Abstract
I motsetning til vestlig medisin som vanligvis bruker rensede forbindelser og tar sikte på å målrette et enkelt molekyl eller sti, tradisjonell kinesisk medisin (TCM) komposisjoner vanligvis omfatter flere urter og komponenter som er nødvendig for effekt. Til tross for svært lang tid, og utbredt bruk av TCM, er det svært få direkte sammenligninger av TCM og standard cytotoksisk kjemoterapi. I den foreliggende rapport, sammenlignet vi effekten av TCM urteblandingen LQ mot lungekreft i musemodeller med doksorubicin (DOX) og cyklofosfamid (CTX). LQ inhiberte tumorstørrelse og vekt målt direkte, så vel som av fluorescerende protein avbildning i subkutan, ortotopiske, spontane eksperimentelle metastasering og angiogenese musemodeller av lungekreft. LQ effektiv mot primære og metastatisk lungekreft uten vekttap og organtoksisitet. I motsetning til dette, CTX og DOX, selv om effektive i lungecancermodeller forårsaket betydelig vekttap, og organtoksisitet. LQ hadde også anti-angiogen aktivitet som er observert i lungesvulster som vokser i nestin drevet grønt fluorescerende protein (GFP) ND-transgene nakne mus, som selektivt uttrykker GFP i begynnende blodkar. Overlevelse av tumorbærende mus ble også forlenget med LQ, kan sammenlignes med DOX.
In vitro
, lungekreft celler ble drept av LQ som observert av time-lapse imaging, kan sammenlignes med cisplatinaindusert. LQ var mer potent til å indusere celledød på kreftcellelinjer enn normale cellelinjer i motsetning til cytostatika. Resultatene indikerer at LQ har ikke-toksisk effekt mot metastatisk lungecancer
relasjon:. Zhang L, Wu C, Zhang Y, Liu F, Wang X, Zhao M, et al. (2014) Sammenligning av effekt og toksisitet av tradisjonell kinesisk medisin (TCM) Herbal Blanding LQ og konvensjonell kjemoterapi på Lung Cancer Metastase og overlevelse i musemodeller. PLoS ONE 9 (10): e109814. doi: 10,1371 /journal.pone.0109814
Redaktør: Beicheng Sun, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Kina
mottatt: 07.02.2014; Godkjent: 13 september 2014; Publisert: 06.10.2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Cancer Institute stipend CA132971 og gi BA2011019 fra Jiangsu Science and Technology prestasjoner Transformation Tematiske spesielle midler, Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Lei Zhang, Yong Zhang, Xiaoen Wang og Ming Zhao er filialer av kreft Inc. Fang Liu var en tidligere agent av kreftbekjempende Inc. Robert M. Hoffman er en ikke-lønnet agent av kreftbekjempende Inc. anticancer Inc. markedsfører dyremodeller av kreft. Det er ingen andre konkurrerende interesser. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft død med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 80% av thorax malignitet. Den samlede 5 år overlevelse for NSCLC er fortsatt dårlig, ca 16%. Lungekreft har vist liten forbedring i overlevelse for de siste 30 årene [1]. Nye tilnærminger til behandling av lungekreft er presserende behov. Natur produkter er viktige ressurser for legemiddelutvikling. For kreftsykdom, 60% av nye legemidler, stammer fra naturlige kilder. Det er for tiden økende interesse for tradisjonell kinesisk medisin (TCM) urteblandinger som har blitt brukt til å behandle kreft i tusenvis av år i Kina. I motsetning til vestlig medisin som vanligvis bruker rensede forbindelser og tar sikte på å målrette et enkelt molekyl eller sti, TCM sammensetninger omfatter vanligvis flere urter og komponenter. Det er mye anekdotiske bevis for effekten av TCM i form av gress blandinger i kreftpasienter [2] -. [9]
I en tidligere studie, fant vi ut den hemmende effekten av TCM urt Celastrus orbiculatus Thunb . (COT) på tumorvekst, metastase og antiogenesis av hepatocelluar karsinom (HCC) Hep-G2 celler i en orthotopic naken musemodell med fluorescens bildeteknologi. Hele kroppen fluorescensavbildning ble utført for å måle tumorvekst og metastase overvåke utvikling. Høy-dose, tidlig behandling med COT viste signifikant effekt på kontroll av tumorvolumet og tumorvekten i den menneskelige HCC Hep-G2 ortotopisk tumormodell [4].
Effektiviteten av TCM urt tubeimu, ekstrahert fra tuber av anlegget
Bolbostemma paniculatum
ble testet på MDA-MB-231 humane brystkreftceller
in vitro
. MDA-MB-231 cellelinje ble konstruert for å uttrykke RFP i cytoplasma og GFP knyttet til histon H2B i kjernen, som tillater sanntids avbildning av kjernefysisk-cytoplasmatiske dynamikk. Apoptose ble lett visualisert i disse cellene ved kjerneformendringer og fragmentering. MDA-MB-231 RFP-GFP-celler ble dyrket enten i to dimensjoner på plast eller i tre dimensjoner på Gelfoam. Celler ble behandlet med en diklormetan ekstrakt av frisk tubeimu. Tubeimu indusert apoptose av MDA-MB-231-celler, som observert ved fluorescens mikroskopi, så tidlig som 24 timer etter behandling in vitro i to-dimensjonale kultur. Ved 48 timers behandling, kunne DNA-fragmentering observeres. Tubeimu også indusert apoptose av MDA-MB-231 celler i tre-dimensjonale kultur på Gelfoam, men i mindre grad enn i 2D kultur [5].
Til tross for svært lang historie og utbredt bruk av TCM, er det svært få direkte sammenligninger av TCM og standard cytotoksisk kjemoterapi. Vi har tidligere utviklet en TCM formulering av urter, LQ, som har vist seg å ha potente ikke-toksiske terapeutiske egenskaper i klinisk og i ortotopiske musemodeller for kreft i bukspyttkjertelen [6]. Vi sammenlignet LQ til gemcitabin, som er førstelinjebehandling for kreft i bukspyttkjertelen for anti-metastatisk og anti-tumor aktivitet samt sikkerhet. Den terapeutiske effekten av LQ var sammenlignbare med gemcitabin, men med mindre toksisitet [6].
I denne rapporten har vi brukt state-of-art fluorescens bildeteknologi og dyremodeller for å sammenligne effekt og toksisitet av LQ til doxorubicin (DOX) og cyklofosfamid (CTX) på lungekreft. Med bruk av GFP og /eller RFP stabilt uttrykt i humane kreftceller eller mus, ble effekten av LQ sammenlignet med standard kjemoterapi på tumorvekst og metastatisk samt angiogenese.
Vi viser her at LQ har antitumor , anti-metastatisk og anti-angiogen effekt i klinisk relevante musemodeller av lungekreft sammenlignes med doksorubicin og cyklofosfamid, uten deres toksisitet.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle dyrestudier ble gjennomført med en anticancer Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) -protocol spesielt godkjent for denne studien og i samsvar med de prinsipper og prosedyrer som er skissert i National Institute of Health guide for omsorg og bruk av dyr i henhold Assurance antall A3873-1. For å minimalisere enhver lidelse av dyrene bruk av anestesi og analgesi ble anvendt for alle kirurgiske eksperimenter. Dyrene ble bedøvet med en 20 pl blanding av ketamin (22-44 mg /kg), Acepromazin (0,75 mg /kg) og xylazin (2-5 mg /kg) ved intramuskulær injeksjon 10 minutter før kirurgi. Responsen av dyr under operasjonen ble overvåket for å sikre tilfredsstillende anestesidybden. Ibuprofen (7,5 mg /kg oralt i drikkevannet hver 24. time i 7 dager etter kirurgi) ble anvendt for å tilveiebringe analgesia post-operativt i kirurgisk-behandlede dyr. Dyrene ble observert på en daglig basis og humant avlivet av CO
2 inhalasjon når de møtte følgende humane endepunktkriterier: utmattelse, hudlesjoner, betydelig vekttap, pustevansker, neseblødning, roterende bevegelse og kroppstemperaturfall. Bruken av dyr som var nødvendig for å forstå in vivo-effektiviteten, spesielt, anti-metastatisk effekt av de testede midler. Dyrene ble huset med ikke mer enn fem per bur. Dyrene ble plassert i en barriere anlegget på en høy effektivitet partikkelfilter luft (HEPA) utfelt stativ under standard betingelser for 12-timers lys /mørke sykluser. Dyrene ble fôret en autoklav laboratorium gnagerdiett.
Cellelinjer og cellekultur
humane lungekreftcellelinjer H460 [12], A549 [13], mus Lewis lungekarsinom (LLC) [ ,,,0],14], og ape nyre normal endotelial cellelinje (VERO) [15] ble opprettholdt i RPMI-1640 (HyClone, South Logan, UT) med 10% føtalt bovint serum (Gemini Bio-Products, Calabasas, CA). Human umbilikalvene endotelceller (HUVEC) [16] ble opprettholdt i EGM-2 medium Bulletkit (Lonza, Anaheim, CA).
LLC celler som stabilt uttrykte rød fluorescerende protein (RFP), som tidligere beskrevet [10] , [11]. H460-celler som stabilt uttrykte grønt fluorescerende protein (GFP), som tidligere beskrevet [12], [17] – [19]. H460 dual-farge cellene uttrykte GFP knyttet til histon H2B i kjernen som tidligere beskrevet [20] -. [22]
Mus
atymiske nakne mus (
nu /nu
) og C57BL /6 mus (Anticancer cancer~~POS=HEADCOMP Inc., San Diego, CA), 6-8 uker gamle, ble anvendt i denne studien. Nestin-drevet-GFP (ND-GFP) transgene C57 /B6 nakne mus (Anticancer, Inc.) som uttrykker GFP under styring av nestin promoteren ble også brukt [23] – [26]. Ikke-transgene C57 B /6 mus (Anticancer, Inc.) ble også anvendt.
Subkutan tumor vekst
A549, H460, LLC, og H460-GFP-celler ble høstet ved trypzinization og vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) (HyClone, South Logan, UT). Celler (5 x 10
6) ble injisert subkutant inn i høyre flanke av mus i et totalvolum på 100 ul PBS i 30 min for høsting. De subkutane tumorer ble også brukt som kilde for vev til ortotopisk implantering inn i lungen.
Operasjon ortotopisk implantering (SOI)
tumorstykker (1 mm
3) avledet fra H460- GFP subkutane svulster vokser i naken mus ble implantert ved kirurgisk orthotopic implantering (SOI) [27] på venstre visceral pleura i kohorter av flere nakne mus [12], [28] – [30]. Musene ble bedøvet med Isofluran inhalering. En liten 1 cm tversgående snitt ble gjort på den venstre laterale bryst på nakne mus via den fjerde interkostalrom. Et lite snitt (0,4-0,5 cm) mellom tredje og fjerde ribben på brystveggen gitt tilgang til pleurahulen og resulterte i total lungekollaps. Tumorfragmenter (1 mm
3) ble sydd sammen med en 8-0 kirurgisk sutur og løst ved å lage en knute. Lunge ble tatt opp med pinsett og den tumor-fragmentet sydd inn i den nedre del av lungen med en sutur. Lungevev ble deretter returnert inn i brysthulen. Brystmusklene og huden ble lukket med en 6-0 kirurgisk sutur. Den lukkede tilstand av brystveggen ble undersøkt umiddelbart, og hvis en lekkasje fantes, ble den lukket av ytterligere suturer. Etter stengetid brystveggen, lunge var un-oppblåst ved å trekke luft fra brysthulen med en 25-gauge ½ nål. Etter tilbaketrekkingen av luft, kan en helt oppblåst lunge sees gjennom den tynne brystveggen av musen. Deretter huden og brystmuskelen ble avsluttet med en 6-0 kirurgisk sutur i ett lag. Alle prosedyrer av den ovenfor beskrevne operasjon ble utført med en 7 x mikroskop [12].
Experimental Metastaser syngenisk mus modell
LLC-RFP-celler (2 x 10
6) ble høstet ved trypsinering og vasket med kald PBS, og deretter injisert i halevenen til nakne eller C57B /6 mus i et totalvolum på 100 ul med en 1 ml 29-gauge, lateks sprøyte i løpet av 30 minutter etter høsting. Den seeding og arrestasjonen av enkeltkreftceller på lungene, ble opphopning av kreft-celle emboli, kreft-celle levedyktighet, og metastatisk kolonidannelse avbildes på 14 dager etter celleinjeksjon [31]. Enkeltbilder av utskårne lungene fra musene i forsøksmetastase modell ble oppnådd med OV100 Small Animal Imaging System (Olympus Corp., Tokyo, Japan). Det totale røde fluorescens område og lungevekten ble målt for metastatisk belastning. Bildene ble analysert ved hjelp av Imaging-Pro pluss 6.0-programvare (MediaCybernetics Inc., Rockville, MD).
Fargekodede angiogenese modell
ND-GFP transgene nakne mus, 6 til 8 uker gammel , ble brukt. Musene ble bedøvet og RFP-uttrykkende LLC-celler (5 x 10
5-celler i 25 ul) ble injisert inn i huden av øret og fotputen av den ND-GFP nakne mus med en 1 ml 27G½ lateks sprøyte [ ,,,0],32]. Den totale lengden av GFP-uttrykkende blodkar og fluorescensintensiteten ble kvantifisert. Bildene ble analysert med Imaging-Pro pluss 6.0-programvare (MediaCybernetics Inc.).
Vurdering av effekt
in vivo
Effekt av behandlingen ble bestemt ved standard målinger av svulst volum og tumorvekten i de subkutane modellene. Tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av formelen (lang diameter x kort diameter på
2) /2. I ortotopiske modellene, mus avlivet og undersøkt når de dukket opp pre-morbid. Etter dødshjelp, hver mus gikk laparotomi og median sternotomi og ble deretter avbildes for å identifisere primære og metastatiske svulster ved avbilding RFP eller GFP fluorescens. Den OV100 Small Animal Imaging System ble brukt [33]. Etter å ha utført hele kroppen, åpen avbildning, ble de faste organene grundig undersøkt for noen bevis for metastasering. Kroppsvekt, orgel struktur observasjon, og generelle utseendet til hver mus ble overvåket og registrert som bevis på systemisk toksisitet
haematoxylin og eosin (H E). Farging
hjerte, lever, milt , lunge, nyre, tarm og av mus fra hver gruppe ble samlet inn og innleiret i frosset vev matrise (OCT) og fryses straks med flytende nitrogen. Alle vev ble utarbeidet som frosne snitt og skåret i 5 mikrometer tykke lysbilder for H E farging. De histopatologiske strukturer av ulike organer ble undersøkt ved hjelp av et Olympus BH-2 mikroskop.
Utarbeidelse av råolje ekstrakter av kinesiske urter
LQ er en blanding av kinesiske medisinske urter, som består av
Sinapis alba , Atractylodes macrocephala, Coix Lacryma-Jobi
, og
Polyporus adusta Hotell og forberedt ved School of Pharmacy, Nanjing University of tradisjonell kinesisk medisin som tidligere rapportert [6]. Forholdet som brukes (2:3:4:3) er fra tørkede planter. De plantedeler som ble brukt var
Sinapis albe:
frø;
Atractylodes macrocephala:
rot;
Coix Lacryma-Jobi:
kjerne;
Polyporus adusta
: Hele sopp. Vi fulgte amerikanske Farmakopeen UPS231 for heavy metal testing. Alle urter ble testet, og nivåene av tungmetaller var under USA Pharmacopoeias minimum daglig dose. Hver urt ble ekstrahert i kokende vann i 20 minutter, ble løsningen filtrert. Resten ble ekstrahert med 75% etanol, og ekstraktet ble filtrert. Både vannekstrakt og etanoliske ekstrakt ble kombinert og konsentrert ved lyofilisering. For å oppnå 100 mg av LQ kreves 402 mg av tørkede urter. Det lyofiliserte pulver ble suspendert i PBS. Blandingen ble vortex-blandet i 1 minutt og inkubert ved 80 ° C i 30 min. Prøven ble avkjølt til værelsestemperatur og ble deretter sentrifugert ved 2000 rpm i 10 min. Supernatanten ble samlet opp ved en sluttkonsentrasjon på 90 mg /ml. LQ ble deretter fortynnet for dose strekker eksperimenter i musemodeller eller filtrert gjennom et 0,2 mikrometer membran for
in vitro
bruk.
In vivo
dosering var med sonde.
Narkotika
Doxorobucin (DOX) (Bedford Laboratories, Bedford, OH), cyclophosphonate (CTX) (Sigma, St. Louis, MO), Pingxiao (PX) (CP Pharmaceutical Co., Ltd., Xian, Kina), cisplatinaindusert (CDDP) (DONG-A Pharmaceutical Co., Seoul, Korea), og paclitaxel (Taxol) (Bedford Laboratories, Bedford, OH ) ble brukt.
Time-lapse avbildning av H460 dual-farge cellene
En FluoView FV1000 confocal laser mikroskop (Olympus Corp., Tokyo, Japan) ble brukt til bilde H460 dual-farge cellene behandlet med LQ og CDDP for time-lapse imaging. Høyoppløselige bilder ble tatt direkte for en 72-timers periode med 30 min intervaller på 37 ° C.
MTS analysen
Cellene ble eksponert for ulike konsentrasjoner av LQ og kjemoterapeutika for 72 timer. Antall levedyktige celler ble deretter bestemt ved hjelp av Cell Titer 96 vandige løsning Cell Proliferation analyse (Promega, Madison, WI) som beskrevet i instruksjonene.
Statistisk analyse
Data ble vurdert ved hjelp Student er
t
-test. Kaplan-Meier-analysen med en log-rank-test ble anvendt for å bestemme overlevelse og forskjeller mellom kontroll og behandlingsgrupper. En
p
verdien av ≤0.05 ble definert som statistisk signifikant.
Resultater og Diskusjon
Sammenligning av effekten av LQ og CTX på subkutane musemodeller av lungekreft
Vi testet effekten av ulike doser av LQ og CTX på ulike lungekreft cellelinjer
in vivo
. H460, A549, og LLC celler som vokser subkutant i 7 dager i nakne mus ble behandlet med enten LQ (150, 300, og 600 mg /kg) i 10 dager, TCM urteblandingen PX [34] (600 mg /kg, daglig gavage) i 10 dager, eller CTX (30 mg /kg /dose daglig ip) i 7 dager. I kontrollgruppen, ble mus som fikk PBS ved oral administrering. Tumorvekst målt ved størrelse ble betydelig inhibert av LQ ved doser på 150 mg /kg, 300 mg /kg og 600 mg /kg i en doseavhengig måte (figur 1A-F) (all p 0,01). Endelig svulst vekt var også betydelig redusert etter LQ behandling ved alle doser (alle p 0,01) (figur 1G). CTX og PX også hemmet tumorstørrelse og tumorvekten i betydelig grad, sammenlignet med kontrollmusene (alle p 0,01) (Fig. 1A-G). LQ (600 mg /kg) var mer effektiv enn PX (600 mg /kg) basert på tumorstørrelse og vekt (alle p 0,01). (Fig. 1D, E, F og G)
For H460 og A549 cellelinjer, hver behandlingsgruppe inneholdt 6-mus, og 10 mus ble anvendt for de ubehandlede kontrollgruppene. For LLC cellelinje, hver behandlingsgruppe inneholdt 8 mus, og 16 mus ble anvendt for den ubehandlede kontrollgruppe. Etter at de subkutane tumorer vokste, ble de nakne mus gitt enten CTX (30 mg /kg /dag i.p.) i 7 dager eller PX (600 mg /kg /dag p.o.) i 10 dager. PBS (po) ble anvendt i kontrollgruppen. Mus ble behandlet ved 150, 300 og 600 mg /kg /dag av LQ (po) i 10 dager. Tumorstørrelse ble målt to ganger i uken. Tumorvekt ble målt ved endepunktet. Statistisk signifikans mellom gruppene ble bestemt med studentens
t
-test. H460 (A og D), A549 (B
0,01). Etter LQ behandling ble tumorvekst og lungetumorvekt inhiberte signifikant, sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppen i alle modeller (
p
0,01). CTX og PX behandling resulterte i en signifikant inhibering av tumorvekt (
P
0,01) sammenlignet med kontrollgruppen i alle cellelinjer. LQ hadde mer effekt enn PX (
p
0,05) på alle cellelinjer (G). CTX indusert tap av kroppsvekt (
p
0,05)., Men ikke LQ eller PX (H)
kroppsvekt og generelle utseendet til hver mus ble observert under forsøkene og ved endepunktet. Den kroppsvekt i CTX-behandlede mus betydelig redusert etter behandling (
p
0,05) og gjenvunnet sakte etter avsluttet behandling. Imidlertid var det ingen reduksjon i kroppsvekt i LQ grupper med alle doser. (Fig. 1 H). Hjerte, lever, milt, lunge, nyre, tarm og av en mus fra hver gruppe (ubehandlet kontroll, LQ og CTX) ble farget med H E for å visualisere toksisiteten etter behandling. Den histologiske strukturen til hvert organ ble observert og sammenlignet mikroskopisk. Figur 2 viser morfologiske endringer i nyrevevet etter CTX administrasjon. Etter CTX behandling, ble de proksimale tubulære celler skadet, inkludert hevelse, degenerasjon og nekrose og sloughing av tubulære epitelceller (Fig. 2B). Men endringene i nyrevevet ble ikke observert i LQ behandlede mus (Fig. 2C). Disse resultatene indikerte at nyretoksisitet ble forårsaket av CTX, men ikke LQ.
(A) Nedsatt cortex av ubehandlet mus. (B) Et nyrebarken av mus behandlet med CTX demonstrert nyretoksisitet. Toksisitet var hovedsakelig i de proksimale tubulære celler, inkludert degenerasjon, obstruksjon, nekrose og hevelse. (C) Et nyrebarken av mus behandlet med LQ hadde ingen toksisitet.
Formålet med dette eksperimentet var å sammenligne LQ til konvensjonell kjemoterapi ved publiserte terapeutiske effektive doser (ED) [35]. En lav dose av doxorubicin ble også testet som ikke har tilsynelatende giftighet, men hadde mindre effekt sammenlignet med LQ (data ikke vist).
Sammenligning av LQ og DOX på H460-GFP human lungekreft subkutan musemodell
Fra data siste delen; Vi brukte 600 mg /kg av LQ (daglig gavage) på H460 humane lungekreft-cellelinje. Vi testet H460-GFP-celler som vokser subkutant i forhold til H460 opphavelige cellelinje hos nakne mus behandlet med LQ. Vi brukte DOX (7,5 mg /kg intravenøst to ganger i uken for tre ganger) som positiv kontroll for å sammenligne med LQ. I kontrollgruppen ble musene gitt PBS for oral administrering. Tumoravbildning (figur 3D, E F) og kalibermåling (Fig. 3A) viste at svulstveksten ble hemmet etter LQ og DOX behandling (P-verdi = 0,029, p-verdi = 0,005, respektivt), sammenliknet med kontrollmusene . Endelig tumorvekt ble også signifikant hemmet etter LQ behandling og DOX-behandling sammenlignet med PBS-kontroll (
p
= 0,037, henholdsvis
p
= 0,01). (Fig. 3B). Imidlertid DOX resulterte i et signifikant tap i kroppsvekt sammenlignet med de LQ-behandlede dyr (
p
= 0,002) og til de ubehandlede kontroller (p = 0,001) (Fig. 3C). I motsetning til dette ble ingen signifikant kroppsvekttap befinner seg i samme LQ gruppe sammenlignet med kontrollen (Fig. 3C). Dataene også antydet at H460-GFP og H460 foreldrecellelinjen viste ingen forskjell i vekst hos mus, og som reaksjon på LQ.
Fem mus ble benyttet i hver gruppe. Etter subkutane svulster vokste til 100 mm
2, ble det nakne mus som fikk enten DOX (7,5 mg /kg intravenøst) (to ganger i uken for 3 ganger). PBS (po), LQ (600 mg /kg daglig po). Tumorstørrelse og kroppsvekt ble målt hver dag. Tumorvekt ble målt ved endepunktet. Statistisk signifikans mellom gruppene ble bestemt med studentens
t
-test. Etter LQ behandling ble tumorvekst og lungetumorvekt inhiberte signifikant (
P
0,01), sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppe. DOX behandling resulterte også i en signifikant tumorvekst og inhibering vekt sammenlignet med de ubehandlede kontroller (
P
0,01). Den DOX-behandlede mus hadde betydelig kroppsvekt tap i forhold til LQ-behandlede og ubehandlede kontroller (
P
0,01). *
p
0,05; **
p
0,01. Bilder av H460-GFP svulster i levende mus fra det subkutane nude-mus modell er vist for de ulike behandlingsgruppene, og ubehandlet kontroll (D); LQ (E); og DOX (F).
Sammenligning av LQ og DOX effekt på H460-GFP human lungekreft orthotopic modell
For å bestemme anti-metastatisk effekt av LQ, en orthotopic naken -mouse modell av human lungekreft ble H460-GFP anvendt [12]. Åpne bilder av svulster i lungen fra behandlede og ubehandlede mus er vist i fig. 4C-E. Tumorstørrelse ble hemmet av LQ og DOX (alle p 0,01) (Fig. 4A). Tumorvekt ble signifikant redusert i de LQ-behandlede mus (600 mg /kg daglig gavage) sammenlignet med PBS-kontrollgruppen (
p
= 0,0041) (fig. 4A). DOX (7,5 mg /kg intravenøst to ganger i uken for tre ganger) også hemmet tumorvekt (
p
0,0001) (Fig. 4A). DOX resulterte i betydelig vekttap i forhold til ubehandlet kontroll (
p
0,001) (Fig. 4B). I motsetning til dette ble ingen signifikant kroppsvekttap finnes i de LQ-behandlede dyr sammenlignet med den ubehandlede kontroll (Fig. 4B). Det var ingen metastase funnet i kontrollgruppen.
Ti mus ble brukt i hver gruppe. H460-GFP-fragmenter fra tumorer dyrket subkutant (1 mm i diameter) ble høstet og implantert ved kirurgisk implantering ortotopisk (SOI) inn i den venstre lungene av nakne mus. De nakne mus ble gitt enten PBS (po); DOX (7,5 mg /kg i.v. to ganger i uken i 3 ganger fra dag 7) eller LQ (600 mg /kg /dag oralt daglig. Fra dag 7). Kroppsvekter ble målt hver dag. Tumorvekter ble målt på endepunktet. Statistisk signifikans mellom gruppene ble bestemt med studentens
t-t
est. Lungetumorvekst ble betydelig hemmet av LQ (
p
0,01), uten vekttap. DOX hemmet lungetumorvekst (
p
0,001), men induserte betydelig vekttap i forhold til å styre mus (
p
0,001). Åpne bilder av H460-GFP tumorer i ortotopisk naken mus-modellen er vist for de ulike behandlingsgrupper og ubehandlet kontrollgruppe (C); LQ (D); og DOX (E).
Resultatene ovenfor angitte LQ i betydelig grad kan hemme orthotopic lungetumorvekst uten toksisitet motsetning DOX som forårsaket betydelig vekttap.
Effekt av LQ på eksperimentell lunge kreft metastase i nakne mus og i immunkompetente C57BL /6 mus
Vi testet anti-metastatisk effekt av LQ i eksperimentelle musemodeller. RFP-uttrykke Lewis lungekarsinom celler (Advisor-RFP) celler ble injisert intravenøst både i naken og C57BL /6 immun-kompetente mus for å oppnå eksperimentell metastase. Enkeltbilder av utskårne lungene fra musene ble oppnådd. Lungene i den ubehandlede kontrollgruppe ble utvidet, og fargen var mørk rød på grunn av størrelsen av tumoren. De LQ-behandlede dyr hadde rosa lungene med vesentlig redusert størrelse i forhold til ubehandlede kontroller. Den røde fluorescens intensitet og området på grunn av nærværet av den LLC-RFP tumor ble redusert i LQ-behandlede mus sammenlignet med de ubehandlede kontrollmus (
p
0,01) (Fig. 5A-B). LQ på lignende måte inhiberte tumorkolonisering i lungen i begge naken og C57BL /6 mus (Fig. 5A-B). Redusert total lungevekt i LQ gruppen, sammenlignet med den ubehandlede kontroll, også indikert redusert tumorkolonisering i både LQ-behandlede naken og C57BL /6-mus (
p
= 0,001 og
p =
0,01, respektivt) (fig. 5C-D). Det totale arealet av røde florescence av lungen ble beregnet. Den fluoriserende areal korrelert med lunge vekt. Det totale RFP tumorområdet i LQ-behandlede mus var 4% og 20%, sammenlignet med deres naken eller C57BL /6-kontroll, henholdsvis (all
p
verdi 0,001) (Fig. 5E). Resultatene indikerte at LQ kan hemme tumorkolonisering i lungen og dermed indikerer antimetastatisk effekt.
Seks mus ble benyttet i hver gruppe. Enkeltbilder av utskårne lungene fra musene i forsøksmetastase modell ble oppnådd. LLC-RFP cancerceller (2 x 10
6) ble injisert i halevenen til nakne mus eller C57BL /6 mus. Fra dag 2, ble mus som fikk PBS (po) hver dag som den ubehandlede kontroll. Mus ble behandlet med LQ (600 mg /kg /dag po) i 10 dager. De LQ-behandlede mus hadde betydelig redusert lungevekt (
p
0,001) og redusert rød fluorescens område i lungene (
p
0,001) sammenlignet med ubehandlede PBS kontroller. A og B er bilder i lungene. C-D er lungevekter. E er den totale rød fluorescens område.
LQ forlenget overlevelse av tumorbærende dyr
LQ betydelig forlenget overlevelse av mus med orthotopically-implantert H460 lungekreft, samt i mus med LLC eksperimentell lungemetastaser. Median overlevelse økte fra 26 dager i de ubehandlede kontrolldyrene til 30,3 dager i mus behandlet med LQ (
p
= 0,005), til 33,4 dager i mus behandlet med DOX i orthotopic lungekreft modell (
p
= 0,0001) (fig. 6A, C). I den eksperimentelle metastase modell, ble median overlevelse økte fra 14 dager i de ubehandlede kontrolldyrene til 20 dager i LQ-behandlede mus (p = 0,001) og 22 dager i DOX-behandlede mus (
p
0.001) (fig. 6B, C). LQ forlenget overlevelse av tumorbærende dyr sammenlignes med DOX.
Ti mus ble brukt i hver gruppe. LQ signifikant økt overlevelse i både ortotopiske (
p
= 0,015) og eksperimentelle metastase (
p
= 0,001) modeller. DOX også betydelig økt (
p
0,001). Overlevelse i begge modellene
Destruksjon av tumor blodkar av LQ
I ND-GFP musemodell, bare nye blodkar indusert av tumor uttrykkelig nestin drevet GFP. Observasjon med FV-1000 avbildningssystem viste at blodkar i tumoren var meget tett og vevd sammen for å danne et blodkar nettverk (fig. 7A). Etter LQ behandling, ble GFP blodkar i Advisor-RFP svulster i øret og footpad alvorlig skadet (Fig. B). De GFP blodkar fragmentert i ulike områder av svulsten, og tumor nekrose ble observert. Samlet fluoriserende område, integrert optisk intensitet og lengde og tetthet av GFP blodkar ble kvantifisert. Resultatene viste at svulsten blodkar ble redusert til -50% av kontroll (
p
0,05) etter LQ administrasjon (Fig 7C.)
Advisor-RFP-celler ble dyrket i nestin-. drevet GFP (ND-GFP) transgene hårløse mus der begynnende blodåre uttrykt GFP. Tre mus ble benyttet i hver gruppe. I de LQ-behandlede mus, tumorblodkarene syntes å bli ødelagt. GFP florescence av blodkar ble kvantifisert for området, tetthet, integrert optisk tetthet (IOD), lengde og teller. Målingene viste at LQ redusert blodårene med 50%.
LQ indusert kreft celledød
in vitro
H460 dual-farge cellene, uttrykker GFP i kjernen og RFP i cytoplasma ble dyrket i 35 mm peri-tallerken behandlet med LQ eller CDDP. Celleproliferasjon ble fotografert hver 4. time i 72 timer. Celleproliferasjon ble fullstendig hemmet av LQ. Etter behandling, var det ingen mitose. H460-to-farge cellene behandlet med LQ redusert i størrelse. Cytoplasma krympet på et tidlig tidspunkt og forsvant, men kjernen holdt seg (fig. 8A, B, D). Ved sene stadier, kjerner fragmentert. I de CDDP-behandlede H460-to-farge cellene, ble apoptotiske celler og noen prolifererende celler observert (Fig. 8C). Omtrent 60% av cellene apoptotiske på 36-timers tidspunkt. Fragmenterte kjerner ble observert, men hadde et annerledes utseende enn i celler behandlet med LQ. LQ kan utløse en annen celledød mekanisme enn apoptose indusert av CDDP. Videre undersøkelser vil bli gjennomført i fremtiden.
A og B) ubehandlede kontrollceller ved 0 time og 36 timer. C) CDDP-behandlede celler i 36 timer.
