Abstract
Bakgrunn
Kreftceller presentere et vedvarende de novo syntesen av fettsyrer med en økning av mettet og enumettet fettsyre (MUFA) produksjon. Denne endringen i fettsyremetabolisme er assosiert med overekspresjon av stearoyl-CoA-desaturase 1 (Scd1) som katalyserer omdanningen av mettede fettsyrer til monoumettede fettsyrer (for eksempel oljesyre). Flere rapporter har vist at inhibering av Scd1 førte til blokkering av proliferasjon og induksjon av apoptose i cancerceller. Likevel, mekanismer for celledød aktivering gjenstår å bli bedre forstått.
hovedfunnene
I denne studien har vi vist at Scd1 utryddelse av siRNA utløst avskaffelsen av de novo MUFA syntese i kreft og ikke- kreftceller. Scd1 hemming-aktivert celledød ble bare observert i kreftceller med induksjon av caspase 3-aktivitet og PARP-cleavage. Eksogene tilskudd med oljesyre ikke reversere Scd1 ablasjon-mediert celledød. I tillegg Scd1 uttømming indusert utfoldet protein respons (UPR) kjennetegnene som Xbp1 mRNA spleising, fosforylering av eIF2α og økning av CHOP uttrykk. Imidlertid anstand GRP78 uttrykk, en annen UPR kjennetegn, ble ikke påvirket av Scd1 knockdown i disse kreftceller som indikerer en særegen UPR aktivering. Til slutt viste vi at CHOP induksjon deltok til celledød aktivering av Scd1 utryddelse. Faktisk overekspresjon av dominerende negative CHOP konstruere og utryddelse av CHOP delvis restaurert levedyktighet i Scd1-utarmet kreftceller.
Konklusjon
Disse resultatene tyder på at hemming av de novo MUFA syntese av Scd1 utryddelse kan være en lovende anti-kreft målet ved å indusere celledød gjennom UPR og CHOP aktivering
Citation. Minville-Walz M, Pierre AS, Pichon L, Bellenger S, Fèvre C, Bellenger J et al. (2010) Hemming av Stearoyl-CoA desaturase en Expression Induserer CHOP-Dependent celledød i humane kreftceller. PLoS ONE 5 (12): e14363. doi: 10,1371 /journal.pone.0014363
Redaktør: Michael Polymenis, Texas A M University, USA
mottatt: 23 juli 2010; Godkjent: 26 november 2010; Publisert: 16.12.2010
Copyright: © 2010 Minville-Walz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra INSERM, Region Bourgogne og Centre National Interprofessionnel de l’Economie Laitiare. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreftceller utstillingen metabolisme endringer preget av økt glykolyse og lipogenese [1], [2]. Aktive prolifererende kreftceller til stede ikke bare kvantitative endringer i
de novo
lipid biosyntesen men også modifikasjoner av lipid membran sammensetning påvirker membran flyt, signaltransduksjon og genuttrykk [3], [4]. Endringer i lipidmembranen sammensetning er observert i en rekke kreftformer, hovedsakelig karakterisert ved mettet (SFA) og enumettet fettsyre (MUFA) akkumulering som synes mindre på grunn av økt opptak av SFA og MUFA enn til forsterket endogen fettsyrer syntese, uansett tilstrekkelig lipid-ernæringstilførsel [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Disse modifikasjoner av SFA og MUFA innhold er assosiert med modulering av ekspresjon og aktivitet av lipogenic enzymer. Således overekspresjon av acetyl Co-A karboksylase α og fettsyre syntase, er involvert i de første trinnene av fettsyre biosyntesen, ble beskrevet i forskjellige cancere [12], [13], [14], [15], [16], [17].
Økt MUFA innhold kan også være på grunn av en oppregulering av stearoyl Co-A desaturase (SCD, delta-9 desaturase) ekspresjon, det hastighetsbegrensende enzym av MUFA syntese. Faktisk, katalyserer SCD innføring av en dobbeltbinding mellom karbonatomer 9 og 10 av flere mettede fettsyrer som palmitinsyre (16:00) og stearinsyre (18:00) syrer for å tilveie palmitoleinsyre (16:01) og oljesyre (18:01 ) syrer, henholdsvis. Dette endoplasmatiske retikulum bosatt enzym som finnes under to isoformer hos mennesker, Scd1 og Scd5 [18]. Scd1 finnes i nesten alle vev med en større uttrykk i leveren, mens Scd5 ekspresjon er begrenset til pankreas og hjerne. Scd1 uttrykk, korrelert med MUFA innhold, er økt i levercelleadenom, kolon og øsofagal karsinom, samt i genetically- og kjemisk induserte tumorer [19], [20], [21]. For prostatakreft, to studier presentere motstridende resultater på Scd1 uttrykk nivå [22], [23]. Dermed kan Scd1 uttrykk være relatert til karsinogenisitetsstudier prosesser som involverer endring av spredning /apoptose balanse. Faktisk Scd1 over-uttrykke celler presentere en vekstfordel mens scd1 knock-down fører til lavere priser av celleproliferasjon og celledød
in vivo Hotell og
in vitro product: [24], [25] , [26], [27]. Mekanismen for celledød observert i Scd1-manglende lungekreftceller ser ut til å involvere en modifikasjon av SFA /MUFA-forhold som utløser inhibering av Akt bane og aktivering av AMPK veien [24], [28]. Faktisk, i fravær av Scd1, de SFA innholdet øker som lindrer Akt aktivering normalt oppnås ved MUFA (f.eks oljesyre) for å opprettholde celle spredning og overlevelse [29]. Videre, forskjellige kreftceller som mangler Scd1 aktivitet redusere
de novo-lipogenese
gjennom aktivering av AMPK veien [22], [24]. Endring av lipid produksjon i Scd1-manglende celler angår hovedsakelig en reduksjon av fosfolipid-biosyntese, som utløser cellulært stress og ekspresjon av apoptose-relatert protein C /EBP homologe protein (CHOP /GADD153) [26], [27], [30 ], [31]. CHOP tilhører en særegen spenning vei oppkalt endoplasmatiske retikulum (ER) stress som kan indusere apoptose.
ER stress utløses av ulike stress forhold som endringer i post-translasjonell protein status og lipid syntese, hypoksi, forstyrrelse av kalsium homeostase og næringsmangel, og fører til aktivering av en adaptiv program, kjent som utfolding protein respons (UPR), for å re-etablere likevekt [32]. Aktivering av den kanoniske UPR engasjerer tre forskjellige felles signal grener mediert av ER membranen forankret sensorer: RNA-avhengig protein kinase (PKR) -lignende ER kinase (PERK), aktivere transkripsjonsfaktor 6 (ATF6) og inositol krever enzym 1α (IRE1α) [ ,,,0],33]. I stressede celler dissosierer anstand protein GRP78 fra UPR sensorer Perk, ATF6 og IRE1α fører til deres aktivisering til første lindre ER stress. PERK phosphorylates eukaryote oversettelse initiering faktor (EIF) 2α, og dermed begrenser global proteinsyntese. Aktiv ATF6 translocates til Golgi og spaltes fra membranen ved sete-1 og -2 proteaser. Deretter spaltes ATF6 Lokaliserer til kjernen og induserer transkripsjon av Xbp1 og ER anstand som GRP78. IRE1α disponerer en endoribonuclease aktivitet som alternativt skjøter den Xbp1 mRNA (sXbp1), som er oversatt til en aktiv transkripsjonsfaktor. Men i en kraftig eller langvarig belastning, kan UPR utløse pro-apoptotiske signaler via aktivering av transkripsjonsfaktoren CHOP, som virker til å undertrykke den bcl-2-genekspresjon, og dermed å nedregulere anti-apoptotiske Bcl-2-protein og gjengivelse cellene følsomme for pro-apoptotiske effekter av BH3-bare proteiner [34], [35], [36].
Selv om disse opplysningene tydelig støtte involvering av Scd1 som en sentral regulator av lipogenese i kreftceller, den koblingen mellom Scd1 og induksjon av ER stress og celledød i kreftceller gjenstår å bli bedre forstått. I denne studien var vi derfor interessert i å søke for UPR induksjon i kreftceller mangler Scd1 uttrykk og i å undersøke hvilken rolle dette stress sti på kreftcellen levedyktighet under Scd1 utryddelse. Vi viste at Scd1 reduksjon i kreftceller aktivert UPR markører og indusert kreft celledød med ingen effekt på ikke kreftcellen levedyktighet. Videre dokumentert vi at CHOP deltatt i Scd1-mediert celledød.
Resultater
Effektiv hemming av Scd1 uttrykk og undertrykkelse av
de novo
MUFA syntese
i denne studien undersøkte vi effekten av Scd1 stanse ved hjelp av siRNA i forskjellige humane kreftcellelinjer (U2OS, SW480 og HCT116). Kreftceller ble transfektert med 75 nM siRNA rettet mot ikke-relaterte menneskelige mRNA (siRNA SCR) og Scd1 mRNA (siRNA Scd1.A og Scd1.B). Både siRNA rettet mot Scd1 sammenlignet med kontroll siRNA (SCR) drastisk undertrykkes uttrykk for Scd1 mRNA og protein så snart som 24 timer etter transfeksjon (figur 1A og 1B).
A) U2OS celler ble transfektert med siRNA kontroll ( SCR) eller med siRNA mot Scd1 (Scd1.A og Scd1.B) og samlet inn 24 og 48 timer etter transfeksjon for Scd1 mRNA uttrykk av real time RT-PCR. Scd1 mRNA uttrykk ble normalisert til p-aktin uttrykk. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM i forhold til Scd1 mRNA ekspresjon i SCR-behandlede U2OS celler ved 24 timer. *, P 0,05 vs. siRNA SCR-behandlede celler ved Anova analyse etterfulgt av Tuckey test. B) U2OS og SW480-celler ble behandlet med oligofectamine (-), siRNA kontroll (SCR) eller med siRNA mot Scd1 (Scd1.A og Scd1.B). Celler ble samlet 24 timer etter transfeksjon for Scd1 ekspresjon analyse ved Western-blotting. C) U2OS og SW480 celler behandlet 72 timer med siRNA ble inkubert i ytterligere 6 timer med [
14C] stearinsyre og total lipid ekstraksjon ble utført. SCD-aktivitet ble evaluert ved hjelp av HPLC som frekvensen av [
14C] stearinsyre omdannelse til [
14C] oljesyre i celler behandlet med siRNA i 72 timer. SCD-aktiviteten ble uttrykt som forholdet% av [
14C] oljesyre til [
14C] oljesyre og stearinsyrer. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM fra minst to separate eksperimenter. *, P 0,05 vs. siRNA SCR-behandlede celler ved Anova analyse etterfulgt av Tuckey test. Et representativt uttrykk for Scd1 protein ble vist i 72 timer med siRNA behandling. D) U2OS celler ble eksponert for DMSO som kjøretøy, Scd1 hemmere (CVT-11127 eller MF-438) ved 10 uM i 24 timer og fremstilt som ovenfor C) for måling av SCD-aktivitet. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM av tre eksperimenter. *, P 0,05 vs. kjøretøy-behandlede celler ved Anova analyse etterfulgt av Tuckey test
Som Scd1 katalyserer omdannelsen av stearinsyre i oljesyre, en nedgang i oljesyre produksjon ville bevis avskaffelse. av Scd1 aktivitet av siRNA rettet mot dette enzymet. For å løse SCD aktivitet etter 72 h Scd1 stanse, vi behandlet videre U2OS og SW480 celler i 6 timer med radiomerket [
14C] stearinsyre som fører til måle produksjon av [
14C] oljesyre i Scd1- manglende celler sammenlignet med kontroll scr-behandlede celler. Inkorporering av [
14C] stearinsyre var lik i siRNA scr og Scd1-behandlede celler (data ikke vist). Kreftceller transfektert med ikke-måls human mRNA siRNA (SCR) presentert en desaturation sats på 31,49% for U2OS og 25,66% for SW480. I de to cellelinjene, Scd1 utryddelse førte til en drop-off i oljesyre biosyntesen med en gjenværende desaturation rate på 5,135% og 5,28% i U2OS behandlet av siRNA Scd1.A og Scd1.B, henholdsvis, og 5,89% og 7,55% henholdsvis, i SW480 (figur 1C). Videre utsettes vi U2OS-celler i 24 timer til Scd1 inhibitorer CVT-11127 og MF-438 (10 uM). Vi har oppnådd lignende evne til Scd1 inhibitorer enn siRNA rettet mot Scd1 for å hemme produksjonen av oljesyre fra stearinsyre i U2OS celler (figur 1D).
Til sammen viser disse resultater viste en drastisk inhibering av SCD-aktivitet i siRNA Scd1 behandlede celler. Videre, i disse kreftcellelinjer, vises Scd1 som hoved enzym involvert i den endogene produksjon av oljesyre.
Scd1 utryddelse fremmer apoptose-celledød
For å vurdere effekten av Scd1 knockdown på celle-levedyktighet, vi først bestemmes celletallet ved 24 timer, 48 timer og 72 timer etter transfeksjon ved bruk av CyQuant® reagens som kvantifiserer mengden av nukleinsyrer. Så snart 48 timer etter transfeksjon, celle nummer var betydelig mindre i Scd1-utarmet U2OS celler sammenlignet med kontrollceller. Mens relative fluorescens (RF) økte for siRNA SCR-behandlede celler langs hele 72 timer etter transfeksjon, hadde RF ikke signifikant endring for siRNA Scd1-forstummet celler i den tiden kurset. Vi observerte at RF ble to ganger ganger høyere hos siRNA SCR celler sammenlignet med siRNA Scd1 fattige U2OS 72 timer etter transfeksjon indikerer spredning hemming eller celledød induksjon i Scd1-ablasjon celler (Figur 2A). Deretter viste vi ved trypanblått eksklusjon legemer 72 timer etter transfeksjon av siRNA som Scd1 knockdown førte til en reduksjon av celle levedyktighet både i U2OS og SW480 celler, men mye mer drastisk i U2OS celler (figur 2B). Mer enn 30% av Scd1 siRNA-behandlede U2OS og ca 20% av Scd1 siRNA-behandlede SW480 var positive for PI er en økning på tre og to folder sammenlignet med siRNA SCR-behandlede U2OS og SW480 celler, henholdsvis (figur 2C). Inhibering av Scd1 aktivitet av begge forbindelser (CVT-11127 og MF-438) førte også til å øke celledød etter 48 timer i en dose-respons måte (figur 2D). Men vi fant ut at disse forbindelsene på en annen måte berørt celle levedyktighet med CVT 11127 mer potent for celledød induksjon enn MF-438 i U2OS. Videre viste vi at Scd1 utarming indusert aktivering av apoptose som vist ved høyt nivå induksjon av caspase 3 aktivitet og PARP cleavage (Tall 2E og 2F).
A) U2OS celler ble behandlet med siRNA SCR (kontroll) og målretting Scd1 (Scd1.A og Scd1.B), og samlet 24 timer, 48 timer eller 72 timer etter transfeksjon. Proliferasjon status ble bestemt ved CyQuant® proliferasjonsanalyse. Hver verdi er gjennomsnittet av relative fluorescensenheter ± SEM av tre eksemplarer og er representative for tre uavhengige eksperimenter. B) U2OS og SW480 celler ble dyrket i 72 timer post-transfeksjon siRNA og høstet for trypan blått fargestoff utelukkelse assay. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre eksemplarer og er representative for to andre uavhengige eksperimenter. C) U2OS ad SW480 celler behandlet 72 timer med siRNA ble samlet og total celledød ble analysert ved flow-cytometri etter farging med propidiumjodid (PI). Data representerer gjennomsnittet ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. D) U2OS celler ble behandlet i 48 timer med Scd1 inhibitorer ved indikerte konsentrasjoner og ble høstet for propidiumjodidfarging. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av tre eksperimenter. E) U2OS celler ble oppsamlet 72 timer etter transfeksjon og forberedt for caspase 3-aktivitetsmåling ved flow-cytometri som beskrevet i materialer og metoder. Data er vist som gangers økning i forhold til kontrollen (siRNA scr) og representerer gjennomsnitt ± SEM av to uavhengige eksperimenter. F) Hel-celle-lysater ble fremstilt 72 timer etter transfeksjon med siRNA og PARP-spaltning (c-PARP) nivå ble bestemt ved hjelp av Western-blot. G) U2OS celler ble behandlet i 72 timer med siRNA kontroll (SCR) og målretting Scd1 i fravær (kjøretøy) eller tilstedeværelse av 100 mikrometer oljesyre bundet til BSA. Celleantall ble kvantifisert ved CyQuant® proliferasjonsassay som beskrevet tidligere. Data er vist som fold endring i løpet av kjøretøy siRNA SCR-behandlede celler og representerer gjennomsnittet av relative fluorescens enheter ± SEM av tre eksemplarer. *, ** P 0,05 vs. siRNA SCR-behandlede kjøretøy og oljesyreceller, henholdsvis ved Anova analyse etterfulgt av Tuckey test
Vi postulert at celledød ble utløst ved reduksjon av olje. syre celleinnhold. Således, foretok vi å supplere siRNA Scd1-uttømte celler med 100 pM oljesyre for å evaluere evnen av eksogent tilskudd for å reversere celledød. Figur 2G dokumentert at eksponering av Scd1-manglende U2OS celler til eksogen oljesyre ikke endre frekvensen av cytotoksisitet.
Hemming av Scd1 uttrykk aktiverer delvis utfoldet protein respons
forstyrrelser av ER homeostase føre til ER stress ved UPR-aktivering som kan utløse celledød. For å overvåke aktivering av UPR vei, undersøkte vi ekspresjonsnivået av GRP78, fosfo-eIF2α og ukonvensjonelle skjøting av Xbp1 mRNA. U2OS og SW480-celler har den funksjonelle maskineri for å svare på thapsigargin-indusert ER stress, som vi har observert spleising av Xbp1, oppregulering av GRP78 og fosfo-eIF2α uttrykket (figur 3A og B). Da vi analyserte disse ER stress markører i Scd1-manglende celler. Avskaffelse av Scd1 i U2OS og SW480 celler førte til en delvis prosessering av Xbp1 mRNA: spliced- og hybrid-Xbp1 (s- og h-Xbp1) mRNA arter ble økt i Scd1-mangel celler indikerer aktivering av IRE1α arm i begge cellelinjer, i en mer utpreget måte i SW480-celler (figur 3A). Oversettelse av s-Xbp1 frembringer den funksjonelle Xbp1 transkripsjonsfaktor, som deltar i en transkripsjon program for å reetablere første ER funksjon og celleoverlevelse. Den anstand GRP78 regulerer også pro-overlevelse sti under ER stress gjennom sitt oppregulering. Men vi var ikke i stand til å observere en slik regulering i U2OS og SW480 celler forstummet for Scd1 48 timer etter transfeksjon (Figur 3C). Vi har ikke observere noen forandring i mRNA og proteinnivå for GRP78-ekspresjon ved forskjellige post-transfeksjon tid (24, 48 og 72 timer, data ikke vist). PERK hører også til UPR og dens aktivering induserer fosforylering av eIF2α utløser undertrykking av generell oversettelse. Vi har observert ved 48 timer etter transfeksjon at celler utarmet på Scd1 uttrykte høyere mengden av fosfo-eIF2α sammenlignet med kontrollceller som antyder aktivering av ekstra fordel armen (figur 3D). For å tildele fosforylering av eiF2αto Scd1 utryddelse og ikke til en gjenstand på grunn av PKR aktivering av siRNA transfeksjon, analyserte vi fosfor-eIF2α nivå i U2OS behandlet med 5 og 10 mm av Scd1 inhibitor (CVT-11127 og MF-438) for 10 og 24 timer. Vi observerte økningen av p-eIF2α uttrykk så snart 10 timer for begge hemmere som viser at fosforylering av eIF2α ble indusert ved utryddelse av Scd1 aktivitet (figur 3E).
U2OS og SW480 celler ble behandlet med siRNA kontroll (scr ) og siRNA mot Scd1 i 72 timer. A) Prøver ble fremstilt for mRNA-analyser av Xbp1 behandling ved semi-kvantitativ RT-PCR. PCR-produktene ble kjørt på en 3% agarosegel og skjøtes Xbp1 (sXbp1), unspliced Xbp1 (uXbp1) og hybrid Xbp1 (hXbp1) mRNA arter ble observert i siRNA-behandlede celler (CTR) og thapsigargine-behandlede celler (Tg) som positiv kontroll av UPR aktivering. B) Totalt proteinlysatene ble fremstilt fra ubehandlet og thapsigargin-behandlede celler (Tg, 0,2 mikrometer, 16 h) og analysert for eiF2α fosforylering og GRP78 oppregulering av western-blotting. C og D) Scd1-utarmet U2OS og SW480-celler ble fremstilt som i 3B) og analysert ved western-blotting for Scd1, GRP78 og fosfo-eiF2α uttrykk. E) U2OS celler ble behandlet med 5 og 10 mm av Scd1 hemmere (MF-438 og CVT-11127) og ble samlet etter 10 timer og 24 timer etter behandling for fosfor-eiF2α uttrykk analyse av western-blotting. Blot er representative for minst to uavhengige forsøk.
CHOP deltar i Scd1 uttømming-indusert celledød
I ER stress-mediert apoptose, hogge uttrykk øker og fremstår som en viktig effektor av dette celledød programmet. Vi først adressert evaluering av CHOP uttrykk i kreftceller behandlet med siRNA SCR eller mot Scd1. Det ble observert en økning av CHOP mRNA og protein ekspresjon i celler som har mistet Scd1 ekspresjon sammenlignet med kontroll-celler (Figurene 4A og 4B). For å finne ut hvilken rolle CHOP i celledød induksjon, vi transient transfektert tom vektor (CTR) eller dominant-negativ form for CHOP (DN-CHOP) i U2OS celler. DN-CHOP konstruere havner mutasjoner i leucine glidelås domene (L134A /L141A) som hindrer dens transkripsjonen aktivitet [37]. Vi viste ved PI farging at DN-CHOP overekspresjon redusert cytotoksisitet indusert av Scd1 hemming sammenlignet med kontroll-transfekterte celler (CTR) (Figur 4C). Videre anslås vi effekten av tvangs uttrykk for DN-CHOP på aktiv caspase 3 induksjon i Scd1-forstummet U2OS. Vi viste en nedgang på caspase 3 aktivering i Scd1 knockdown-U2OS celler uttrykker DN-CHOP og dokumentert en beskyttende effekt av DN-CHOP mot apoptose indusert av Scd1 mangel (Figur 4D).
A) U2OS og SW480 celler ble behandlet med siRNA kontroll (SCR) og siRNA mot Scd1 i 72 timer. Totalt RNA ble isolert og CHOP mRNA-ekspresjon normalisert til p-aktin-mRNA-ekspresjon ble kvantifisert ved sanntids RT-PCR. Resultatene ble representert som gjennomsnittet gangers induksjon ± SEM i forhold til siRNA SCR-behandlede celler fra minst tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05 vs. siRNA SCR-behandlede celler ved Anova analyse etterfulgt av Tuckey test. B) Nuclear ekstrakter fra U2OS ble utarbeidet 72 timer etter siRNA tillegg. CHOP uttrykk ble analysert ved western-blotting og Lamin A /C ble lastet kontroll av kjernefysiske ekstrakt prøver. C) U2OS celler ble transient transfektert med tom (CTR) eller dominant-negative CHOP (DN-CHOP) ekspresjonsvektor og valgt for tre dager i G418. Resistente celler transfektert med ctr eller DN-CHOP konstrukt ble behandlet med siRNA kontroll scr eller mot Scd1 (Scd1.A og Scd1.B) i 72 timer og høstet for propidiumjodidfarging analyse ved strømningscytometri. Verdier ble vist som gangers økning over kontroller (siRNA SCR) og representerer gjennomsnitt ± SEM av to uavhengige eksperimenter. *, **, P 0,05 vs. siRNA SCR-behandlet ctr og DN-CHOP celler, henholdsvis ved Anova analyse etterfulgt av Tuckey test. #, P 0,05 av Anova analyse etterfulgt av Tuckey test. D) U2OS celler ble fremstilt som C) og høstet for aktiv caspase 3 analyse ved strømningscytometri. Verdier ble vist som gangers økning over kontroller (siRNA SCR) og representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk. *, **, P 0,05 vs. siRNA SCR-behandlet ctr og DN-CHOP celler, henholdsvis ved Anova analyse etterfulgt av Tuckey test. #, P. 0,05 av Anova analyse etterfulgt av Tuckey test
CHOP utryddelse delvis lindrer Scd1 uttømming-indusert apoptose
Beskyttelse observert av CHOP hemming mot Scd1 uttømming-mediert U2OS celle død har også blitt evaluert i HCT116 colon tumorcellelinje. I dette målet, brukte vi forbigående CHOP knockdown-HCT116 og BA1 celler som er HCT116-celler som stabilt transfektert med antimenneske CHOP cDNA konstruere [38]. Nedbryting av Scd1 med siRNA i HCT116 indusert mer enn 30% av celledød som attestert av PI farging (figur 5A). Vi viste også at 72 h at utryddelse av Scd1 aktivitet av siRNA og hemmere (data ikke vist) indusert apoptose i HCT116 dokumentert av aktiv caspase 3 eller PARP-spalting deteksjon (Tall 5B og 5C). I disse cellene, fant vi også at avskaffelse av Scd1 uttrykk førte til oppregulering av CHOP mRNA uttrykk som allerede observert for U2OS og SW480 celler (Figur 5D). Videre fikk vi bekreftet som i U2OS at reduksjon av CHOP uttrykk delvis lindres cytotoksisitet indusert av Scd1 lyddemping. Faktisk, observerte vi en reduksjon av PI flekker i BA1 celler i forhold til foreldre HCT116 (p-HCT116) kolleger når Scd1 uttrykk ble avskaffet (figur 5E). Videre beskyttelsen mot Scd1 lyddemping-mediert celledød indusert ved CHOP utryddelse så ut til å være spesifikk og ikke en beskyttelse mot alle pro-apoptotiske faktorer. Faktisk, utryddelse av CHOP ikke endre apoptoseinduksjon av etoposid i DN-CHOP U2OS eller BA1 forhold til sine respektive kontrollceller (data ikke vist). Vi har også forpliktet seg til å evaluere effekten av CHOP utryddelse av siRNA behandling på apoptose indusert av Scd1 avskaffelse. For dette formålet, vi spilte co-behandling av HCT116-celler med siRNA kontroll (SCR) eller rettet mot Scd1 (Scd1.A og Scd1.B), og med siRNA CHOP eller kontroll (-). Vi validert CHOP siRNA i HCT116-celler og viste at CHOP siRNA ikke endre Scd1 mRNA utryddelse nivå indusert av Scd1 sirnas (data ikke vist). For å estimere CHOP funksjon i Scd1-indusert apoptose, så utførte vi siRNA ko-transfeksjon. Vi observerte 72 timer etter transfeksjon som CHOP stanse beskyttet HCT116 mot apoptose-celledød indusert av Scd1 utryddelse (Tall 5F og 5G).
a) HCT116-celler behandlet 72 timer med siRNA kontroll (SCR) eller målretting Scd1 ( Scd1.A og Scd1.B) ble samlet og total celledød ble analysert ved flow-cytometri etter farging med propidiumjodid. Resultatene var gjennomsnitt ± SEM av tre eksperimenter utført i tre eksemplarer. B) HCT116-celler behandlet med siRNA ble samlet 72 timer etter transfeksjon og forberedt for caspase 3-aktivitetsmåling ved flow-cytometri som beskrevet i materialer og metoder. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. C) HCT116 ble behandlet som i A) og høstet for analyse av Scd1 og PARP-spaltning ekspresjon ved Western-blotting. D) HCT116 ble behandlet som i A) og høstet for total RNA rensing. CHOP og Scd1 mRNA uttrykk ble analysert ved real time RT-PCR etter normalisering p-aktin. Alle eksperimenter representerer minst to repetisjoner i tre eksemplarer. E) HCT116-celler ble stabilt transfektert med antimenneske CHOP cDNA konstruere og dens tom kontroll vektor. BA1 og p-HCT116 er HCT116 kloner med antisens CHOP konstruksjon og kontrollvektor, respektivt. Celler ble brakt til taushet av siRNA Scd1.A og Scd1.B i 72 timer, og høstet for total celledød analyse av flowcytometri etter farging med propidiumjodid. Resultatene var gjennomsnittet av ganger endring for PI positive celler i forhold til tilsvarende siRNA SCR HCT116 cellene ± SEM av én representant eksperiment fra tre eksperimenter utført i tre eksemplarer. *, **, P 0,05 vs. siRNA SCR-behandlet p-HCT116 og BA1 celler, henholdsvis av Anova analyse etterfulgt av Tuckey test. #, P 0,05 av Anova analyse etterfulgt av Tuckey test. F) og G) HCT116-celler ble transfektert med siRNA scr, Scd1.A eller Scd1.B på 75 nM, og enten med 25 nM siRNA SCR (-) eller siRNA CHOP. Celler ble samlet opp ved 72 timer etter transfeksjon for PI farging og aktiv caspase 3 analyser ved flow-cytometri. Resultatene var gjennomsnitt ± SEM av en representant eksperiment fra to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *, **, P 0,05 vs. tilsvar siRNA SCR-behandlede HCT116-celler ved Anova analyse etterfulgt av Tuckey test. #, P. 0,05 av Anova analyse etterfulgt av Tuckey test
Scd1 uttømming ikke påvirker levedyktigheten av ikke kreftceller
Kreftceller var følsomme for Scd1 uttømming-mediert celledød .Vi var så interessert i å analysere den potensielle effekten av et fravær av
de novo
MUFA syntese i ikke kreftceller. I dette målet, vi evaluert effekten av Scd1 hemming ved hjelp av siRNA på normale humane dermale fibroblaster (NHDF). Disse celler har en basal avmetning hastighet omtrent 15% lavere enn U2OS og SW480-celler som tidligere er vist i figur 1C. Deres behandling med siRNA Scd1.A eller Scd1.B førte til en reduksjon av SCD-aktivitet for å oppnå en gjenværende aktivitet på 8,3% og 6,3%, respektivt (figur 6B). Den gjenværende SCD aktivitet var lik den som ble oppnådd for kreftceller behandlet med siRNA Scd1. Som vist ovenfor, ablasjon av SCD aktivitet i kreftceller førte til cytotoksisitet mens uttømming av Scd1 uttrykk ikke induserer celledød i NHDF men redusert svært svakt sin celle nummer (Tall 6C og 6D). Så, i ikke-kreftceller, kan Scd1 oppheve blokkere spredning uten å påvirke cellenes levedyktighet.
Normale humane dermale fibroblaster (NHDF) ble transfektert med siRNA kontroll (SCR) og siRNA rettet mot Scd1 (Scd1.A og Scd1.B ). NHDF Cellene ble høstet etter 72 timer siRNA behandling og høstet for videre analyser. A) Totalt proteiner var forberedt på Scd1 uttrykk analyse av western-blotting. B) NHDF behandlet 72 timer med siRNA ble inkubert i ytterligere 6 timer med [
14C] stearinsyre og total lipid ekstraksjon ble gjennomført. Omdannelse av [
14C] stearinsyre inn i oljesyre ble utført ved HPLC. SCD-aktiviteten ble uttrykt som forholdet% av [
14C] oljesyre til [
14C] oljesyre og stearinsyrer. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM for minst to separate eksperimenter. C) Proliferasjon status av siRNA-behandlede NHDF ble bestemt ved angitt tidspunkt etter den CyQuant® proliferasjonsanalyse. Hver verdi er gjennomsnittet av relative fluorescensenheter ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. D) NHDF ble samlet 72 timer etter transfeksjon og total celledød analyse ble utført ved flow-cytometri etter farging med propidiumjodid. Resultatene var gjennomsnitt ± SEM av PI-positive celler (%) av en representant fra to eksperimenter utført i tre eksemplarer. *, P 0,05 vs. siRNA SCR-behandlede celler ved Anova analyse etterfulgt av Tuckey test
Diskusjoner
I denne studien, viste vi at Scd1 uttrykk lyddemping førte til induksjon. av UPR markører (Xbp1 skjøting, p-eIF2α og hogge) og CHOP-avhengig celledød i kreftceller. Vi viste også at oppheving av de novo MUFA synteseveien ved utryddelse av sin hastighetsbegrensende enzym Scd1 endret levedyktigheten av kreftceller uten å endre overlevelsen av ikke kreftceller. Disse dataene antyder ulike behov i de novo MUFA syntese for normale og tumorceller. Likevel eksogen tilførsel av oljesyre, den store MUFA produkt av Scd1 aktivitet, ikke hindre celledød av kreftceller som endogent MUFA biosyntese ble undertrykt.
I denne rapporten, er vi enige med tidligere rapporter som beskriver at Scd1 utryddelse førte til celledød ved apoptose i forskjellige typer kreftceller [22], [25], [27], [39]. Faktisk, observerte vi induksjon av kaspase 3 aktivitet og PARP-spaltning (figurene 2D-et 2E) i Scd1-uttømte celler.
Vi har også påvist i dette arbeidet som normale og kreftceller ikke reagerte på samme måte som i forebygging av MUFA syntese av Scd1 utryddelse. Faktisk, mens kreftcellene ble drept av Scd1 utarming, ikke-kreftceller fortsatt var i live. Men observerte vi en liten nedgang i celle nummer i Scd1 behandlet NHDF som en blokk eller langsomt spredning kunne forklare. Vi kan da hypothesise at levedyktigheten av ikke-cancerceller forble upåvirket på grunn av det faktum at de ikke krever en slik hurtig og høy MUFA syntese. Faktisk, sprer de med lavere hastighet (figur 6C) og fortrinnsvis vedvarende ny membran syntese fra eksogene fettsyrer up-ta mens kreftceller sprer ved høyere hastighet og trenger de novo syntesen av fettsyrer [10].
og
