Abstract
kreft stamceller (CSC) har reist stor spenning i løpet av det siste tiåret, og er lovende mål for en effektiv behandling av svulster uten tilbakefall og metastaser. Blant de ulike metoder som gjør det mulig å berike kreftcellelinjer i CSC, har tumorspheres kultur vært hovedsakelig brukt. I denne rapporten, forsøkte vi å generere tumorspheres fra flere murine og humane kreftcellelinjer: B16-F10, HT-29, MCF-7 og MDA-MB-231 celler. Tumorspheres ble oppnådd med variable effektivitet fra alle cellelinjer bortsett fra MDA-MB-231 celler. Deretter studerte vi flere CSC egenskaper i både tumorspheres og adherente kulturer av B16-F10, HT-29 og MCF-7 celler. Uventet, tumorspheres dannende celler var mindre klonogene og, i tilfellet av B16-F10, mindre proliferativ enn festede celler. I tillegg gjorde vi ikke observere noen berikelse i befolkningen uttrykker CSC overflatemarkører i tumorspheres fra B16-F10 (CD133, CD44 og CD24 markører) eller MCF-7 (CD44 og CD24 markører) celler. Tvert imot, tumorspheres kulturen i HT-29 celler syntes å berike i celler som uttrykker kolon CSC markører,
vil si.
CD133 og CD44 proteiner. For B16-F10-cellelinjen, når 1 000-celler ble injisert i syngenisk i C57BL /6 mus, tumorspheres-dannende celler viste en signifikant lavere tumorfremkallende potensiale enn adherente celler. Til slutt, tumorspheres kultur av B16-F10 celler induserte en nedregulering av vimentin noe som kan forklare, i det minste delvis, den nedre tumorgenisiteten av tumorspheres-dannende celler. Alle disse resultater, sammen med litteraturen indikerer at tumorspheres kultur av cancercellelinjer kan indusere en anrikning i CSC, men i en cellelinje-avhengig måte. Som konklusjon må omfattende karakterisering av CSC egenskaper i tumorspheres avledet fra en hvilken som helst cancercellelinje eller kreftvev bli utført for å sikre at den genererte tumorspheres faktisk er anriket i CSC
relasjon:. Calvet CY, André FM, Mir LM (2014) kultur av kreft cellelinjer som Tumorspheres fungerer ikke systematisk Resultat i Cancer Stem Cell berikelse. PLoS ONE 9 (2): e89644. doi: 10,1371 /journal.pone.0089644
Redaktør: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, USA
mottatt: 02.04.2013; Godkjent: 24 januar 2014; Publisert: 24 februar 2014
Copyright: © 2014 Calvet et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forsknings var utført i omfanget av EBAM europeiske Associated Laboratory. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra Agence Nationale de la Recherche (IPSIOAT) og Département du Val-de-Marne gjennom TELVAC prosjektet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft stamceller (CSC), en undergruppe av kreftceller, har reist en stor interesse i det vitenskapelige miljøet for de siste to tiårene. De er faktisk mistenkt for å være ansvarlig for tumorvekst og metastasering, motstand mot terapi og dermed tilbakefall [1].
CSC deler mange egenskaper med normale stamceller som differensiering evne, selvfornyelse og relativ dvalen som tyder på at de kan muligens stamme fra deres normale motstykker gjennom en oppsamling av transformerende mutasjoner, enten genetisk eller epigenetisk [2] – [4]. CSC er ordnede celler som kan fornye seg selv eller differensiere i heterogene linjer som vil danne svulsten bulk. I motsetning til den klonale utviklingen modell av kreft forplantning, fremgår det CSC modellen som alle kreftceller er ikke like tumorgene når de injiseres
in vivo product: [1], [5]. For femten år siden, Bonnet og Dick viste for første gang at CD34
+ CD38
– CSC isolert fra akutt myelogen leukemi var i stand til å rekapitulere heterogenitet av den opprinnelige svulsten gjennom serie transplantasjoner i xenograft modeller, i motsetning til CD34
-CD38
+ celler [6]. Siden den gang ble det CSC modell som brukes for å forklare ikke bare forplantningen av leukemi, men også av faste kreftformer så som bryst, mage, tarm, prostata, ovarie, lever, bukspyttkjertel, lunge, hjerne og skjoldbruskkjertel karsinom, melanom, osteosarkom og Ewing sarkom [7].
CSC-skjerm motstand mot kjemoterapi og strålebehandling. Deres evne til å unnslippe cytotoksisiteten av konvensjonelle anticancer terapi og for å regenerere svulsten ved slutten av behandlingene er på grunn av flere mekanismer: uvirksom, ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner, medikament efflukspumper, høy metabolisme kapasitet og et lavt nivå av reaktivt oksygen artene [1], [8], [9].
Videre, som for normale stamceller, CSC nisje har vist seg å spille en aktiv rolle i opprettholdelsen av stemness eiendommer samt i dedifferentiation av ikke-CSC gjennom en epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) [10]. Dette fenomenet, kjent for å være involvert i metastatisk prosess, kan også forklare opprinnelsen til CSC som disse cellene dele de fleste av sine eiendommer med post-EMT celler, inkludert høy invasjon og migrasjon evne og økt uttrykk av mesenchymale markører (
f.eks
vimentin). Videre kreftcellene tvunget til å gjennomgå EMT ha en økt tumorigen potensielle og uttrykker høyere nivåer av CSC markører [8], [10] – [12]
Noen metoder er for tiden tilgjengelig for å isolere CSC.. Dyrking av celler i en forankrings-uavhengig måte, inn i et serumfritt medium anriket på vekstfaktorer, ble først brukt til å forplante human mammary epitel-celler i en udifferensiert tilstand [13]. Ponti og medarbeidere har vist at denne metoden var også effektiv i å opprettholde bryst CSC i kultur [14]. Under slike forhold celler vokste som flercellede tredimensjonale kloner kalt «tumorspheres». Denne teknikken bevist sin effektivitet i berikende og opprettholde CSC fra flere cellelinjer [15].
I denne artikkelen, søkte vi å vurdere muligheten av tumorspheres kultur teknikk for å berike flere kreftcellelinjer i CSC. Faktisk, er det av stor praktisk interesse for medisiner og for evaluering av effektiviteten av behandlinger for å arbeide med kreftcellelinjer beriket i CSC siden disse anses som den som bør være målrettet for å behandle svulster på lang sikt uten tilbakefall.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble utført i strengt samsvar med etiske retningslinjer gitt av den europeiske komité (direktiv 86/609 /CCE). Université Paris-Sud Animal etiske komité # 26, registrert av den franske Forskningsavdelingen, spesielt godkjent denne protokollen (protokollen registreringsnummer # 2012_007).
Heft Cell Culture
B16-F10 murine melanom, HT-29 human kolon adenokarsinom, MCF-7 og MDA-MB-231 menneskelig bryst adenokarsinom cellelinjer ble dyrket i DMEM, McCoys 5A, MEM eller RPMI henholdsvis 1640 medium,. Alle media ble supplert med 1% Glutamax, 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PS), alle anskaffet fra Life Technologies (Cergy Pontoise, Frankrike). Insulinoppløsning (Sigma, St. Quentin Fallavier, Frankrike) ved 10 ug /ml endelig konsentrasjon ble spesielt anvendt for MCF-7 cellekultur. Cellene ble formert ved 37 ° C i en 95% fuktig atmosfære inneholdende 5% CO
2 og passert over sammenflytning (ved en 1:10, 1:08, 1:06 eller 1:04 fortynning, henholdsvis) ved hjelp av en TrypLE oppløsning (Life-teknologi). Cellene var mycoplasma-fri og rutinemessig sjekket med Venor GEM-One Step Mycoplasma deteksjon kit kjøpt fra Biovalley (Marne-la-Vallée, Frankrike).
Tumorspheres Kultur
10 000 levedyktige celler ble overføres i en T75 ultra-lav tilslutning kolbe (Corning, Avon, Frankrike) i 10 ml CSC medium som består i DMEM /F12-medium pluss Glutamax (Life Technologies), 4 ug /mL heparin (Sigma), 2% B27 supplement (liv teknologier), 20 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF, Peprotech, Neuilly-sur-Seine, Frankrike), 20 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (FGF-b, Peprotech) og 1% PS. Fersk EGF, FGF-b og heparin ble tilsatt til mediet etter 3 dager. Tumorspheres ble tillatt å vokse i 4 dager (B16-F10) eller 7 dager (HT-29 og MCF-7). For dissosiasjon, ble tumorspheres først sentrifugert i 5 minutter ved 200 g, pelleten ble deretter forsiktig resuspendert i 500 ul av Accutase (Life technologies) før den ble inkubert i 5 minutter ved 37 ° C. Etter å legge 2 ml DMEM /F12, ble tumorspheres dissosiert ved forsiktig pipettering og direkte overført tilbake til tumorspheres dyrkningsforhold som tidligere beskrevet.
Tumorsphere dannende Effektiviserings analysen
ARIAIII Cell sorter (BD biovitenskap , USA) ble anvendt for nøyaktig å overføre en enkelt levedyktige celler (
ie
propidiumjodid-negative celle) inn i hver brønn av en ultra-lav tilslutning 96-brønners plate (Corning) inneholdende 100 ul medium CSC. Frisk EGF, ble FGF-b og heparin lagt hver 3. dag. Dette forsøk ble utført for å vurdere tumorsphere dannelsen evnen til celler som stammer fra adherente kulturer eller fra tidligere dannede primære eller sekundære tumorspheres. Etter 10 dagers dyrking, antall brønner inneholdende et tumorsphere større enn 50 pm ble bestemt ved anvendelse av et fasekontrastmikroskop.
klonogene Assay
ARIAIII cellesorterer ble brukt til nøyaktig å overføre 200 levedyktige celler (
ie
propidiumjodid-negative celler), dissosiert fra en uker gamle tumorspheres eller fra tilhenger monosjikt kultur, i hver brønn av en normal tilslutning til 6-brønns plate som inneholdt DMEM supplert med 10% FBS og 1% PS. Etter 5 dagers dyrking av B16-F10 og 10 dager for HT-29 og MCF-7, ble mediet fjernet, cellene ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og fiksert og farget ved anvendelse av en vandig oppløsning inneholdende 20% etanol, 3,7% formaldehyd og 0,2% krystallfiolett. Clonogenicity ble beregnet som antall kolonier som dannes i forhold til antall kolonier dannet av adherente celler.
Proliferation Assay
ARIAIII cellesorterer ble brukt til å overføre 1 000 B16-F10 levedyktige celler (
dvs.
propidiumjodid-negative celler), dissosiert fra en uker gamle tumorspheres eller fra adherente monosjikt, i hver brønn av en normal tilslutning 96-brønners plate inneholdende DMEM supplert med 10% FBS og 1% PS. Platen ble plassert i en IncuCyte ™ FLR avbildningssystem (Essen Biosciences, Welwyn Garden City, UK) i et vanlig cellekultur inkubator (37 ° C, 95% fuktighet, 5% CO
2). Fire forskjellige områder per brønn ble overvåket (10 × forstørrelse, fasekontrast) med IncuCyte ™ hver 4. time i løpet av en uke. Spredning ble målt med IncuCyte ™ -programvaren og dobling tid var basert på en lineær regresjonsmodell.
Farging analysen
50 000 levedyktige B16-F10 celler (trypanblått eksklusjon test) skilt fra en -week gamle tumorspheres eller fra tryptinisert heftmonolagene ble inkubert i 30 minutter ved 4 ° C i mørket med 0,5 mikrogram av rotte anti-mus monoklonalt CD133-APC, CD44-FITC eller CD24-PE antistoffer (eBiosciences, Paris, Frankrike) i 100 ul av en bufferoppløsning bestående i PBS inneholdende 3% bovint serumalbumin (Sigma). Farging ble også utført for HT-29, MCF-7 og MDA-MB-231 cellelinjer ved hjelp av mus anti-humant monoklonalt CD133-APC, CD44-PE, CD44-APC eller CD24-FITC antistoffer (Miltenyi Biotec, Paris, Frankrike) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble deretter vasket og analysert med en Accuri C6 flowcytometer (BD Biosciences, USA).
Side Befolknings analysen
En enkelt celle suspensjon på 1,10
6 B16-F10 celler /ml i et serum-fritt DMEM /F12-medium ble fremstilt ved anvendelse av dissosierte en uker gamle tumorspheres eller adherente monosjikt. Denne cellesuspensjonen ble inkubert med 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma) i 90 minutter ved 37 ° C i mørket. En negativ kontroll cellesuspensjon utsettes for Hoescht 33 342 og 50 uM verapamil (Sigma) ble inkubert parallelt. Cellene ble deretter vasket med PBS og resuspendert i et serum-fritt DMEM /F12 inneholdende 5 ug /ml propidiumjodid (Sigma) for å ekskludere døde celler. Analysen ble utført ved hjelp av en LSR II flowcytometer (BD Biosciences).
Kvantitativ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)
TRIzol® reagens (Life-teknologi) ble brukt til å trekke total RNA fra B16-F10 heftende celler eller tumorspheres i henhold til produsentens instruksjoner. 1 mikrogram av RNA ble revers-transkribert ved hjelp av M-MLV revers transkriptase (Life-teknologi). Forsterkning og påvisning av SYBR Green ble realisert ved hjelp av Step One Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems, Frankrike) i henhold til produsentens retningslinjer. 18S husholdningsgenet ble anvendt som en indre standard. Følgende primere ble brukt på 10 mikrometer hver:
E-cadherin:
frem 5′-GAGCCTGAGTCCTGCAGTCC-3 «, omvendt: 5′-TGTATTGCTGCTTGGCCTCA-3»
vimentin:
frem 5′-CACCCTGCAGTCATTCAGACA-3 «, omvendt: 5′-GATTCCACTTTCCGTTCAAGGT-3»
Snai1:
frem 5′-GGAAGCCCAACTATAGCGAGC-3 «, revers : 5»-CAGTTGAAGATCTTCCGCGAC-3 «
18S:
frem 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′, omvendt: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3 «
tumorigenitet analysen
100 ul DMEM /F12 inneholder 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 eller 100 000 levedyktige celler (trypanblått eksklusjon test) fra dissosierte B16-F10 tumorspheres ble injisert i begge flankene av seks-to -8-uker gamle C57BL /6 mus (Harlan, Gannat, Frankrike) ved to forskjellige steder. Den 1 000 celler injisert mus gruppe består 6 mus og de andre gruppene består tre mus hver. Kontrollgruppene ble injisert med samme antall celler som stammer fra B16-F10 adherente kulturer og resuspendert i 100 ul DMEM. Mus ble kontrollert to til tre ganger i uken i løpet av 50 dager. Mus ble avlivet straks tumorene nådde 2 000 mm
3 eller ble nekrotisk for å minimalisere dyr lidelse.
Statistical Analysis
Data er presentert som gjennomsnitt og standardavvik.
data ble analysert ved hjelp av ikke parametrisk Mann-Whitney-Wilcoxon test, Kruskall-Wallis test med Dunn korreksjon eller χ2 test og p. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
B16-F10, HT-29 og MCF-7-celler er i stand til å danne Tumorspheres
B16-F10, HT-29, MCF-7 og MDA-MB-231-cellelinjer ble dyrket i en forankrings-uavhengig måte , noe som betyr at på et ikke-klebende substrat i et serumfritt medium inneholdende vekstfaktorer tar sikte på å opprettholde pluripotency (
dvs.
FGF-b og EGF). Etter 4 dager i kultur for B16-F10 celler og 7 dager for HT-29 og MCF-7-celler, ble tumorspheres på omtrent 100 pm i diameter observert (figur 1) og dissosiert for subkultur. Tvert imot, har MDA-MB-231 celler som ikke klarer å danne tumorspheres, selv etter mer enn 10 dager.
(A) B16-F10, (B) HT-29 og (C) MCF-7 tumorspheres. Tumorspheres ble dannet etter 4 til 7 dagers dyrking i serumfritt medium inneholdende FGF-b og EGF på ultra-lav tilslutning substrat. Skala barer representerer 100 mikrometer.
B16-F10 tumorspheres kunne dyrkes som tumorspheres i lengre passasjer (mer enn 20 passasjer). Omtrent 20% av B16-F10 celler var i stand til å danne en tumorsphere og denne holdt seg forholdsvis konstant over i det minste tre første passasjene (figur 2). Lignende ble oppnådd for MCF-7 tumorspheres formasjon effektivitet. Når det gjelder HT-29 cellelinjen, 80% av de adherente celler var i stand til å danne primære tumorspheres mens vi har observert en reduksjon ned til ca. 50% av cellene til sekundære eller tertiære tumorspheres formasjon. Men disse forskjellene var ikke statistisk signifikant.
Tumorspheres formasjons effektivitet var svært cellelinje avhengig. T1: primær, T2: sekundær, T3. Tertiær
evnen til å danne Heft Colonies er redusert etter en uke med kultur som Tumorspheres
En ukes gamle tumorspheres avledet fra B16-F10, HT-29 eller MCF-7 celler ble dissosiert, overført tilbake til heftende forhold og deres kolonidannelse effektivitet sammenlignet med den av adherente celler. Clonogenicity av tumorspheres-dannende celler avledet fra de tre cellelinjer ble signifikant redusert, nemlig en 20-til-30% nedgang i forhold til adherente celler (figur 3, felt A). Videre er 30% til 80% av adherente kolonier avledet fra B16-F10 tumorspheres dannende celler var synlig mindre tett enn de som er et resultat av adherente celler (figur 3, panelene B og C). Dette tyder på at tumorspheres dannende celler gjennomgikk en tilpasning eller et utvalg til kulturen i suspensjon, noe som resulterer i en svakere evne til å feste til underlaget. Ingen slik endring i kolonier morfologi ble observert i tilfellet med HT-29 og MCF-7 cellelinjer.
(A) Tumorspheres-dannende celler generert omtrent 20 til 30% mindre enn kolonier adherente celler, avhengig cellelinje anses (*** for p 0,001 for B16-F10 og HT-29-celler, ** for p 0,01 for MCF-7 celler). (B) Heft B16-F10 celler alltid dannet omkrets-formet og pakket kolonier, mens (C) B16-F10 tumorspheres-dannende celler også dannet et variabelt antall dårlig tette kolonier, som strekker seg fra 30% opp til 80% av det totale antall kolonier. Skala barer representerer 200 mikrometer.
B16-F10 Tumorspheres dannende celler vokser saktere i Adherent betingelser enn sine Adherent Kolleger
B16-F10 tilhenger og tumorspheres dannende celler (både fra primære og sekundære tumorspheres) ble dyrket under heft betingelser for en uke og deres spredning ble kvantifisert ved hjelp av Incucyte ™ samløpet algoritme. Doblingstiden av B16-F10 celler fra sekundær tumorspheres var betydelig høyere enn for de adherente celle motparter (figur 4) som tyder igjen på at tumorspheres dannende celler gjennomgikk en tilpasning til kulturen i suspensjon, noe som resulterer i en svakere spredning i henhold til adherente betingelser.
Fordoblingstid av B16-F10 celler fra sekundær tumorspheres var signifikant høyere enn for adherente celler. Ns: ikke statistisk signifikant, * for p 0,05
Tumorspheres Kultur Påvirker uttrykk for CSC Markers i en cellelinje avhengig måte
Farging er også en klassisk metode for å identifisere. CSC [1], [15]. Derfor ble celler fra tumorspheres eller tilhenger monolag immunostained bruker antistoffer som gjenkjenner de vanligste CSC overflatemarkører,
dvs.
CD133, CD44 og CD24 proteiner (tabell 1). Ifølge litteraturen, er CD133, CD44 og CD24 brukes for å identifisere CSC populasjon i B16-F10-cellelinjen [16], mens bare CD133 og CD44 er identifisert som pålitelige markører for HT-29 CSC [17]. Når det gjelder brystkreft cellelinjer som MCF-7 og MDA-MB-231, en CD44
+ CD24
-. Profil ble beskrevet for CSC [18], [19]
i adherente monosjikt, nesten alle B16-F10 celler som uttrykte CD44, mens CD133 og CD24-proteiner ble funnet i mindre enn 1% av cellene. Men disse prisene forble uendret etter å dyrke cellene som tumorspheres for opp til 23 passasjer. Selv om CSC kan også bli identifisert som en side befolkning i stand til dyseutstrømningen Hoechst 33342 takket være membran ABC-transportører [15], [20], ble det ikke side befolkning detektert i enten B16-F10 adherent eller tumorspheres-dannende celler (data ikke vist).
Når det gjelder den HT-29 cellelinjen, en 15% økning av CD133
+ CD44
+ celler ble detektert i tumorspheres (49,6% av celler) sammenlignet med adherente celler (34,3% av cellene) , hinter mot en berikelse i CSC. Men denne forskjellen var ikke statistisk signifikant på grunn av høye standardavvik
MCF-7 celler inneholdt ca 50% CD44
+ CD24
-. Celler i heft befolkningen. Denne satsen ble redusert ned til 33,1% når cellene ble dyrket som tumorspheres, men denne forskjellen var ikke statistisk signifikant. I tilfelle av MDA-MB-231-celler, som ikke var effektiv i det hele tatt ved forming tumorspheres, mer enn 99% av de adherente cellepopulasjonen var CD44
+ CD24
-.
Tumorspheres Culture of B16-F10 Reduserer uttrykk for vimentin og E-cadherin
som nevnt tidligere, flere forfattere rapportert at CSC har etter EMT celler egenskaper, blant annet nedregulering av epiteliale markører (
f.eks
E-cadherin) og oppregulering av mesenchymale markører (
f.eks
vimentin og Snai1) [8], [11]. En RT-qPCR analyse ble utført for å sammenligne uttrykket av E-cadherin, vimentin og Snai1 i begge B16-F10 heftende celler og tumorspheres. Både E-cadherin og vimentin genuttrykk ble betydelig redusert når cellene ble dyrket som tumorspheres. Vi har oppdaget at 50% mindre E-cadherin mRNA (figur 5, panel A) og 80% mindre vimentin mRNA i tumorspheres enn i adherente celler (figur 5, panel B). Snai1 mRNA ble ikke påvist i begge cellekulturforhold.
Både vimentin (A) og E-cadherin (B) ble nedregulert i tumorspheres. *** For p. 0,001
B16-F10 Tumorspheres dannende celler er mindre Svulst enn heftende celler i en syngene Mouse Model
Gullstandarden metode for å evaluere tilstedeværelse av CSC består i å injisere et CSC anriket populasjon i mus og observere høyere tumor ta hastigheter sammenlignet med mus injisert med ikke-CSC-anriket celler [1], [15]. C57BL /6 mus ble injisert subkutant med enten 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 eller 100 000 B16-F10 celler som var adherente celler til en gruppe og tumorspheres-dannende celler for den andre gruppen. Svulster ble oppdaget når minst 1 000 celler hadde blitt injisert. Når dette antall celler ble injisert, tumorspheres dannende celler var betydelig mindre tumorigen enn sine motstykker adherente (figur 6, panel B). Imidlertid, ved en hvilken som helst av de høyere mengder av injiserte celler ble det ikke observert noen signifikant forskjell mellom de to gruppene (figur 6, panel A og B).
(A) Injeksjon av 300, 3 000 eller 30 000 celler . (B) Injeksjon av en 000, 10 000 eller 100 000 celler. Når 1 000 celler ble injisert i mus, tumorspheres dannende celler var betydelig mindre tumorigent enn sine tilhenger kolleger. Adh: heftende celler, Sph: tumorspheres dannende celler. Ns. Ikke signifikant, * for p 0,05
Diskusjon
kreft stamceller (CSC) er nå grundig studert siden de er ment å initiere og opprettholde tumorvekst, og dessuten er antatt å være ansvarlig for svulst tilbakefall [1].
Tumorspheres kultur har blitt rapportert å berike flere kreftcellelinjer som bryst, lever, tykktarm og eggstokkreft cellelinjer i CSC [15]. I denne artikkelen har vi testet den CSC berikelse av tumorspheres kultur av B16-F10 murine melanomceller, HT-29 menneskelige kolon adenokarcinomceller, og MCF-7 og MDA-MB-231 humane bryst adenokarcinomceller.
Som i motsetning til hva Zhong
et al.
observert [21], vår forsøket viste at B16-F10 cellene proliferated lett i suspensjon som tumorspheres i løpet av 3 måneder minst. De tumorspheres-forming forekomst av B16-F10 og MCF-7 celler holdt seg konstant i løpet av de tre første passasjer, som er en akseptert kjennetegn på CSC selvfornyelse. HT-29 celler også generert tumorspheres selv om dannelsen hastighet tendens til å avta etter første passering. Tvert imot, det tumorspheres kultur av MDA-MB-231-celler forble mislykket. Denne observasjonen var i samsvar med hva noen forfattere rapportert [22], [23], selv om andre viste denne cellelinjen var faktisk i stand til å danne tumorspheres [24], [25]. Vi antok at utryddelse av tumorspheres dannelsen evnen av de MDA-MB-231-celler kan skyldes det faktum at disse cellene var blitt passert mange ganger før våre eksperimenter. Faktisk har denne konsekvens av cellen passasje på tumorspheres dannelseshastigheten er tidligere blitt demonstrert [26]. Ytterligere karakterisering ble derfor utført slik som å konkludere på stemness egenskapene til B16-F10, HT-29 og MCF-7 tumorspheres.
CSC konseptet sier at svulsten Veksten er drevet av kreftceller med stemness egenskaper som har fått en proliferativ potensial og en clonogenicity formidlet av en selvfornyelse evne. Etter avtale med denne hypotesen, flere rapporter nevne at antatte CSC har forbedret clonogenicity [27] – [31] og sprer seg raskere [29] – [31] enn ikke-CSC. Men vår studie viste at B16-F10 tumorspheres-forming celler var mindre proliferativ enn heftende celler i heft forhold. I tillegg, B16-F10, HT-29 og MCF-7-celler viste en lavere klonogene potensial når de dyrkes som tumorspheres. Vi antok at tumorspheres-dannende celler tilpasset til kulturen i suspensjon, noe som resulterer i en svekket evne til å feste seg til (og vokse på) en vanlig tilhenger substrat. Dette utelukker liksom ut beskrivelsen av en berikelse i CSC i tumorspheres.
Vi undersøkt videre stemness egenskaper ved hjelp av klassiske biomarkører rapportert for CSC identifikasjon [1], [15]. Dou og medarbeidere viste at B16-B10 CD133
+ CD44
+ CD24
+ celler er anriket i CSC [16]. Derfor sammenlignet vi prosentandelen av CD133
+, CD44
+ og CD24
+ celler i B16-F10 tumorspheres og heft celler, men vi ikke observere noen forskjell. Følgelig, selv om Hoechst 33342 efflux-kompetente celler er også blitt vist i litteraturen for å bli anriket i antatte CSC [15], [20], ingen slik cellepopulasjon ble påvist i både tumorspheres og adherente B16-F10 celler. Dette tyder på at side populasjonen analysen er ikke relevant for påvisning av CSC i alle celletyper.
Når det gjelder den HT-29 cellelinjen, en tredjedel av befolkningen profilen til tykktarmen CSC,
ie
. var CD133
+ CD44
+ celler [17], [32], og denne prisen steg opp til 50% når cellene ble dyrket som tumorspheres. Men på grunn av høye standardavvik i denne analysen sammen med observasjoner av en redusert clonogenicity og en redusert tumorspheres formasjon effektivitet etter første passering, vi kunne ikke konkludere på et CSC berikelse.
Vi har også kvantifisert CD44
+ CD24
– bryst CSC befolkningen [33] i både MCF-7 og MDA-MB-231 celler. Den tidligere cellelinje vises en 17% reduksjon i CD44
+ CD24
– cellepopulasjon i tumorspheres, konsekvent med lavere klonogene potensialet vi observert når cellene ble dyrket som sådan. Overraskende, nesten alle MDA-MB-231 heftende celler var CD44
+ CD24
-, selv om vi ikke motta tumorsphere fra denne cellelinjen
Alle disse dataene tyder på at dannelsen av tumorspheres. ikke alltid korrelerer med en berikelse i tidligere beskrevet CSC markører og også at andelen av celler som uttrykker disse CSC markører forutser ikke tumorspheres formasjonen evne, i det minste i rammen av de kreftcellelinjer studert i denne rapporten.
mer påfallende, den karsinogent potensial av B16-F10 tumorspheres dannende celler var lavere enn den til B16-F10 adherente celler, noe som bekrefter all
in vitro
data vi oppnådd. Veldig nylig, Collura og medarbeidere publiserte lignende funn [34]. Men siden tumorspheres ble også funnet å være mer effektiv i å initiere tumorer enn heftende monolag i tilfellet av flere andre kreftcellelinjer [35] – [38], tyder dette på at effekten av tumorspheres kultur på tumordannelse avhenger sterkt av den undersøkte celle . linjen
stadig flere forfattere rapporterer at CSC stede post-EMT celler egenskaper [8], [10] – [12]. Ekspresjonen av tre EMT-relaterte gener (som koder for E-cadherin, Snai1 og vimentin) ble evaluert in B16-F10 tumorspheres ved hjelp av RT-qPCR-analyse. E-cadherin er involvert i interaksjoner mellom epitel-lignende celler og er nedregulert av Snai1. Vimentin er et mellomliggende filament uttrykt i mesenchymale celler. De to viktigste kjennetegnene til EMT er en nedregulering av E-cadherin uttrykk og en oppregulering av ekspresjonen vimentin [39] – [42]. I tumorgenisitet analyser, fører dette til en økt tumor ta. I vår studie av B16-F10 celler, ble vimentin mRNA nivå dramatisk redusert i tumorspheres, støtter det faktum at de presenterte en lavere tumorgenisitet i forhold til adherente celler. Men E-cadherin mRNA nivået var også lavere i tumorspheres og overraskende, vi gjorde ikke oppdage Snai1 mRNA som utløser nedregulering av E-cadherin under EMT [8]. Dette viser at en annen reaksjonsvei kan være involvert i tumorspheres-dannende celler for å forhindre ekspresjon av E-cadherin. Kombinasjonen av redusert ekspresjon av E-cadherin, og dermed fremme EMT, sammen med redusert ekspresjon av vimentin, fremme en mesenchymale-til-epitelial overgang (MET), kan forklare den lille forskjellen av tumorgenisitet mellom tumorspheres og adherente celler. Våre funn viser at tumorspheres kultur av B16-F10 celler faktisk påvirker uttrykket av EMT-relaterte gener, men det er ikke avklart om cellene i tumorspheres presentere egenskapene til EMT eller MET.
Først må vi konkludere med at sterkt uttrykk for CSC overflatemarkører er ikke prediktiv for tumorspheres formasjon, som vist for MDA-MB-231 celler.
for det andre, våre resultater fører oss til å konkludere med at tumorspheres kultur er ikke en effektiv metode for å berike B16-F10 murine melanoma og MCF-7 humane bryst adenokarsinom-cellelinjer i CSC. Når det gjelder HT-29 cellelinjen, og resultatene var mindre klare og ingen konklusjon kan trekkes. Vurderer vår studie og de andre rapportering en forbedring av CSC trekk i tumorspheres kulturer, konkluderer vi med at denne metoden ser ut til å berike i CSC i en cellelinje avhengig måte, uavhengig av arter eller krefttyper vurderes. Selv om våre konklusjoner trekkes bare fra kreftcellelinjer, tumorspheres generert fra primære humane (glioma) er også rapportert å være vanskelig å subkultur med økt differensiering og apoptose i forhold til tilhenger CSC kultur på laminin belagt kolber [43].
for å oppsummere, betyr dannelsen av tumorspheres ikke alltid forutsi en anrikning i CSC og kan derfor ikke betraktes som en universell metode for CSC anrikning i kreftcellelinjer. Et omfattende karakterisering for CSC signatur i tumorspheres-forming celler er fremst obligatorisk før de konkluderer på oppnåelse av CSC berikelse.
Utenfor rammen av CSC berikelse, generering av tumorspheres fortsatt en interessant og nyttig teknikk.
