Abstract
Mål
Tidlig innsettende kolorektalcancer (CRC) representerer en klinisk distinkt form for CRC som er ofte forbundet med dårlig prognose. Metylering nivåer av genomiske repetisjoner som LINE-1 elementer har blitt anerkjent som uavhengige faktorer for økt kreftrelatert dødelighet. Metylering status for LINE-1 elementer i tidlig debut CRC har ikke blitt analysert tidligere.
Design
Vi analyserte 343 CRC vev og 32 normale colonic slimhinnen prøver, inkludert 2 uavhengige kohorter av CRC diagnostisert ≤50 år gamle (n = 188), en gruppe av sporadisk CRC 50 MSS (n = 89; MSI n = 46), og en gruppe av Lynch syndrom CRC (n = 20). Tumor mismatch reparasjon protein uttrykk, mikro ustabilitet status, LINE-en og
MLH1
metylering, somatisk
BRAF
V600E mutasjon, og kimcellelinje
MUTYH
mutasjoner ble evaluert.
Resultater
Mean LINE-en metylering nivåer (± SD) i de fem studiegruppene var tidlig debut CRC, 56,6% (8,6); sporadisk MSI, 67,1% (5,5); sporadisk MSS, 65,1% (6,3); Lynch syndrom, 66,3% (4,5) og normal slimhinne, 76,5% (1,5). Tidlig debut CRC hadde signifikant lavere LINE-en metylering enn noen annen gruppe (p 0,0001). Sammenlignet med pasienter med 65% LINE-en metylering i tumorer, de med ≥65% LINE-en metylering hadde signifikant bedre total overlevelse (p = 0,026, log rank test)
Konklusjoner
LINE-en hypometylering utgjør et potensielt viktig trekk ved tidlig debut CRC, og foreslår en tydelig molekylær subtype. Videre studier er nødvendig for å vurdere potensialet i LINE-en metylering status som en prognostisk biomarkør for unge med CRC
Citation. Antelo M, Balaguer F, Shia J, Shen Y, Hur K, Moreira L, et al. (2012) en høy grad av LINE-en Hypomety-lering er en unik funksjon av Early-Onset tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (9): e45357. doi: 10,1371 /journal.pone.0045357
Redaktør: Anthony WI. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 02.07.2012; Godkjent: 15 august 2012; Publisert: 25.09.2012
Copyright: © Antelo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den nåværende arbeidet ble støttet med tilskudd R01 CA72851 og CA129286 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health; og midler fra Baylor Research Institute til CRB og AG. FB ble støttet av en bevilgning fra Fundación Alfonso Martín Escudero og fra Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). MA ble støttet av en «Type I Graduate Scholarship» gitt av CONICET (National Council of Scientific og tekniske undersøkelser) avhengig av den argentinske Ministry of Science and Technology. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en viktig folkehelseproblem, og representerer den nest hyppigste kreft og den nest største årsaken kreftrelatert dødelighet i de fleste industrialiserte land. Hvert år en million mennesker utvikler CRC, og 40-50% av dem vil dø innen 5 år etter diagnose [1]. CRC er meget heterogen både histopathologically, og på molekylært og genetisk nivå. Det ser ut til at biologi og respons på behandling er like mangfoldig. Forstå de molekylære mekanismene for kolorektal kreftutvikling er avgjørende for utvikling av nye strategier for forebygging, diagnostikk, behandling og prognose. Selv CRC har vært et stort fokus for grunnforskning og klinisk forskning i løpet av de siste 25 årene, vi mangler fortsatt robuste biomarkører som kan brukes til diagnostisering og behandling av CRC.
Toppen forekomst av CRC er mellom 60 -70 år; men opp til 10% av alle tilfellene oppstår før fylte 50. Videre nyere epidemiologiske studier tyder på at forekomsten av tidlig debut CRC er økende, noe som representerer en viktig klinisk utfordring [2]. Tidlig debut CRC presenterer ofte med avansert stadium svulster, noe som bidrar til en høyere dødelighet [3]. Siden unge mennesker er ikke inkludert i CRC screeningprogrammer, det er et presserende behov for å forstå biologien til tidlig debut av svulster, som kan legge til rette for tidligere deteksjon og behandling av disse kreftformene.
Selv om tidlig debut CRC øker muligheten for en arvelig risikofaktor, de kjente ikke-polypose arvelig CRC syndromer (Lynch syndrom og
MUTYH
-associated CRC) representerer ikke mer enn 15-20% av tilfellene i denne gruppen [4], [5] , [6]. Lynch syndrom utgjør ca 3% av alle CRC-tilfeller, og er forårsaket av germline mutasjoner i DNA mismatch reparasjon (MMR) gener (
MLH1, MSH2, MSH6 Hotell og
PMS2
) [7 ]. Den er karakterisert ved tidlig innsettende kreft som oppstår i de colorectum og andre organer, og det finnes i dag flere strategier og algoritmer for å forutsi nærvær av en kimlinje mutasjon i en av de MMR genene [8], [9], [10], [11]. Biallelic mutasjoner i
MUTYH
genet (et medlem av base excision reparasjonssystem) står for mindre enn 1% av alle CRC, og vanligvis fører til en svekket form for polypose, selv om 30% av disse pasientene kan manifestere seg som en non-polypose CRC [12] .Identifying personer med germline mutasjoner som disponerer for CRC har betydelige konsekvenser for den kliniske behandlingen av berørte enkeltpersoner og for deres pårørende.
de resterende 75-80% av tidlig debut CRC representerer en annen gruppe hvor den genetiske etiologien ennå ikke er oppdaget. I motsetning til CRC på eldre individer, er tidlig innsettende CRC ofte preget av mer avansert stadium, fjerntliggende sted (særlig i endetarmen), mucinkjertler og dårlig differensierte tumorer med signet ringlegemer, og en dårligere prognose [4], [13], [14]. De fleste av disse kreftformene ikke viser mikro ustabilitet (MSI), men snarere er mikro stabil (MSS). Den molekylære basis for de biologiske og atferdsmessige forskjeller i tidlig innsettende CRC er uklar.
genom-DNA bred hypometylering er en hyppig epigenetisk endring som er en tidlig begivenhet i CRC og er blitt assosiert med aktiveringen av visse proto -oncogenes (dvs. Met) [15] og tilstedeværelsen av kromosomal ustabilitet [16], [17]. Globalt DNA hypometylering kan måles indirekte ved å vurdere metylering status for lang ispedd nucleotide element-en (LINE-1) gjenta sekvenser [18]. Den pyrosekvensering assay for LINE-1-metyleringen er blitt funnet å være kvantitativ, robust og reproduserbar [19]. Graden av LINE-en hypometylering har blitt anerkjent som en selvstendig faktor for økt kreftrelatert dødelighet og total dødelighet i CRC pasienter [20]. Selv om det har vært antydet at LINE-en hypometylering er assosiert med CRC hos yngre pasienter [21], den spesifikke sammenhengen mellom metylering status for LINE-1 elementer og tidlig debut CRC har ikke blitt analysert videre.
Hensikten med denne studien var å karakterisere kliniske, histologiske og molekylære funksjoner i en stor kohort av tidlig debut av CRC i sammenheng med metylering status for LINE-1 elementer. Våre resultater tyder på at LINE-en hypometylering i disse svulstene utgjør en unik og spesifikk funksjon, som tyder på en klar molekylær subtype i disse colorectal svulster. Våre funn tyder på at LINE-en metylering status kan brukes som en prognostisk biomarkør for unge med CRC.
Pasienter og metoder
Etikk erklæringen
Studiet ble godkjent av de Institutional Review Boards (IRB) fra hvert deltaker sentrum, inkludert Hospital of Gastroenterology «Dr. C. B. Udaondo «, Buenos Aires, Argentina, Baylor University Medical Center, Dallas, TX og Epicolon konsortiet. En skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Pasienter
Vi analyserte 343 CRC fra ulike klinikken-patologiske grupper, og 32 normale colonic slimhinnen prøver. Vi følger en kohort av 118 ettertid rekruttert CRC pasienter ≤50 år sett på Oncology Seksjon for den argentinske Public Hospital of Gastroenterology mellom 1993 og 2009. Pasienter med kolorektal polypose eller inflammatorisk tarmsykdom ble ekskludert. Demografiske og klinikk-patologiske funksjoner ble samlet inn fra hver enkelt pasients sykehistorie, og familiehistorie med kreft i første og andre grad slektninger ble oppnådd ved personlig intervju. Median oppfølgingstid var 39 måneder (range, 1.5-195 måneder). For LINE-en metylering analyser, som en validering gruppe, vi inkludert en tidligere beskrevet kohort av 70 pasienter med CRC diagnostisert ≤50 år behandlet på to spanske sentre (Hospital Clinic i Barcelona og Hospital of Donostia) mellom 1995-2007 [4 ]. Vi har også tatt med en populasjonsbasert kohort av sporadiske CRC 50 år rekruttert i Spania (Epicolon jeg studien) [9] kategorisert av tilstedeværelsen av MSI ( «sporadisk MSI» på grunn av somatiske
MLH1
arrangøren hypermethylation [n = 46], og «sporadisk MSS» [n = 89]); og en gruppe av Lynch syndrom CRC rekruttert ved Baylor University Medical Center i Dallas (n = 20). Vi histologisk analysert normal tarmslimhinnen fra 32 personer som gjennomgår tarmkirurgi for andre enn kreft grunner (dvs. diverticulosis) rekruttert i Hospital Clinic i Barcelona, Spania.
DNA Isolation
Genomisk DNA fra hver pasient ble ekstrahert fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) microdissected tumorvev bruker QiaAmp Tissue Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike) i henhold til produsentens instruksjoner. Perifert blod DNA ble ekstrahert ved hjelp av QiaAmpDNA blod Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike). For endetarmssvulster der chemo-stråling ble gitt, ble før behandling vevsprøver analysert.
Tumor Mismatch Repair Protein Expression
En blokk av FFPE svulstvev ble valgt per sak og farging ble utført bruker standard protokoller. Følgende mus monoklonale antistoffer ble brukt: anti-MLH1 (klone G168-728, fortynnet 1:250, PharMingen, San Diego, CA), anti-MSH2 (klone FE11, fortynnet 1:50, Oncogene ResearchProducts, Cambridge, MA), anti-MSH6 (klone GRBP.P1 /2.D4, fortynnet 1:200; Serotec Inc, Raleigh, NC) og anti-PMS2 (klone A16-4, fortynnet 1:200, BD PharMingen, San Diego, California). En svulst ble ansett negativt for protein uttrykk bare hvis neoplastisk epitel manglet atom flekker, mens ikke-neoplastiske epitelceller eller stromale celler beholdt normal uttrykk for at protein.
Tumor mikro Ustabilitet Analyse
MSI analyse ble utført under anvendelse av fem mononukleotid mikro gjenta mål (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 og NR-27) i et Pentaplex PCR system. Primersekvenser er blitt beskrevet tidligere [22]. Svulster med ustabilitet på ≥3 disse markørene ble klassifisert som mikro ustabil (MSI) og de som viser ustabilitet på ≤2 markører som mikro stabil (MSS). Forskerne scoring farging ble blindet for MSI resultater, og vice versa.
metylering Analyser
DNA ble modifisert med natrium-sulfitt hjelp av EZ Metylering Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA) . Metylering av LINE-1 sekvenser og arrangøren av
MLH1
ble analysert ved kvantitativ bisulfite pyrosekvensering som beskrevet tidligere [23]. Primere er detaljert i tabell S1.
kimcellelinje MUTYH genmutasjon Analyse
Alle pasientene ble undersøkt for de to mest utbredte
MUTYH
mutasjoner i kaukasiske populasjoner (p.G393D og p .Y176C) ved pyrosekvensering. Grunning er beskrevet i tabell S1. I heterozygoter for noen av disse mutasjonene, koderegionen og exon-intron grensene til
MUTYH
genet ble undersøkt ved SSCP med sekvensering av unormale bandet skift, som beskrevet tidligere [12].
soma~~POS=TRUNC BRAF V600Emutation analyse
BRAF
V600E mutasjonsanalyse ble utført av pyrosekvensering. PCR og sekvense primere er beskrevet i tabell S1.
Statistical Analysis
Kvantitative variabler ble sammenliknet med Student test. Kvalitative variabler ble sammenlignet med enten Chi Square eller Fisher test når det passer. For assosiasjoner med MMR-mangel og LINE-en metylering (behandles som en binær variabel) ble utført en multivariat analyse ved hjelp av en trinnvis bakover logistisk regresjon prosedyre for å vurdere de uavhengige foreninger. Mann Whitney test ble brukt for å sammenligne LINE-1 verdier. Total overlevelse assosiert med klinikken-patologiske og molekylære variabler (tumor stadium, MMR-mangel, svulst stedet, familiehistorie med CRC, tumor differensiering, mucinous komponent, tumor infiltrerer lymfocytter og LINE-en metylering) ble beregnet av Kaplan-Meier-metoden (log rank test). En tosidig p-verdi på 0,05 ble ansett som signifikant. SPSS v17 programmet ble brukt for statistisk analyse.
Resultater
Pasient Kjennetegn
Vi rekrutterte 118 pasienter med tidlig debut CRC. Klinisk-patologiske funksjoner er vist i Tabell 1. Gjennomsnittsalderen ved diagnose var 37 år (standardavvik (SD), 8,25), og 61 (51,7%) av pasientene var kvinner. I 34 (28,8%) svulsten var proksimalt til milt bøyning, 35 (29,6%) var i den distale colon, og 49 (41,6%) var i endetarmen. På presentasjonen, 22 (18,6%) av pasientene hadde 1-10 synkrone adenomer; 18 presenteres med 1-5 adenomer og 4 pasienter hadde 6-10 adenomer. Tre tilfeller (2,5%) hadde en synkron tumor (2 CRC og en nevroendokrine svulster i vedlegget), og 5 (4,2%) utviklet en metachronous svulst under oppfølging (4 CRC og en urothelial karsinom). Flertallet av tilfellene (77, 65,3%) ble diagnostisert på avanserte stadier (III-IV). Dårlig differensierte tumorer ble sett i 15 (13,1%) pasienter, 41 (34,7%) hadde mucinkjertler funksjoner og 65 (55%) hadde patologiske trekk som tyder på MSI fenotype, med en eller flere av følgende: signetringceller, Crohn’s- som lymfatisk reaksjon, tumor infiltrerer lymfocytter, medullær vekstmønster, eller anaplastisk funksjoner. Mer enn 85% (n = 100) av pasientene hadde opplevd abdominal smerte før diagnose, 83 (70%) presentert med en forandring i avføringsvaner, 71 (60%) hadde rektal blødning og vekttap, 34 (29%) hadde jernmangelanemi, 18 (15,5%) presenteres med tarmobstruksjon, og 6 (5%) med perforering. Den gjennomsnittlige forsinkelsen mellom første symptomene opptrer og CRC diagnose var 6,5 ± 5 måneder. Femten pasienter (12,7%) hadde en familiehistorie med CRC eller annen Lynch syndrom-forbundet svulst i første eller andre-graders slektninger. Tre pasienter møtte Amsterdam I kriteriene, 3 pasienter møtte Amsterdam II kriteriene, 4 pasienter hadde en første grad slektning med CRC, 3 pasienter hadde to eller flere andregrads slektninger med CRC, og 2 pasienter hadde en andregrads slektning med CRC.
kimcellelinje MUTYH genmutasjon Analyse
biallelic MUTYH mutasjoner ble funnet i 1/91 MMR-dyktig tilfeller (1,1%) (). Dette enkelt tilfelle var en 29 år gammel pasient med stadium III endetarmskreft og 2 synkrone adenomer. To søsken av denne pasienten hadde en historie med svekket polypose og CRC (ett presenteres med 30 adenomer og den andre med 8 adenomer og en
in situ
karsinom i cecum); både søsken totalt colectomies hadde blitt utført. Til slutt, identifiserte vi to p.G393D heterozygote pasienter som hadde ingen spesifikke klinisk-patologiske funksjoner (tabell S2).
Mismatch Repair mangel Analyse
MMR-mangel ble evaluert av MSI analyse og immunhistokjemi, og ble definert ved tilstedeværelsen av MSI i en tumor, og /eller tap av ekspresjon i en hvilken som helst av de MMR proteiner. Tjue syv (22,9%) svulster ble klassifisert som MMR mangelfull, og 25 av disse viste tap av protein uttrykk (8 for MLH1 /PMS2, en for isolerte MLH1, 4 for isolerte PMS2, 11 for MSH2 /MSH6, og en for isolerte MSH6 ). Klinisk-patologiske trekk ved pasienter med MMR-mangel er oppsummert i tabell 2.
Nesten alle tilfeller av MSI hadde tap av protein uttrykk; to tilfeller med MSI beholdt normal ekspresjon av alle fire proteiner. Likeledes, 1 tilfelle med tap av MSH6 ekspresjon og ett tilfelle med tap av PMS2 var MSS. Den siste pasienten var en 24 år gammel kvinne som hadde CRC i en alder av 15, en urothelial karsinom i en alder av 23, en metachronous CRC i en alder av 24, og til slutt, en mediastinal B-celle lymfom. Hennes CRC prøven viste tap av ekspresjon av PMS2 i tumorceller og i normale colonic omgivende vev, noe som fører til en presumptive diagnose av konstitusjonelle MMR-mangel syndrom på grunn av bi-allele PMS2 mutasjoner.
Som vist i tabell 1, sammenlignet med MMR-dyktige svulster, MMR-mangel svulster var mer sannsynlig å bli plassert i den proksimale colon (59,3%
vs
. 19,8%, p = 0,0001), for å være mucinous (63%
vs
. 26,4%, p = 0,0001), for å ha tumor infiltrerende lymfocytter (59,3%
vs
. 11,5%, p = 0,0001), og for å ha MSI-tankevekkende patologi (81,5%
vs
. 47,2%, p = 0,002). MMR mangel svulster var også mer sannsynlig å bli diagnostisert på et lavere stadium (stadium I-II. 51,9%
vs
29,7%, p = 0,03), og å ha mindre svulst tilbakefall eller progresjon (22,2%
vs
. 44%, p = 0,042). Multivariat analyse viste at uavhengige variabler knyttet til MMR-mangel var: proksimale plassering (OR = 3,86 [95% KI: 1,32 til 11,32]; p = 0,013), mucinkjertler funksjoner (OR = 3,38 [95% KI: 1,16 til 9,84]; p = 0,025) og tilstedeværelse av tumor infiltrerer lymfocytter (OR = 8,8 [95% KI: 2,93 til 26,31]; p = 0,0001). Selv om det ikke var noen forskjell i alder av CRC diagnose mellom de 2 gruppene, er sjansen for å ha en MMR-mangelfull svulst var større blant yngre pasienter (12-30 år: 8/27, 29,6%, 31-40 år: 9 /45, 20%, 41-50 år:. 10/46, 21,7%)
Somatisk
BRAF
mutasjonen var til stede i en MMR-mangelfull svulst (tabell 2). Denne saken var en 49 år gammel mann med en MSI svulst i cecum som viste tap av MLH1 og PMS2 protein uttrykk. Denne saken viste høy grad av
MLH1
promoter metylering (88%) og ble derfor sannsynlig forbundet med CpG island methylator fenotype (CIMP) [24]. I resten av
MLH1
-deficient svulster, formodentlig bærere av
MLH1
germline mutasjoner, 4 viste svært lave nivåer av metylering (område, 1-2%), og den andre 4 viste middels nivå (range, 25-51%).
LINE-en metylering Analyse
Vi brukte kvantitative bisulfit pyrosekvensering metode for å bestemme metylering status for LINE-1 repeterende sekvenser i CRC. Den gjennomsnittlige metylering i CRC var 59,97% (standardavvik 6,57), som fulgte en normalfordeling (Figur S1). Klinisk-patologisk funksjoner knyttet til LINE-en metylering er vist i tabell 3. En vesentlig forskjell i LINE-en metylering status ble funnet i henhold til tumor beliggenhet, med lavere nivåer av metylering i distal sammenlignet med proksimale svulster (59.02%
vs .
62,3%, p = 0,015). I tillegg ble det en trend mot lavere nivåer av metylering funnet hos kvinner (58,87%
vs
. 60,93, p = 0,092) og i ikke-mucinkjertler tumorer (59,24%
vs.
61,41% , p = 0,096). Ingen forskjeller i LINE-en metylering status ble funnet for noen av de andre klinikk-patologiske funksjoner.
Vi sammenlignet LINE-1 metylering nivåer i denne serien med en annen uavhengig kohort av pasienter med CRC diagnostisert aT 50 år rekruttert i Spania [4], 2 grupper av pasienter med sporadisk CRC diagnostisert 50 år gamle kategorisert etter tilstedeværelse eller fravær av MSI (MSI, n = 46; gjennomsnittsalder: 70,2 + 13,9 år gammel, og MSS, n = 89, gjennomsnittsalder: 70,6 ± 11,4 år), en gruppe av Lynch syndrom CRC (n = 20), og normal tarmslimhinne fra individer uten tumorer (n = 32) (figur 1 og tabell 4 ). Klinisk-patologiske trekk fra begge kohorter av tidlig debut av CRC er avbildet i tabell S3. Begge kohorter var lik i form av svulst plassering og kreft patologiske funksjoner. Som forventet, gjennomsnittlig LINE-1 metylering nivåer i normal tarmslimhinnen var høyere enn i tumorvev for alle grupper. LINE-en metylering nivåer i tidlig debut CRC var 59,9% (SD 6,5) og 51,1% (SD 9.2) for den argentinske og spanske kohortene, henholdsvis. Gjennomsnittlig metylering nivå i kombinerte gruppen av tidlig innsettende CRC (n = 185) var 56,6% (SD 8.6). Interessant, tumor LINE-1 metylering nivåer i de to uavhengige kohorter av tidlig debut CRC var betydelig lavere enn det som ble observert i eldre debut CRC og Lynch syndrom svulster (tabell 4), noe som tyder på at dette representerer en unik funksjon i denne undergruppen av svulster (p 0,0001 for alle sammenligninger). LINE-1 hypometylering nivåene var like i eldre-utbruddet sporadiske MSI svulster (67,1%, SD 5.5), Lynch syndrom CRC (66,3%, SD 4.5), og sporadiske MSS svulster (65,1%, SD 6.3).
Bisulfite pyrosekvensering av LINE-1 i kolorektal vev; Normal slimhinnen (n = 32), tidlig innsettende CRC fra Argentina (n = 116), tidlig innsettende CRC fra Spania (n = 70), eldre utbruddet CRC med mikro stabilitet (MSS; n = 89), eldre utbruddet CRC med mikro ustabilitet (MSI) forbundet med
MLH1
promoter hypermethylation (n = 46) og Lynch syndrom CRC (n = 20) sikret svart horisontale linjen viser gjennomsnittet metylering nivå.
Overlevelsesanalyser
oppfølging var tilgjengelig på alle 118 pasienter, alt fra 1,5 til 195 måneder, med et gjennomsnitt på 39 måneder. Den 3-års overlevelse for alle 118 pasienter i denne serien var 84,7%; 46 pasienter (39%) tilbakefall eller hatt progresjon av sykdom, 22 (18,6%) døde, og 3 pasienter ble ikke fulgt opp. Avansert svulst scenen var signifikant assosiert med en dårligere 3-års total overlevelse (stadium I-II: 92,9% vs. etapper III-IV: 82,9%; p = 0,046, log rank test) og en trend ble observert for bedre overlevelse hos pasienter med mucinkjertler svulster (95,1% vs 82,9%, p = 0,077, log rank test) eller med tumor infiltrerer lymfocytter (96,2% vs 85,2%, p = 0,16, henholdsvis; log rank test). Pasienter med MMR-mangel svulster viste en trend mot en bedre 3-års total overlevelse (96,3%
vs
83,5%, p. = 0,1, log rank).
Neste, vi evaluert effekten av LINE-en hypometylering på total overlevelse av CRC pasienter. Med sikte på å identifisere en cut-off verdi på LINE-en som kan skille en gruppe pasienter med dårligere prognose, ble flere cut-offs som starter fra det laveste nivået på LINE-en metylering evaluert. Vi fant at i forhold til pasienter med 65% LINE-en metylering, de med ≥65% LINE-en metylering hadde signifikant bedre total overlevelse (83,5% vs 100%, p = 0,026, log rank test; p = 0,039 , Fishers eksakte test, figur 2). Sammenligning av klinisk-patological og molekylære funksjoner i pasienter i henhold til nivået av LINE-en metylering er vist i tabell 5. Interessant, svulster med LINE-en metylering ≥65% var oftere mucinous (60,9% vs 24,5%, p = 0,003 ) og de pasientene hadde høyere frekvens av synkron eller metachronous tumorer (13% mot 2,2%, p = 0,054). Multivariat analyse viste mucinkjertler svulster som eneste variabel forbundet med tumor med LINE-1≥65% (OR = 4,32 (95% KI: 1,65 til 11,34); p = 0,003), uavhengig av MMR mangel status
Vertikale merker
indikerer sensurert hendelser. Den grønne linjen representerer overlevelse i CRC med LINE-en hypometylering 65% (n = 92) og den blå linjen representerer LINE-en metylering ≥65% (n = 23). p-verdi for log rank og Fishers eksakte test vises.
Diskusjoner
Flere studier har antydet at tidlig debut CRC utgjør et biologisk distinkt sykdom som er ofte forbundet med avansert stadium, distale svulster, og dårlig prognose. Vi og andre har vist at de kjente arvelige kreftsyndromer bare forklare et mindretall av tidlig debut av CRC tilfeller [2], [4], [5], [13]; følgelig, den sykdomsfremkallende mekanisme i de fleste tilfeller fortsatt ukjent. I denne studien ønsket vi å få ytterligere innsikt i patogenesen av tidlig debut CRC ved å vurdere de klinikk-patologiske og molekylære funksjoner med 118 pasienter med tidlig debut CRC. Det mest interessante og roman resultat vi har observert er at LINE-en hypometylering utgjør en unik egenskap ved tidlig debut av CRC pasienter. LINE-1 hypometylering er en surrogatmarkør for genom-bred hypometylering og er forbundet med økt kromosomal ustabilitet [16], [17]; Derfor kan dette funnet bidra til å forklare noen av de biologiske mekanismene bak tidlig debut CRC. I tillegg har vi funnet at frekvensen av MMR-mangel i denne gruppen er ~ 20%, noe som er i samsvar med tidligere rapporter som kjennetegnes slike populasjoner [4], [5], [6]. Til slutt fant vi ut at
MUTYH
mangel står for ~ 1% av MMR-dyktige CRC. Dette arbeidet og tidligere arbeid hjelp utelukke en rekke mulige forklaringer på tidlig debut CRC.
Kreft er en kompleks sykdom, som oppstår som en følge av både genetiske og epigenetiske forandringer. Humant CRC viser ofte forandringer i DNA-metylering, og det har vært kjent i flere tiår at genom-bred hypometylering er en konsistent biokjemisk karakteristisk for humane kolorektale tumorer [16], [17], [25]. I mus, er DNA hypometylering tilstrekkelig til å indusere T-celle lymfomer [26]. Genome-wide hypometylering spiller en utløsende rolle i kreft gjennom ulike mekanismer: genomisk ustabilitet, transcriptional aktivering av proto-onkogener, aktivering av endogene retrovirus og transposable elementer, og induksjon av inflammatoriske mediatorer. Alle disse mekanismer har blitt assosiert med DNA hypometylering, dårlig prognose og tumor aggressivitet [26], [27], [28], [29], [30], [31]. Gjentatte nucleotide elementer, inkludert lange ispedd nucleotide elementer-1 (dvs. LINE-1) inneholder mange CpG områder, og tidligere studier har vist at nivået av LINE-en metylering er en nøyaktig indikator på celle 5-metylcytosin innhold [18], noe som gjenspeiler den globale DNA metylering. I de senere årene har det vært antydet at LINE-en metylering kan identifisere ulike molekylære undergrupper av CRC. CIMP og MSI er omvendt assosiert med DNA hypometylering, noe som tyder på at genomisk hypometylering representerer en alternativ vei for CRC progresjon, og kan gjenspeile en fundamentalt forskjellig sykdomsprosessen [32], [33]. Dessuten har LINE-en hypometylering vært forbundet med dårligere overlevelse hos pasienter med CRC, og representerer en selvstendig faktor for økt kreftrelatert dødelighet og total dødelighet [20]. Derfor er evaluering av tumoral LINE-en metylering og dens korrelasjon med kliniske og patologiske funksjoner viktig for å bestemme den potensielle kliniske verdien av denne biomarkør.
Vi brukte en kvantitativ analyse for pyrosekvensering LINE-en metylering, som er et robust, nøyaktig og reproduserbar metode for å nøyaktig kvantifisere dette i enkelte svulster [18]. Sammenlignet med eldre-utbruddet kolorektal tumorer, fant vi signifikant lavere nivåer av LINE-en metylering i tidlig-onset CRC. Denne observasjonen ble validert i et uavhengig sett med tidlig debut CRC pasienter, forsterkende styrken til våre konklusjoner. I tillegg fant vi at LINE-en hypometylering var assosiert med distal svulster og dårligere prognose. Selv om det ikke er noen tidligere studier som har spesielt undersøkt LINE-en metylering tidlig debut av CRC pasienter, en fersk studie antydet en sammenheng mellom økt LINE-en hypometylering i CRC og tidligere utbruddet av kreft ( 60 år) [21] . Samlet disse funnene tyder på tilstedeværelsen av en distinkt subtype av CRC med en unik patogen mekanisme [4], [13]. Siden graden av LINE-en hypometylering er en prognostisk markør i CRC og våre data viser at LINE-en hypometylering er et karakteristisk trekk ved tidlig debut CRC, denne studien gir en ny og tidligere ukjent forklaring på noen av de biologiske forskjellene (tumor beliggenhet, prognose og patologiske funksjoner) som er involvert i tidlig-onset CRC. Disse resultatene gir en mulighet til å forbedre vår forståelse av mekanismen bak tidlig debut CRC. I denne forbindelse er vi nå undersøker om LINE-en hypometylering fører til direkte transcriptional reaktivering av visse proto-onkogener i denne innstillingen, en unik funksjon som kan bidra til å forklare den aggressive klinisk atferd tidlig debut CRC. I tillegg er våre resultater gir opphav til hypotesen om at LINE-en hypometylering i perifert blod kan også bli vurdert som en prognose markør i tidlige debut CRC.
Lynch syndrom er den hyppigste arvelig årsak til CRC, og står for ca 1-3% av alle CRC [7]. Det er en autosomal dominant tilstand forårsaket av germline mutasjoner i DNA MMR gener (
MLH1, MSH2, MSH6, PMS2
), og
MSH2 Hotell og
MLH1
konto for ~ 90% av identifiserbare familier. Dette syndromet har en gen-avhengig variabel pene for CRC og livmorkreft, og en økt risiko for ulike andre extracolonic svulster. Diagnosen Lynch syndrom er tradisjonelt basert på tumor MMR mangel analyse når det er mistanke om denne sykdommen [10], [11], men den definitive diagnosen er etablert ved å finne en skadelig germline mutasjon i en DNA MMR genet. Men å oppdage Lynch syndrom er en særlig utfordring i fravær av en pålitelig familiehistorie. Av denne grunn har universell screening med tumor MMR-mangel analyse blitt foreslått [34], [35]. Vi har tidligere vist at MMR mangel står for opptil 20% av tidlig debut CRC tilfeller [4], [5]. Vi fant også at mønsteret av MMR-mangel i tidlige debut CRC pasienter er ikke identisk med den for alle Lynch syndrom tilfeller, og er preget av økt hyppighet av MSH6 og PMS2 mangel. En annen diagnostisk utfordring er MSH6-mangel CRC, da disse kan bli savnet dersom screening algoritmen baserer seg helt og holdent på MSI testing og inkluderer ikke MMR immunhistokjemi [22]. I denne studien har vi evaluert MMR status på en argentinsk populasjon av tidlig debut CRC ved å analysere både MSI og immunhistokjemi av de fire MMR proteiner. Tjue syv (22,9%) svulster ble klassifisert som MMR mangelfull. MSH2 og MLH1 mangel stod for de fleste tilfeller, men opp til 20% skyldtes enten MSH6 eller PMS2 mangel. Én av ni MLH1-mangelfull tilfeller hadde en
BRAF
mutasjon, som vanligvis er forbundet med
MLH1
promoter hypermethylation.
