNCaP (48 h), DU145 (72 timer), og PC3 (72 timer) sammenlignet med kontroll (C) celler. Western blot analyse viste at BA økt kløyvet (cl) -PARP nivåer i PC-celler. Coomassie blå flekk av totalt protein lastes kontroll. (C) Strømningscytometrisk analyse viste høyere annexin-FITC farget BA sammenlignet med kontroll behandlede PC-celler. (D) Mitokondrie protein utgivelsen analysen og western blot viste økt nivå av cytokrom c, Smac, og AIF i PC3 celler behandlet med BA sammenlignet med kontrollceller. Cox IV protein var negativ som indikerer ingen mitokondrie forurensning og aktin ble den positive kontroll. + C var lysat utarbeidet etter standardmetoden for totalt proteiner.
BA øker G1 /S cellesyklus arrest i PC-celler
For å undersøke cellesyklus effekten av BA på PC celler brukte vi strømningscytometri-analyse. Behandling av PC-celler med BA for 24 timer resulterte i en signifikant økning G1 og redusert S-fasen av cellesyklusen, noe som indikerer en stor blokk i G1 /S (Supplementary S3A fig.). Etter lengre tider av BA behandling, var det en betydelig økning i sub-G1 cellesyklus fase i alle PC-celler, som var reflekterende av større DNA degradering som inntraff i apoptotiske celler (Supplementary fig. S3b). I DU145 og PC3, men ikke i LNCaP var det en betydelig økning i G2 /M etter 72 timer med BA behandling. Resultatene indikerte at BA indusert betydelige forstyrrelser i normal cellesyklus av PC celler.
BA øker nedbrytningen av flere cellesyklus og pro-overlevelse proteiner i PC-celler
Siden BA er rapportert å øke nedbrytningen av multiple proteiner, undersøkte vi effekten av BA på cellesyklus og pro-overlevelses proteiner i PC-celler ved western blot-analyse. Våre resultater viste at protein nivåer av multiple cellesyklusproteiner inkludert sykliner A, B1, D1; Cdks1, 2, 4; E2F1, og Rb sank etter BA behandling starter på 24 timer i LNCaP og PC3-celler (Fig. 4A). I LNCaP-celler, den Cdk inhibitor p21 også redusert etter BA behandling, men i PC3, økt p21-protein ved 24 timer og returnerte til basalnivåer etter 48 og 72 timer. I motsetning til dette økte Cdk inhibitor p27 etter BA behandling, hvilket antyder en rolle i den G1 /S cellesyklus-blokk. Lignende resultater ble oppnådd i DU145 celler (Tilsetnings fig. S4).
(A) Western blot-analyse viste at BA behandling senket protein nivåer av cykliner, CDK, E2F1, og Rb i LNCaP og PC3-celler. I motsetning til dette, BA behandling økte protein nivåene av Cdk inhibitor p27. (B) BA behandling minsket overlevelse pro-proteiner AR, AKT, Survivin og Mcl-1, noe som korrelerte med økt cl-PARP i LNCaP og PC3. AR i PC3 var fra transient transfeksjon
BA behandling økte nivåer av spaltet-PARP med tid på PC-celler, noe som indikerer forhøyede nivåer av aktiverte caspases og apoptose (fig 4B,.. Supplerende figur S4). . Interessant, BA behandling dramatisk redusert proteinnivåer AR i LNCaP og i AR transfektert PC3 /DU145 cellene. Videre redusert BA behandling nivåene av pro-overlevelse proteiner AKT, Survivin, og Mcl-en. I motsetning til dette ble BA behandling ikke redusere nivåene av anti-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl-xL (figur 4B;.. Tilsetnings Fig S4). Samlet er disse resultatene indikerte at BA selektivt økt nedbrytning av flere spredning og pro-overlevelse proteiner.
BA-mediert protein degradering er avhengig av UPS
Tidligere studier tyder på at BA-mediert økning UPS aktivitet er en grunn for økt protein degradering [6], [8]. Våre resultater bekrefter at i LNCaP celler, UPS-hemmer MG132 blokkerte BA-mediert nedgang i AR, AKT, og Mcl-1 proteiner. I tillegg MG132 antagoniserte BA-mediert økning i apoptotisk celledød, bestemt ved trypan eksklusjon og western blot analyse av spaltet PARP-(Fig. 5A). En cyklin D1 mutant som ikke kan nedbrytes av UPS var resistent mot BA-mediert degradering, noe som ytterligere antyder en rolle for UPS (Fig. 5B). Men våre proteasomer analyseresultatene viste at BA hadde ingen direkte effekt på UPS-aktivitet i LNCaP-celler (fig. 5C). I motsetning til LNCaP celler, BA behandling av DU145 og PC3 celler førte til betydelig økt UPS aktivitet (Supplementary Fig. S5). Samlet er disse resultatene indikerte at BA variabelt forbedret UPS aktivitet i noen (DU145 og PC3), men ikke alle (LNCaP) PC-celler.
(A) trypanblått eksklusjon analysen viste at 1fiM MG132 antagonized celledød i BA behandlede LNCaP celler (24 h, *,
P
0,02). Western blot analyse viste at MG132 blokkerte BA-mediert økning av Cl-PARP og reduksjon av AR, AKT, og Mcl-1-proteiner. (B) Western blot-analyse viste at transfektert cyklin D1 T286A mutant men ikke cyklin D1 villtypeproteinet var resistent mot BA-mediert nedbrytning (24 h) i LNCaP-celler. (C) Proteasome aktivitetsanalyse viste ingen signifikant effekt i LNCaP-celler ble behandlet med BA for 8, 24 og 48 timer. Tilsetting av MG132 (MG) til BA resulterte i redusert aktivitet.
BA hemmer flere Dubs som fører til økte totale poly-UB proteiner i PC-celler
I LNCaP celler, en mulig måte BA kan øke selektiv nedbrytning av proteiner uten direkte å aktivere UPS er ved å hemme Dubs. I dette tilfellet bør hemming av Dubs føre til ansamling av total poly-UB proteiner og øke deres nedbrytning av UPS. Våre vestlige blot Resultatene viste at BA behandling av LNCaP celler økte totale poly-UB proteiner, tilsvarende MG132 behandling (Fig. 6A). Lignende resultater ble også observert i DU145 og PC3-celler (ikke vist). Til tross for økningen i poly-UB, er det ikke klart hvorfor BA behandlingen har ingen virkning på UPS-aktivitet i LNCaP-celler (fig. 5C). I Tramp prostatakreft, BA behandling også økt UB proteiner som bestemmes av IHC og redusert DUB aktivitet (Supplementary Fig. S6). Våre DUB analyseresultatene viste at BA behandling av LNCaP-celler redusert DUB aktivitet starter på 24 timer. I motsetning til behandling av LNCaP med 1 nM docetaxel, en dose som øker apoptotisk celledød [28], hadde mindre effekt på DUB-aktivitet (Fig. 6B). Lignende resultater ble oppnådd med BA behandling av DU145 og PC3-celler med unntak av at BA hemmet DUB aktivitet som starter på et senere tidspunkt (48 timer) og docetaxel hadde en sterkere DUB hemmende virkning sammenlignet med LNCaP-celler (Tilsetnings fig. S7). Totalt sett, evne til 10 uM BA å inhibere DUB aktivitet korrelert med inhibering av celleproliferasjon (ikke vist).
(A) Western blot-analyse viste at BA behandling av LNCaP-celler (24 h) økt total poly- UB proteiner som ligner på MG132 behandlede celler. (B) DUB-analyse viste at BA behandling av LNCaP-celler signifikant redusert DUB-aktivitet ved 24 og 48 timer i forhold til kontroll behandlede celler (= 1) (*,
P
mindre enn 5 x 10
-5 ). Docetaxel (Doc, en nM) reduseres DUB aktivitet mye mindre enn i forhold til BA (*,
P
6 × 10
-5). Kontroll lysater forbehandlet med 4 mM NEM i 1 time og førte til nedsatt DUB aktivitet. (C) DUB merking med HA-UbVS og western blot analyse med anti-HA viste at BA (10 mm), men ikke Doc (1 nM) hemmet flere Dubs i LNCaP cellene ved 24 og 48 timer. Proteinbånd 1-6 viste en reduksjon i aktivitet med BA behandling, mens bandet 7 ikke. Kontroll lysater uten tilsetning av HA-UbVS eller pre-inkubert med NEM i 1 time var kontrollene. Molekylvektmarkører (kDa) er vist til venstre. Coomassieblå flekk av totalt protein var lasting kontroller.
For å kunne fastslå om BA kan hemme Dubs i LNCaP celler, vi brukte en DUB merkingsassay med HA-UbVS, en potent, irreversibel, og spesifikk hemmer av de fleste Dubs [33]. Siden HA-UbVS bare binder seg til aktive Dubs, gjør at HA tag for merking av aktive Dubs stede i LNCaP celler etter BA behandling og analyse av western blot. Våre resultater viste at BA behandling av LNCaP-celler ble redusert flere Dubs ved 24 og 48 timer sammenlignet med kontrollceller (Fig. 6C). I motsetning til behandling av LNCaP-celler med docetaxel hadde ingen effekt på DUB aktivitet. Lignende resultater ble oppnådd i DU145 og PC3 celler (Utfyllende fig. S8A, B). Samlet er disse resultatene antydet at BA hemmet flere Dubs, noe som resulterer i økt poly-UB proteiner, som ble sannsynligvis raskt degradert av UPS veien.
BA har ingen effekt på DUB aktivitet i ikke-kreftceller
BA er rapportert å være et mer selektivt middel mot kreft sammenlignet med normale celler, men mekanismene for hvordan dette skjer, er ikke blitt bestemt [34], [35]. Fordi våre resultater i TRAMP mus viste at BA behandling ikke reduserte AR proteinnivåer i ikke-kreftceller prostata, søkte vi å bestemme effekten av BA på ikke-cancerceller ved å benytte BJ human foreskin fibroblast-celler. BJ-celler behandlet med BA i 72 timer økte ikke celledød eller spaltet-PARP sammenlignet med kontroll behandlede celler (Fig. 7A). I motsetning til behandling av BJ-celler med 1 pM doksorubicin (et DNA-ødeleggende medikament) resulterte i betydelig celledød og spaltet-PARP. Våre resultater viste videre at BA behandling ikke redusere nivåene av AR eller øke total poly-UB proteiner i BJ celler som i LNCaP celler (fig. 7B, C). Til slutt viste vi at BA hadde ingen effekt på DUB aktivitet i BJ-celler, i motsetning til det som ble observert i PC-celler (Fig. 7D og supplerende fig. S8C). Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av humane IMR-90 og MRC-5 fetal lunge fibroblast-celler (Tilsetnings fig. S9).
(A) Trypan blå eksklusjon analyse viste at BA ikke økte celledød i BJ-fibroblaster etter 72 h. I kontrast til behandling av BJ celler med doxorubicin (Dox) økt celledød. Western blot analyse viste at Dox men ikke BA økt cl-PARP. (B) Western blot viste at BA hadde ingen effekt på AR proteinnivåer i BJ-celler. Drs.
