Abstract
I denne studien, en ny apoptotisk monoterpenoid indol alkaloid, subditine (1), og fire kjente forbindelser ble isolert fra barken av
Nauclea subdita
. Komplett
1H og
ble rapportert 13C- NMR data av den nye forbindelsen. Strukturene av isolerte forbindelser ble belyst med forskjellige spektroskopiske metoder som 1D- og 2D-NMR, IR, UV og LCMS. Alle fem forbindelser ble screenet for cytotoksiske aktiviteter på LNCaP og PC-3 menneskelige prostatakreftcellelinjer. Blant de fem forbindelser, det nye alkaloid, subditine (1), viste den mest potente cellevekst inhiberende aktivitet og selektiv mot LNCaP med en IC
50 til 12,24 ± 0,19 uM og PC-3 med en IC
50 av 13.97 ± 0.32 uM, sammenlignet med RWPE human normal epitelial cellelinje (IC
50 = 30,48 ± 0,08 uM). Subditine (1) behandling indusert apoptose i LNCaP og PC-tre som gjenspeiles av økt celle permeabilitet, forstyrrelse av cytoskeletal strukturer og økt kjernefysisk fragmentering. I tillegg subditine (1) forbedrede intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) produksjon, reflektert ved øket ekspresjon av glutation reduktase (GR) for å nøytralisere skadelige frie radikaler i begge prostatakreftcellelinjer. Overdreven ROS kan føre til forstyrrelse av mitokondriemembranen potensial (MMP), frigjøring av cytokrom c og påfølgende caspase 9, 3/7 aktivering. Ytterligere Western blot-analyser viste subditine (1) induserte nedregulering av Bcl-2 og Bcl-xl uttrykk, mens p53 var oppregulert i LNCaP (p53-vill-type), men ikke i PC-3 (p53-null) . Totalt sett, våre data viser at den nye forbindelsen subditine (1) utøver anti-proliferativ effekt på LNCaP og PC-tre menneskelige prostata kreft celler gjennom induksjon av apoptose
Citation. Liew SY, Looi CY, Paydar M, Cheah FK, Leong KH, Wong WF, et al. (2014) Subditine, en New Monoterpenoid Indole Alkaloid fra Bark av
Nauclea subdita plakater (Korth.) Steud. Induserer apoptose i Human prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (2): e87286. doi: 10,1371 /journal.pone.0087286
Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan
mottatt: 16 august 2013; Godkjent: 20 desember 2013; Publisert: 14. februar 2014
Copyright: © 2014 Liew et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble finansiert av Universitetet i Malaya stipend RP001 /2012; University of Malaya High Impact stipend UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /37 og HIR: E00002-20001; French National Center for Scientific Research CNRS gi 57-02-03-1007; og praktisk forskning Funds av University of Malaya (PV050 /2012A). Dette arbeidet ble utført innenfor rammen av en offisiell avtale mellom CNRS og Universitetet i Malaya (Malaysia). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Rubiaceae familien (Madder familie) er en av de største av de angiosperms med mer enn 637 slekter og nesten 10 700 arter [1]. Slekten
Nauclea
som tilhører denne familien, består av ca 35 arter på verdensbasis [2] og i Malaysia, er det to
Nauclea
arter;
N. officin Hotell og
N. subdita product: [3].
Nauclea subdita plakater (Korth.) Steud. er en tropisk plante som vokser i lavlandet til skoger, i myrlendt steder, og ofte langs bekker og elver [4]. Det er en liten eller mellom tre til 25 m høy og 60 cm omkrets [3]. Plantene fra denne slekten er kjent for å fremstille interessante monoterpenoid indol-alkaloider med høy strukturelle diversitet som naucline [5], nauclealines B [6] og naufoline [7]. Mange av dem oppviste betydelige biologiske aktiviteter; anti-konvulsiv [8], anti-proliferativ [9] og vasorelaxant aktiviteter [5].
Prostatakreft er den hyppigste diagnosen kreft blant menn i den industrialiserte verden. Anslagsvis 238,590 nye tilfeller vil bli diagnostisert og 29,720 dødsfall vil følge av prostatakreft i USA i 2013 (Cancer Tall og fakta 2013, American Cancer Society, 2013). Selv om mekanismene som driver prostatakreft ikke er helt forstått, alder, rase, og familiens historie av prostatakreftpasienter har vist seg å være de potensielle faktorer nært knyttet til denne dødelige sykdommen [10].
I vårt løpende arbeid med å søke etter nye og bioaktive kjemiske bestanddeler fra Malaysia flora [11] – [15], en ny cytotoksisk og apoptotisk monoterpenoid indol alkaloid, subditine (1), har blitt isolert fra barken av
Nauclea subdita
sammen med de fire kjente alkaloider; angustoline (2) [11], [16], [17], angustidine (3) [18], [19], angustine (4) [20], [21], nauclefine (5) [22], [23 ] (Figur 1). I det foreliggende papir, rapporterer vi isolering og karakterisering av subditine (1), de cytotoksiske aktivitetene til alkaloider 1-5 samt apoptotisk mekanisme av en mot humane prostatakreftceller LNCaP og PC-3.
strukturen av nye forbindelsen, subditine (1) ble belyst ved hjelp av ulike spektroskopiske metode som var 1D-NMR (
1 H,
13C, DEPT), 2D-NMR (HSQC, HMBC, NOESY), UV, IR og LCMS mens strukturen i de fire andre kjente forbindelser ble bekreftet gjennom sammenligning av NMR data med litteraturverdier.
Materialer og metoder
Generelle prosedyrer
1D – og 2D-NMR ble registrert i deuterert kloroform (CDCh
3) (Merck, deutereringsgrad min 99,8%.) med JEOL LA 400 MHz FT NMR og JEOL ECA 400 MHz FT NMR spektrometer. Massespektrene ble erholdt på et Shimadzu LCMS-IT-TOF. Det ultrafiolette absorpsjons-spektra ble oppnådd ved bruk av et Shimadzu UV-250 UV-Visible spektrometer. Solvent brukte var metanol (CH
3OH). IR-spektrene ble oppnådd på et Perkin Eimer Spectrum 400-FTIR Spectrometer med CHCb
3 som oppløsningsmiddel. Alle løsemidler, unntatt de som brukes for bulk utvinning er AR klasse. Silica gel 60 (Merck, 0,040-0,063 mm) ble anvendt for kolonnekromatografi (CC). Aluminium understøttet kiselgel 60 F
254 plater 20 x 20 cm ble anvendt for tynnskiktskromatografi (TLC) (Merck, Tyskland). Preparativ tynnsjiktskromatografi (PTLC) silikagel 60 F
254 glassplater 20 x 20 cm (Merck, Tyskland) ble benyttet for separering av forbindelser som ikke kan separeres ved konvensjonell kolonnekromatografi. TLC flekker ble visualisert under UV-lys (254 og 365 nm), fulgt av sprøyting med Dragendorff reagens for påvisning alkaloid. Et positivt testresultat ble indikert ved dannelsen av oransje flekker.
Plant Material
Barken av
Nauclea subdita
ble samlet inn på Hutan Simpan Bukit Kinta, Chemor, Perak, Malaysia ved phytochemical gruppen ved Institutt for kjemi, fakultet for naturvitenskap, Universitetet i Malaya. Bilaget eksemplarer (KL 5254) av disse anleggene ble avsatt på Herbarium av Institutt for kjemi, Universitetet i Malaya, Kuala Lumpur, Malaysia. Plant samlingen har blitt godkjent av lederen for Jabatan Perhutanan Negeri Perak (Perak State Forestry Department). Feltstudiene ikke involverer truede eller vernede arter.
Utvinning og isolasjon
Tørket, jordet bark av anlegget (1,7 kg) ble først avfettet med heksan (17 liter) i 3 dager på romtemperatur. Den hexan-ekstrakt ble filtrert og tørket ved romtemperatur. Da de tørkede plantematerialer ble fuktet med ammoniakkløsning og bløtlagt i 2 timer. De ble ekstrahert med CH
2 Cl
2 (17 liter) to ganger for en 3-dagers periode. Den oppnådde supernatant ble konsentrert ved hjelp av rotasjonsfordamper under redusert trykk til et volum på 500 ml og undersøkt for sin alkaloid innhold (under anvendelse av TLC og bekreftet ved sprøyting med Dragendorff reagens). Ekstraktet ble til slutt inndampet for å gi diklormetan råekstrakt (5,0 g). Den rå ekstrakt ble utsatt for CC over silikagel 60 ved hjelp av CH
2 Cl
2 og MeOH løsemiddel (100:0, 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94 :6, 90:10, 83:17 og 75:25) og til slutt med 100% MeOH ble anvendt som elueringsmiddel. Ved å sammenligne TLC mønstre av disse fraksjonene ble femten fraksjoner endelig oppnådd.
Rensing av forbindelse
Videre rensing av brøkdel 5 ved PDC ga alkaloid 1 (10,6 mg, MeOH-CH
2 Cl
2; 98:2: mettet med NH
4OH). Begge kjente forbindelser av 3 (5,5 mg, MeOH-CH
2 Cl
2; 98:2: mettet med NH
4OH) og 5 (6,2 mg, MeOH-CH
2 Cl
2 ; 98:2: mettet med NH
4OH) ble oppnådd etter rensing ved PDC fra brøkdel syv mens forbindelser 2 (7,5 mg, MeOH-CH
2 Cl
2; 95:5: mettet med NH
4OH) og 4 (12,5 mg, MeOH-CH
2 Cl
2; 98:2: mettet med NH
4OH) ble oppnådd fra fraksjon av henholdsvis tolv og seks
Alkaloid. 1
gulaktig amorft stoff; UV (MeOH) λ
max (log ε): 393, 377, 210 nm; IR (CHC
3) ν
max: 3430, 1640 cm
1; for
1H og
13C-NMR spektroskopiske data, se tabell 1; LCMS -IT-TOF på
m /z
330.1018 [M + H]
+ for C
20H
15N
3O
2 (beregn. For C
20H
15N
3O
2:330.1237).
Cell Culture
menneskelig prostata normal cellelinje (kreftcelle RWPE-1) og menneskelige prostata linjer; LNCaP og PC-3, ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, USA). LnCap og PC-3-celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1% penicillin og streptomycin. RWPE-1-celler ble opprettholdt i keratinocytt Serum Free Medium (K-SFM, ATCC) supplert med bovint hypofyseekstrakt (BPE) og human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF). Medier ble supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (Sigma)., 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Flowlab, Sydney, Australia). Alle celler ble opprettholdt i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i luft ved 37 ° C inkubator.
Cell Proliferation Assay
Den anti-proliferativ aktivitet ble evaluert ved å utføre MTT-analyser som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [24]. I korthet ble cellene utsådd 24 timer før behandling i en 96-brønners plate ved 5 x 10
4 celler /brønn for å oppnå 70% til 80% konfluente kulturer. Forbindelsene ble oppløst i DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) fulgt av en 2 x seriefortynning for 10 poeng varierte fra 0,825 uM til 100 uM. 96-brønners platen ble inkubert i 24 timer ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Ved slutten av inkubasjonen ble 50 ul av MTT-oppløsning (2 mg /ml; Sigma) ble tilsatt til hver brønn. Platen ble deretter inkubert i 4 timer. Alt medium ble fjernet og den lilla formazan krystall er dannet i bunnen av brønnene ble oppløst med 200 ul DMSO i 20 minutter. Absorbansen ved 570 nm ble lest på en spektrofotometrisk plateavleser (Hidex). Andelen av overlevende celler ble beregnet som:.
Dose-responskurver ble konstruert for å oppnå IC
50 verdier. Eksperimentelle data ble utledet fra 3 uavhengige eksperimenter. Selektiviteten indeksen ble oppnådd ved gjennomsnittlig IC
50 RWPE-1 /bety IC
50 av LNCaP eller PC-3.
Cellomics Multiparameter analyse
Cytotoksisitet 3 kit (Thermo Scientific ) ble anvendt som tidligere beskrevet [25]. I korthet, 24 timer etter subditine (1) behandling, MMP fargestoff og cellen permeabilitet fargestoff ble tilsatt til levende celler og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Celler ble fiksert, permeabilisert, blokkert med 1x blokkeringsbuffer før probing med primær cytokrom c og sekundære DyLight 649 konjugerte geit-anti-muse-IgG-antistoff i 1 time hver. Hoechst 33342 ble tilsatt til fargeløsning. Platene ble deretter analysert ved hjelp av ArrayScan høyt innhold screening (HCS) system (Cellomics, PA, USA). Data ble tatt til fange, ekstrahert og analysert med ArrayScan II datainnsamling og data Viewer versjon 3.0.
ROS-analysen
Produksjon av intracellulær ROS ble oppdaget som beskrevet tidligere [26]. Den DHE fargereagens omdannes til fluoriserende etidium og skytes inn i DNA som reaksjon intracellulær ROS. I korthet, ble 10 mM DHE stamløsning (i metanol) fortynnet 500-ganger i HBSS uten serum eller andre additiver for å gi en 20 uM arbeidsløsning. Etter eksponering for subditine (1), ble cellene i 96-brønns sort plate ble vasket to ganger med HBSS og så inkubert i 100 pl arbeids oppløsning av DHE ved 37 ° C i 30 minutter. Fluorescens av DCF i hver celle ble tatt til fange, ekstrahert og analysert med ArrayScan II datainnsamling og data Viewer versjon 3.0 (Cellomics).
Gene Expression Profilering
LNCaP og PC-3 celler ble behandlet med subditine (1) (12,5 uM) i 18 timer. RNA ble ekstrahert fra PC-3 eller LNCaP-celler ved bruk av RNeasy pluss mini-sett (Qiagen). 1 mikrogram av RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av RT2 første strand kit (SA biovitenskap, Qiagen) .cDNA ble blandet med RT2 Real Time ™ SYBR Grønn /fluorescein PCR Master-mix og lastet inn i hver 96 brønner av Human Oksidativt stress og antioxidant Defense qPCR utvalg i henhold til produsentens protokoll (SA biovitenskap, Qiagen). I korthet ble et totalt volum på 25 ul av PCR-blanding som omfattet 12,5 ul Mastermix, 11,5 ul dobbeltdestillert vann og 1 mL av cDNA som er lagt inn i hver av 96wells. qPCR ble gjort ved hjelp av StepOne PLUS real-time PCR maskin (Applied Biosystems). PCR-amplifikasjon ble utført ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min. MRNA uttrykk for hvert gen ble normalisert til gjennomsnitts uttrykk for fem housekeeping gener:
β-aktin (ACTB), β-2-mikroglobulin (β2M), hypoxantin phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1), ribosomalt protein L13a ( RPL13A) og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH). Den ΔΔCt metoden ble brukt for dataanalyse. Fold endringer ble beregnet for hvert gen som forskjellen i genuttrykk mellom subditine (1) eller ikke-behandlet kontroll ved hjelp av RT Profiler qPCR-tabellens dataanalyse programvare.
Sanntids qPCR analyse
Total RNA ble ekstrahert fra PC-3 eller LNCaP-celler ved bruk av RNeasy pluss mini-sett (Qiagen). RNA (1 ug) ble reverstranskribert inn i cDNA ved anvendelse av iScript cDNA syntese kit (Biorad). QPCR ble utført på StepOne PLUS real-time PCR maskin (Applied Biosystems) ved hjelp SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) i henhold til produsentens protokoller. Primere ble kommersielt syntetisert av Integrerte DNA Technologies (IDT). Mål-mRNA-verdier ble normalisert ved hjelp av β-aktin mRNA og data ble uttrykt i forhold til normaliserte verdier av tilsvarende kontroller. Prøvene ble analysert i tre uavhengige eksperimenter i triplikater. Primere benyttet ble oppført nedenfor, etter
GR Forward primer, AACATCCCAACTGTGGTCTTCAGC
GR Reverse primer, TTGGTAACTGCGTGATACATCGGG
β-aktin Forward primer, GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC
β-actin omvendt primer, AGTCCATCACGATGCCAGTGGT
Bioluminescent Analyser av caspase-3/7, -8 og -9
En tidsavhengig studie av caspase-3/7, -8 og -9 aktiviteter var utført in triplo ved bruk av undersøkelseskit Caspase-Glo 3/7, 8 og 9 (Promega Corp., Madison, WI, USA) på hvite 96-brønns mikroplate som tidligere beskrevet [27]. En total på 10.000 celler pr brønn ble sådd ut og behandlet med 12,25 uM av subditine (1) for 6, 12, 18, 24 og 30 timer. Deretter ble 100 mL av caspase-Glo reagens tilsatt, inkubert ved romtemperatur i 30 minutter og målt ved hjelp Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Mannedorf, Swizerland) mikroplateleser.
Western blotting
for å bestemme protein uttrykk, en
×
10
6 celler /ml var seeded og behandlet med subditine (1) eller paclitaxel i 24 timer. Hele celleekstrakter ble fremstilt som tidligere beskrevet [28]. I korthet ble cellene oppsamlet, lysert og løst i 10% SDS-polyakrylamidgeler. Etter elektroforese ble proteinene overført til PVDF-membraner (Millipore), blokkert med 5% fettfri tørrmelk i PBS-T (0.05% Tween 20) i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble probet med primært kanin-anti-Bcl-2, Bcl-XL eller p53-antistoff, etterfulgt av pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundær anti-kanin-antistoff (Cell Signaling Technology Inc., CA, USA). Membraner ble strippet og reprobed med mus anti-
β
aktin antistoff som lasting kontroll (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Protein-antistoffkomplekser ble påvist med Amersham ECL prime Western blotting deteksjonsreagensen (GE Healthcare, USA).
Statistical Analysis
Alle verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. Statistiske analyser ble evaluert ved t-test. Sannsynlighetsverdier * p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Diskusjon
diklormetan ekstrakt av barken på
Resultater og
Nauclea subdita
ble utsatt for kolonnekromatografi på silikagel 60. med gradienteluering system av diklormetan (CH
2 Cl
2) og metanol (MeOH), som ga 15 fraksjoner. Ytterligere rensing av fraksjonene ved hjelp av preparativ tynnsjiktkromatografi ga subditine (1) og fire kjente alkaloider; angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5). Strukturelle identifikasjon av ett ble foretatt av 1D-, 2D-NMR, UV, IR og LCMS mens strukturen av kjente forbindelser (2-5) ble identifisert ved sammenligning av NMR-data med litteraturverdiene.
Karakterisering av Subditine (1)
Subditine (1) ble isolert som et gulaktig, amorft, fast stoff. Den LCMS-IT-TOF-spektrum viste en topp pseudomolecular ion [M + H]
+ i
m /z 330,1018
, svarende til molekylformelen C
20 H
15N
3O
2 (calc. 330,1237). IR-spekteret av en viste et absorpsjonsbånd ved 1645 cm
-1, en indikasjon på en konjugert laktam karbonyl funksjonalitet [18].
I
1H-NMR-spektrum, tilstedeværelse av to dubletter ved δ
H 7,62 (1H,
d
,
J
= 7,8 Hz, H-9) og δ
H 7,47 (1H,
d
J
= 8,2 Hz, H-12), to dublett ved δ
H 7,34 (1 H,
dd
,
J
= 8,2, 7,1 Hz, H-11) og δ
H 7,19 (1 H,
dd
,
J
= 7,8, 7,1 Hz, H-10), to methylenes ved δ
H 4,51 (1H,
m
, H-5) og δ
H 3,16 (1 H,
m
, H-6), noe som tyder på en naucleamide derivat med substitusjonsmønster i ring A og C [29]. Videre er dette tetrahydro-
β
karbo skjelett (ring A, B og C) ble angitt med HMBC korrelasjoner av H-5 til C-3 (δ
C 139,4) og C-7 ( δ
C 117,1), H-6 til C-2 (δ
C 127,3) og C-7, H-9 og H-11 til C-13 (δ
C 138,7) (Figur 2 ). En bred singlett ved δ
H 8,94 antydet nærvær av en NH-enhet. Den
13C-NMR og DEPT-spektra av en antydet et totalt tyve karbonsignaler; en metyl-, to metylen, seks metan, ni kvaternært karbon og to karbonyl (tabell 1). Karbonylgruppen av laktamringen gjenklang på δ
C 161,7. I tillegg HMBC-spekteret viste korrelasjon mellom H-14 (δ
H 7,97) og C-3, H-14 og C-16 (δ
C 119,3), H-5 (δ
H 4,51) og C-20 (δ
C 161,7), for således å støtte nærvær av en δ laktamringen. Videre HMBC korrelasjoner fra H-14 til C-16 og C-21 (δ
C 127,6), H-17 (δ
H 9,57) til C-15 (δ
C 141,1) og C- -16, H-18 (δ
H 2,98) til C-22 (δ
C 165,9), H-19 (δ
H 10,72) til C-21 (δ
C 127,6) indikerte at ring D er koblet til en nicotinaldehyde ring (ring E) med en metyl-gruppe som danner en to-methylnicotinaldehyde enhet. Subditine (1), har en nauclefine type skjelett [30], og det er svært lik den kjente forbindelse, angustidine (3) med unntagelse av at den førstnevnte har en ekstra karbonylgruppe ved C-21.
1 H og
13C verdier for begge forbindelser er oppført i tabell 1. Komplett
1 H og
13C-NMR oppdrag ble etablert av grundig analyse av COSY, HMBC, HSQC og NOESY data.
biologisk analysen
subditine (1) potent hemmet cellevekst av LNCaP og PC-3 prostata kreft celler.
Den anti-kreft effekt diklormetan råolje, subditine ( 1), angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5) og ble evaluert på humane prostatakreftceller LNCaP og PC-3 av MTT-analyser. IC
50-verdier (dose som kreves for å inhibere den proliferative respons med 50%) for hver forbindelse er vist i tabell 2. Subditine (1) viste god inhiberende virkning mot LNCaP-celler ved IC
50 12.24 ± 0.19 uM mens IC
50 for angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5) var henholdsvis 58,09 ± 0,05 uM, 140,27 ± 0,10 uM, 149.16 ± 0,09 uM og 86,35 ± 0,09 uM. Lignende funn ble erholdt på PC-3-celler, hvor subditine (1) viste den høyeste aktiviteten (IC
50 = 13,97 ± 0,32 uM) sammenlignet med de andre forbindelsene. Disse funnene støtter at subditine (1) er den mest potente cytotoksiske forbindelsen mellom fem testet.
Deretter testet vi cytotoksisitet effekten av subditine (1) på RWPE-en (humane normale prostata epitelceller ). MTT-analysen viste en høyere IC
50 verdi på 30,48 ± 0,08 uM, hvilket indikerer at subditine (1) er 2,5 og 2,2 foldene mer potent mot LNCaP og PC-3 (selektivitet indeks (SI): [LNCaP /PC-3] = 2.49 /2.18) prostatakreftceller enn de normale prostataceller; RWPE-en. I motsetning til standard narkotika paclitaxel viste mindre selektivitet (SI: [LNCaP /PC-3] = 1,24 /1,19) ved å stille IC
50 verdier på 1,27 ± 0,04 mikrometer, 1,33 ± 0,02 mikrometer og 1,58 ± 0,06 mikrometer mot LNCaP, PC-3 og RWPE-en hhv.
Subditine (1) indusert cytoskeletal omorganisering og atom fragmentering.
Siden subditine (1) betydelig hemmet LNCaP og PC-tre cellevekst, denne forbindelsen var valgt for videre mekanistiske undersøkelser. Cytoskeletal og kjernefysiske morfologiske endringer av LNCaP og PC-3 celler ble undersøkt ved phalloidin (detekterer F-aktin) og Hoechst 33342 farging. Resultatene viste at noen subditine (1) behandlede-celler vises cellekrymping med punctata farging av F-aktin ved den perifere membran (figur 3). Ved konsentrasjon 12,5 pM og 25 pM, kjernekondensering og fragmentering ble påvist etter 24 timer etter subditine (1) behandling (figur 4). Atom intensitet, tilsvarende apoptotiske kromatin endringer ble betydelig økt etter subditine (1) behandling i LNCaP og PC-3 celler (figur 4,
P
0,05). Disse resultatene tyder på at subditine (1) behandling induserte apoptose i LNCaP og PC-3 prostata kreftceller.
LNCaP og PC-3-celler ble behandlet med subditine (1) i forskjellige konsentrasjoner i 24 timer. Celler ble fiksert og farget med Hoechst (blå) og phalloidin (rød) fargestoff som farget kjerne og polymerisert aktin (F-aktin), respektivt. Stolpediagram som viser gjennomsnittlig fluorescerende intensitet phalloidin (gjennomsnitt ± S.D .; * p 0,05). Doseavhengig økning av phalloidin intensitet i LNCaP-celler ble observert etter subditine behandling.
LNCaP og PC-3-celler ble behandlet med subditine (1) (12,5 uM og 25 uM) i 24 timer. Cellene ble deretter fiksert og farget med Hoescht 33342 (blå). Røde sirkler angir DNA krymping eller fragmentering. Bilder ble tatt med Cellomic arrayscan system.
Subditine (1) fremmet reaktive oksygen arter (ROS) produksjon.
ROS er naturlige biprodukter av den normale metabolismen av oksygen. Imidlertid kan ROS nivået øke dramatisk på miljø eller kjemisk stress (f.eks nærvær av cytotoksiske agent). For å undersøke om eksponering av subditine (1) fremmer ROS produksjon, farget vi levende celler med DHE fargestoff, 24 timer etter subditine (1) behandling. DHE er raskt oksidert til DCF av ROS og de fluorescerende intensiteter ble kvantifisert med Cellomics høyt innhold Screening. Som vist i figur 5, er nivået av DCF fluorescens i LNCaP og PC-3-celler behandlet med subditine (1) signifikant økte på en doseavhengig måte.
LNCaP og PC-3-celler ble behandlet med subditine (1) (12,5 uM, 25 uM, 50 uM) i 24 timer. Cellene ble deretter fiksert og farget med DHE fargestoff. ROS-nivåer ble indirekte bestemmes ved å måle DHE fargestoff innlemmelse i atom hjelp Cellomic HCS arrayscan. Økt DHE fargestoff intensitet i kjernen ble oppdaget ved behandling av subditine. Hoechst (blå) og DHE fargestoff (grønn). Stolpediagram som viser den gjennomsnittlige fluorescerende intensiteten av DHE flekken (gjennomsnitt ± S.D .; * p 0,05)
Sammenheng mellom prostatakreft risiko og oksidativt stress har blitt godt anerkjent.. Det er betydelig bevis som tyder på oksidativt stress bidrar til etiologi og patogenese av prostata kreft. Gitt at mitokondriene er en viktig kilde til ROS, kan endrede mitokondrielle bioenergi til grunn for utvikling av prostatakreft. Videre har høye nivåer av ROS blitt detektert i en rekke humane cellelinjer, så vel som i forskjellige humane vev. Noen bære bevis tyder på at økt ROS generasjon kan være et resultat av onkogen transformasjon. Iboende oksidativt stress kan påvirke flere funksjoner i kreftceller eller svulstvev som celleproliferasjon, fremming av mutasjoner og genetisk ustabilitet, endringer i cellular følsomhet for anti-kreft agenter, invasjon og metastasering. Målrette ROS produksjon heller enn ROS nøytralisering kan tilby en ny mekanisme for å bekjempe prostatakreft og kanskje andre kreftformer.
Subditine (1) indusert glutation reduktase genuttrykk.
Som vi viste at subditine (1 ) har vist at det kan indusere ROS i celler, bestemte vi oss for å bruke menneskelige oksidativt stress og antioksidantforsvar sanntid profiler qPCR-array å kvantifisere genuttrykk endringer i PC-3 eller LNCaP celler behandlet med subditine (1). Dette qPCR-matrise inneholder 84 gener involvert i cellulær stressrespons og redoks kontroll og omfatter alle de seks medlemmene av antioksidant peroxiredoxin (PRDX) familie.
oksidativt stress og antioksidant-relaterte gener blir uttrykt forskjellig i PC-3 eller LNCaP-celler i respons til subditine (1). Interessant, la vi merke til at glutation reduktase (GR) var signifikant oppregulert (
P
0,05) i begge prostatakreftcellelinjer i forhold til å kontrollere celler (fig 6A.). Den ganger endring er mer drastisk i LNCaP (mer enn 100 ganger) i forhold til PC-3 (mer enn 20 ganger) celler. Etterfølgende uavhengig qPCR analyse viste også at dette genet er oppregulert i subditine (1) behandlede celler, i samsvar med våre qPCR matrise resultater (Fig. 6B).
LNCaP og PC-3 celler ble behandlet med subditine (1) (12,5 uM) i 18 timer. (A) Humant oksidativt stress og antioksidantforsvar qPCR-matrise ble anvendt for å identifisere gener i betydelig grad opp- eller ned-reguleres i subditine (1) -behandlet LnCap eller PC-3-celler. Gene profilerings analyser ble utført tre ganger i uavhengige eksperimenter. (Pil indikerer plasseringen av GR i spredningsplott) (B) Transkripsjon endringer av GR ble evaluert ved hjelp av kvantitativ real-time-PCR. Nivåer av GR mRNA ble normalisert ved hjelp av β-aktin husholdningsgenet og uttrykt som ganger endring i sammenligning med ubehandlet kontroll.
GR er et viktig enzym som er involvert i den fangende av aktive oksygenarter. Våre resultater tyder på at økt ROS produksjon av subditine (1) kunne stimulere GR
de novo
syntese. GR er kjent for sin anti-oxidant funksjon og vanligvis brukt som en indikator for oksidativt stress. Oppregulering av GR kan være en av den cellulære antioksidant forsvarsmekanisme som svar på økende ROS. Imidlertid kan overflødig produksjon av reaktive oksygenarter velde antioksidantsystem, som utløser en kaskade av hendelser som fører til lipid-proteinskade, frakobling av oksidativ fosforylering og til slutt resulterer i apoptose.
Subditine (1) øket membran permeabilitet, redusert mitokondriemembranen potensial (MMP) og økt cytokrom c utgivelse.
for å få en bedre innsikt i mekanismen av subditine (1) stimulert cytotoksisitet, endringene i membran permeabilitet, mitokondriemembranen potensial (MMP) og cytokrom c lokalisering etter subditine (1) behandlinger ble målt. Som forventet, subditine (1) -behandlet LNCaP og PC-3-celler demonstrerte høyere membranpermeabilitet sammenlignet med kontrolldyr som de behandlede celler gjennomgår apoptose på grunn av cytotoksisk aktivitet av forbindelsen (figur 7A og 7B). I tillegg viste resultatene at subditine (1) behandling forårsaket tap av MMP, noe som tyder på en sannsynlig mekanisme for celledød. Som vist i figur 6A, MMP fargestoff farget sterkt i cytoplasma av kontrollceller sammenlignet med subditine (1) -behandlede celler. LNCaP og PC-3-celler behandlet med subditine (1) i 24 timer viste doseavhengig reduksjon av MMP fluorescens intensitet (figur 7B), som reflektert sammenbruddet av MMP. På den annen side, viste subditine (1) som ble behandlet-LNCaP og PC-3 økte fluorescerende farging i cytosol sammenlignet med kontrollen, indikerer cytokrom c frigjøring (figur 7A og 7B). Disse resultatene tyder på at subditine (1) utløses tap av MMP og etterfølgende translokasjon av cytokrom c fra mitokondrier inn i cytosol i LNCaP og PC-3-celler.
LnCap og PC-3-celler ble behandlet med subditine (1 ) i 24 timer. Cellene ble deretter fiksert og farget med membranpermeabilitet fargestoff, MMP, cytokrom c og Hoechst som beskrevet i Materialer og Metoder. (A) fargede celler ble visualisert ved hjelp av HSC arrayscan system for å kontrollere kjernefysisk morfologi, membran permeabilitet, MMP integritet, cytokrom c utgivelse; Blå (kjernekraft), Grønn (Membran permeabilitet), Rød (MMP), Cyan (cytokrom c release). (B) Bar diagram som viser den gjennomsnittlige fluorescerende intensiteter av membran permeabilitet, MMP og cytokrom c (gjennomsnitt ± SD; * p 0,05)
Subditine (1) aktivert caspase 9 og 3/7..
frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene aktiverer nedstrøms caspase molekyler og føre til apoptotisk celledød. For å undersøke dette, bioluminescent intensitetene av caspase-3/7, -8, -9 aktivitetene til subditine (1) -behandlet LNCaP og PC-3-celler på 6, 12, 18, 24, eller 30 timer tidspunkter ble målt . Som vist i figur 8, betydelig økning av caspase-3/7, -9 aktivitet ble påvist i både LNCaP og PC-3-celler etter 12 og 24 timer med subditine (1) eksponering. Den høyeste aktivitet for caspase-9 i begge cellelinjene ble observert etter 24 timers behandling med subditine (1). På den annen side, caspase-3/7-aktivitet nådde en topp etter 18 timers behandling og gradvis redusert på senere tidspunkter (24 og 30 timer). Hverken LNCaP eller PC-3-celler oppviste noen induksjon av caspase-8-aktivitet i løpet av 30 timer med subditine (1) behandling.
