Abstract
En roman funksjon for binde av Arl to (BART) molekyl i kreft i bukspyttkjertelen celler er rapportert. BART hemmer invasivitet av kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom binding til en Ca
2 + -avhengig, fosforylert, guanosin triphosphatase (GTPase) membran fusjonsprotein, annexin7 (ANX7). En svulst suppressor funksjon for ANX7 ble tidligere rapportert basert på sin prognostisk rolle i menneskelige kreft og kreftutsatte mus fenotype
ANX7 plakater (+/-). Videre undersøkelser viste at BART-ANX7 kompleks transporteres mot cellefremspring i migrerende cellene når BART støtter binding av ANX7 til protein kinase C (PKC) isoform PKCα. Nyere bevis tyder på at fosforylering av ANX7 av PKC forsterker ANX7-indusert fusjon av fosfolipidvesikler vesentlig; Men den nåværende data tyder på at BART-ANX7 kompleks reduserer PKCα aktivitet. Slå ned endogen BART og ANX7 øker aktiviteten av PKCα, og spesifikke hemmere av PKCα betydelig oppheve invasivitet indusert av BART og ANX7 knockdown. Disse resultatene antyder at BART bidrar til å regulere PKCα aktivitet gjennom binding til ANX7, og dermed påvirke invasivitet av kreft i bukspyttkjertelen celler. Dermed er det mulig at BART og ANX7 kan tydelig regulere nedstrøms signal av PKCα som er potensielt relevant for celle invasjon ved å opptre som anti-invasive molekyler
Citation. Taniuchi K, Yokotani K, Saibara T (2012 ) BART Hemmer Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP Cell invasjon av PKCα Inaktive gjennom binding til ANX7. PLoS ONE 7 (4): e35674. doi: 10,1371 /journal.pone.0035674
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 29 januar 2012; Godkjent: 19 mars 2012; Publisert: 19 april 2012
Copyright: © 2012 Taniuchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
bindemiddel som Arl to (BART) molekyl er et oppløselig 19-kDa-protein som opprinnelig renset fra bovin hjerne og identifisert som en bindingspartner av ADP-ribosylering faktor-lignende 2 (ARL2) [1]. Bindingen av BART til ARL2 er av høy affinitet og avhengig av binding av GTP til ARL2 [1]. Atskilte funksjoner har blitt utledet fra resultatene at ARLs mangler de biokjemiske eller genetiske aktiviteter som er karakteristiske for ADP-ribosylering faktorer (ARF), til tross for 40% til 60% aminosyre-sekvensidentitet mellom ARF og ARLs [2]. ARL2 har vært innblandet som en regulator av mikrotubulidynamikk og sammenleggbar [3], men dens funksjon er fortsatt i stor grad ukjent. Vi har tidligere rapportert at regulering av BART post-transcriptional modifisering
via
intracellulær CD24 binding til G3BP i stress granulat bidrar til hemming av invasjon og metastasering av pankreas duktalt adenokarsinom (PDAC) celler [4]. N-terminal G3BP bidrar til post-transcriptional regulering av BART [5]. Videre studier viste at BART reduserer invasivitet av PDAC celler ved å hemme ARL2-formidlet minskning i aktiviteten av Rho GTPase-proteinet RhoA [6]. Disse dataene antyder at BART spiller en rolle i hemming av PDAC invasivitet.
ANX7 er medlem av annexin familie av kalsiumavhengige fosfolipid bindende proteiner og koder for en Ca
2 + -aktiverte GTPase.
ANX7 product: (+/-) knockout mus har Ca
2 + -avhengige endokrine sekretoriske defekter [7]. ANX7 fosforyleres av PKC, som i betydelig grad forbedrer binding av ANX7 til smeltet fosfolipidvesikler i kromaffinceller [8]. Aktivert PKCS indusere sekresjon av MMP-9, fører til aktivering av MMP-2, nedregulere TIMP-1 og TIMP-2 sekresjon, og øke MT1-MMP på celleoverflaten [9]. Dermed kan ANX7 være en av faktorene knyttet til PKC avhengige sekresjon kaskade. Videre er ANX7 en nylig beskrevet tumor suppressor genet for prostatakreft, som gjenspeiles av tap av heterozygositet og redusert ANX7 protein uttrykk i en stor andel av arkiverte metastatiske svulster [10]. ANX7 viser mange biologiske og genetiske egenskapene til en tumor suppressor gen og er også involvert i kreftutvikling gjennom diskrete signalbaner som involverer andre tumordempere, DNA-reparasjon og apoptose relaterte gener [10], [11]. Disse rapportene har antydet at ANX7 spiller flere ulike roller som er involvert i eksocytose, tumor undertrykkelse og kreftutvikling.
PKC er en familie av serin /treonin kinaser involvert i transduksjon av signaler, herunder Ras signal, for celledeling og differensiering [12], [13]. PKC-familien består av minst 12 isoformer med ulike vev uttrykk mønstre, substratspesifisitet, og subcellulære lokaliseringen som er relatert til spesialiserte cellefunksjoner, inkludert celleproliferasjon, differensiering og apoptose [14]. De «klassisk» PKCS (α, β1, β2, og y) bind forbolestere og er Ca
2 + avhengig. The «nye» PKCS (δ, ε, η, og θ) er ikke avhengig av Ca
2 +, men binder forbolestere. Den tredje underfamilie består av de «atypiske» PKCS (ξ, ι, λ, og μ), som ikke binder til enten Ca
2+ eller forbolester [14], [15]. Konstitutivt aktiverte celleoverflatereseptorer, slik som EGF-reseptoren, eller PDGF-reseptor [16], eller Ras [17], forårsake hyperactivation av PKC, så vel som den mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) kaskade. Overekspresjon av PKCδ induserer en mer ondartet kreft i bukspyttkjertelen cellefenotyp
in vivo
, gjennom modulering av celleproliferasjon og overlevelse [18]. En annen studie viste at aktivert PKC induserer lamellipodia dannelse og påfølgende økt vandrende aktivitet av subconjunctival fibroblaster [19]. Dermed har det vært antydet at PKCS indusere celleproliferasjon /overlevelse, invasjon og metastasering.
I denne studien ANX7 ble identifisert som en roman bindende partner av BART, og BART ble funnet å være assosiert med ANX7-PKC kompleks formasjon i PDAC celler. Videre dagens resultater viser at å slå ned BART induserer celle invasjon ved å øke PKCα aktivitet gjennom tap av ANX7-PKCα kompleks formasjon. Dermed sank aktiv PKCα
via
både BART og ANX7 bidrar til hemming av PDAC invasivitet.
Resultater
BART binder seg til ANX7 i PDAC celler
BART knockdown øker retroperitoneal invasjon og PDAC celle metastaser til leveren i en orthotopic xenograft modell, som beskrevet i en tidligere rapport [4]. For å undersøke mekanismen ved hvilken BART undertrykker invasivitet og metastase, immunutfelling (IP) ble utført i den humane cellelinje PDAC S2-013 ved hjelp av et spesifikt antistoff til BART, for å påvise komplekser av BART med andre proteiner. S2-013 er et klonet underlinjen av en PDAC cellelinje (SUIT-2) kommer fra en levermetastaser [20], og ble hentet fra Dr. T. Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan). Sølv-farget immunoutfelte fraksjoner separert på SDS-PAGE-geler viste et 50 kDa-bånd som ikke ble sett i de isotype kontroll-immunopresipitatene (pil i fig. 1A). Bandet ble tatt ut og analysert av Q-TOF-MS etter in-gel trypsin fordøyelsen, og identifisert som ANX7. Peptidsekvensen dekningen var 15% (fig. 1B). Denne spesifikke binding av ANX7 BART ble demonstrert ved ko-IP fra S2-013-celler (fig. 1C) og subcellulær colocalization ble analysert ved immunfarging av S2-013 celler (Fig. 1D). BART og ANX7 coimmunoprecipitated og ble colocalized i cytoplasma. Av notatet er at BART og ANX7 akkumulert i lamellipodial lignende fremspring som er avgjørende for cellemigrasjon (pilene i fig. 1E).
A. Immunopresipitater fra S2-013 celler ved anvendelse av normal kanin IgG (kontroll) og anti-BART antistoff ble undersøkt ved hjelp av sølvfarging analyse. Q-TOF-MS analyse undersøkt en fremtredende band i BART immunutfelninger (pil). B. Prosent dekning for ANX7 er representert ved de identifiserte peptider i den totale proteinsekvens (tilgangsnummer NM_004034). C. immunopresipitert endogene BART eller ANX7 fra S2-013 ble undersøkt ved Western blotting ved hjelp av anti-BART og anti-ANX7 antistoffer. Normal kanin eller mus-IgG ble anvendt som en isotype-kontroll for henholdsvis BART og ANX7,. D. immunocytokjemisk farging av S2-013 celler ved hjelp av anti-BART (grønn) og anti-ANX7 (rød) antistoffer. Blå, DAPI farging. Bar, 10 mikrometer. E. Pilene viser at BART (grønn) og ANX7 (rød) colocalize på lamellipodial lignende fremspring av S2-013 celler. Blå, DAPI farging. Bar, 10 mikrometer.
ANX7 hemmer PDAC celle invasjon
Tidligere celle kloner ble generert der BART ble stabilt trykt av vektorbasert spesifikke kort hårnål liten interfering RNA (siRNA) i S2-013 celler som tidligere uttrykte høye nivåer av BART [4]. For å bestemme funksjonen av BART-ANX7-komplekser, ble en sårhelende farging test som benyttes for å observere lokalisering av BART og ANX7 i polarisert migrerende celler (Fig. 2A). Både BART og ANX7 ble rekruttert til ledende kantene under sårtilheling av kontroll S2-013 celler (pilene i fig. 2A). Nedbryting av BART hemmet ANX7 opphopning på forkantene (nedre paneler i Fig. 2A). Kombinert med det resultat på fig. 1E Disse resultatene indikerer at BART og ANX7 interdependently lokalisere på de ledende kantene og i lamellipodial lignende fremspring i forbindelse med cellevandring.
A. Negativ egge kontroll (Scr-1) og BART RNAi (siBART-1) S2-013 celler i løpende kulturer ble såret. Etter 4 timer ble cellene immunostained hjelp av anti-BART (grønn) og anti-ANX7 (rød) antistoffer. Blå, DAPI farging. Piler, colocalized BART og ANX7 i forkant av kontrollceller. Barer, 10 mikrometer. B. siRNA oligonukleotider målretting ANX7 (siANX7) og negative egge kontroll ble transient transfektert inn S2-013 og PANC-1 celler. Western blotting validert ANX7 knockdown i begge cellelinjer. C. Transwell motilitet analyse av celler behandlet som i (B). Migrerte celler i fire felt per gruppe ble talt opp. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Kolonner
, mener;
barer
, SD. *
p
0.005 sammenlignet med kontrollceller. D. Kvantifisering av to-kammer invasjon analysen av celler behandlet som i (B). Invaderte celler i fire felt per gruppe ble talt opp. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Kolonner
, mener;
barer
, SD. *
p
. 0.001 sammenlignet med kontrollceller
In vitro
analyser ble brukt for å undersøke effekten av ANX7 på cellemotilitet og invasjon. Som vist ved Western blot-analyse, ble ANX7 ekspresjon markert redusert i S2-013 og en PDAC cellelinje PANC-1, 72 timer etter transfeksjon med de ANX7-målretting siRNA oligonukleotider, i motsetning til celler transfektert med egge siRNA-oligonukleotider (fig . 2B). Undertrykkelse av ANX7 forbedret bevegelighet i Transwell motilitet analyser av S2-013 og PANC-1 sammenlignet med kontrollceller (Fig. 2C). I to-kammerinvasjons assays, ANX7 RNAi-celler var betydelig mer omfattende enn kontrollen S2-013 og PANC-1-celler (Fig. 2D). Disse resultatene tyder på en viktig rolle for binding av BART og ANX7 i hemming av cellemigrasjon.
Binding av ANX7 og fosforylert PKC er assosiert med å hemme invasivitet av PDAC celler
Co-IP av ANX7 og PKC-komplekset ble utført ved anvendelse av anti-ANX7 eller anti-PKC-antistoff (10800) reagere med PKCα, B 1, p2, o, iU og n-isoformer i S2-013 celler. Immunoblotting av immunopresipitatene viste at ANX7 ko-immunopresipitert med PKC (fig. 3A). PKC uttrykk var ikke spesielt høy, men det var betydelige beløp i ANX7-immunopresipitert komplekser uten PKC utskillelses. Virkningene av banket ned ANX7 på regulering av PKC-aktivitet ble undersøkt ved hjelp av Western blotting ved å bruke et anti-fosfo-PKC-antistoff (9379), som registrerer de klassiske PKCS (α, β1, β2 og γ) og nye PKCS (δ, ε, η og θ) når fosforylert ved en rest homolog til Thr514 av PKCγ (fig. 3B). ANX7 knockdown indusert fosforylering av PKC i S2-013 celler, noe som indikerer at ANX7 spiller en rolle i å redusere fosforylert PKC. For å undersøke subcellulære colocalization av ANX7 og fosforylert PKC, ble S2-013 celler immunostained. ANX7 og fosforylert PKC ble colocalized i lamellipodial lignende fremspring (pilene i fig. 3C). Interessant, ANX7 og fosforylert PKC ble rekruttert og colocalized til forkantene under sårheling av S2-013 celler (piler i fig. 3D), noe som indikerer at fosforylert PKC er forbundet med anti-invasiv funksjon av ANX7. Siden ANX7 kunne fungere i nedad PKC-aktivitet (Fig. 3B), er det sannsynlig å være forbundet med redusert aktivitet av de spesifikke klassiske eller nye PKC isoformer ANX7 avhengig hemming av celle invasjon. Dermed ble ytterligere eksperimenter for analyse av BART-ANX7-forbundet hemming av celle invasjon fokusert på de klassiske og nye PKC isoformer som anti-fosfor-PKC antistoff (9379) reagerte.
A. Immunpresipitasjon av endogent ANX7 eller PKC fra S2-013 celler. Immunopresipitater ble undersøkt ved Western blotting ved anvendelse av anti-ANX7 og anti-PKC-antistoffer. Normal mus eller kanin-IgG ble brukt som isotypekontroll for ANX7 eller PKC, respektivt. B. Western blot med anti-PKC og anti-fosfo-PKC-antistoffer som viser S2-013-celler transient transfektert med siRNA for ANX7 sammenlignet med celler transfektert med egge kontroll. C. immunocytokjemisk farging i S2-013-celler, som bestemt med anti-ANX7 (grønn) og anti-fosfo-PKC (rød) antistoffer. Blå, DAPI farging. Piler, colocalized ANX7 og fosforylert PKC på lamellipodial lignende fremspring. Bar, 10 mikrometer. D. Confluent S2-013 celler ble såret. Etter 4 timer ble cellene immunfarget ved å bruke anti-ANX7 (grønn) og anti-fosfo-PKC (rød) antistoffer. Blå, DAPI farging. Piler, colocalized ANX7 og fosforylert PKC i forkant. Bar, 10 mikrometer.
Fosforylert PKC induserer celle invasjon av PDAC celler
En PKC stimulator, forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) er en potent svulst promoter [21] som induserer migrasjon av subconjunctival fibroblaster [19] og glioblastom celler [9]. PMA samhandler med og aktiverer både klassiske og nye PKC isoformer [21]. Derfor ble effekten av PMA på celle invasjon av S2-013 og PANC-1 undersøkt. Immunoblotting ved anvendelse av anti-fosfo-PKC-antistoff (9379) viste at behandling med PMA økt aktive PKCS (Fig. 4A). PMA betydelig stimulert celle invasjon av S2-013 og PANC-1 i
in vitro
invasjon analyser (Fig. 4B), noe som indikerer at PMA-sensitive PKC isoformer bidra til invasivitet av PDAC celler. For å bekrefte at PMA-induserte invasjon var avhengig aktive PKCS ble celler innledningsvis behandlet med et PKC-inhibitor (calphostin C, en inhibitor av både klassiske og nye PKCS) og deretter behandlet med PMA. Initial behandling med den PKC-inhibitor forhindret PMA-induserte økning i PKC-aktivitet (Fig. 4A) og inhiberte PMA-mediert celle invasjon av S2-013 og PANC-1 (Fig. 4B). Disse resultatene indikerer at spesifikke isoformer av klassiske og nye PKCS kan indusere PDAC celle invasjon.
A. S2-013 og PANC-1-celler forbehandlet med eller uten calphostin C ble behandlet med PMA og PKC-aktivitet ble vurdert ved Western blotting med et anti-fosfo-PKC-antistoff. B. S2-013 og PANC-1-celler behandlet som i (A) ble sådd ut på Matrigel invasjons kamre. Invaderte celler i fire felt per gruppe ble talt opp. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Kolonner
, mener;
barer
, SD. *
p
0,001; **
p
0,003 sammenlignet med ikke-behandlede kontrollceller. C. S2-013 celler ble behandlet med eller uten PMA, og immunocytokjemisk farging ble utført ved anvendelse av anti-E-cadherin og anti-p-catenin antistoffer (grønn). Blå, DAPI flekker; barer, kan 10 mikrometer.
Cell-celle adhesjon også påvirke bevegelighet [22]. Ved dannelse av celle-celle-kontakter, celler redusere deres migrasjonsrate og celleoverflatefremspring aktivitet, og redusere deres mikrotubul og aktin-filament dynamikk [23]. For å bestemme virkningen av de klassiske og nye PKCS for celle-cellekontakt, ble S2-013 celler inkubert med PMA og immunfluorescens ble utført ved anvendelse av anti-E-cadherin og anti-β-catenin antistoffer (Fig. 4C). PMA reduseres betraktelig koblings proteiner ved områder av celle-celle kontakt, noe som indikerer redusert perifer lokalisering av koblings proteiner, noe som resulterer i tilslutning kryss med redusert stabilitet. Disse resultater antyder at PMA-sensitiv PKCS spille en rolle i å redusere stabiliteten av celle-celle-kontakter og, i sin tur, å indusere celle invasjon.
BART støtter binding av ANX7 til aktiv PKC og funksjoner i nedad aktiv PKC
for å bestemme effekten av BART-ANX7 komplekser på å regulere aktiviteten av PKC, ble effekten av BART knockdown på ANX7 affinitet for konstitutivt aktiverte PKCS ved behandling med PMA undersøkt (fig. 5A). PMA stimulering forårsaket betydelige økninger i mengden av ANX7-PKC komplekser i kontrollceller, mens det var ingen forskjell i BART RNAi S2-013 celler. Videre, hvorvidt binding kunne bli inhibert av PKC-inhibitorer før stimulering av kontrollceller med PMA ble vurdert. Calphostin C og chelerythrine klorid (en inhibitor av PKCα, β, γ og δ) markert redusert ANX7-PKC interaksjon i PMA-stimulerte kontrollceller (Fig. 5A). I tillegg, BART immunopresipitert med økte mengder ANX7 når S2-013-celler ble behandlet med PMA og preinkubering med calphostin C hemmet økning i binding (fig. 5B). Immunocytokjemisk analyse ble utført for å undersøke intracellulær lokalisering av PMA-indusert ANX7-PKC komplekser i kontroll og BART RNAi S2-013 celler (Fig. 5C). ANX7 colocalized med PMA-stimulerte PKCS i kontrollcellene (piler i figur 5C.); Men BART knockdown forhindret binding av ANX7 og PMA-stimulerte PKCS (pilspisser i fig. 5C). I tillegg IP-eksperimenter med anti-fosforylert PKC antistoff (9379) bekreftet at banket ned BART hemmet binding av ANX7 og fosforylert PKC (Fig. 5D, E).
A. Immunoutfelling av PKC fra kontroll og BART RNAi S2-013-celler stimulert med PMA, med eller uten forbehandling av calphostin C eller chelerythrine klorid ble undersøkt ved Western blotting ved anvendelse av anti-ANX7 og anti-PKC-antistoffer. *, Co-immunopresipitert ANX7 med PKC i BART RNAi S2-013 celler. B. Immunoutfelling av BART fra S2-013 celler behandlet som i (A) ble undersøkt ved Western blotting ved anvendelse av anti-ANX7 og anti-BART antistoffer. C. immunocytokjemisk farging av kontroll (øvre panel) og BART RNAi (nedre paneler) S2-013 celler stimulert av PMA hjelp av anti-PKC (grønn) og anti-ANX7 (rød) antistoffer. Blå, DAPI farging. Piler, ANX7 colocalized med PMA-sensitive PKCS i kontrollceller; pilspisser, PMA-sensitive PKCS ikke colocalized med ANX7 i BART RNAi celler. Barer, 10 mikrometer. D. Immunoutfelling av fosforylert PKC fra kontroll og BART RNAi S2-013-celler ble undersøkt ved Western blotting ved anvendelse av anti-ANX7 og anti-fosfo-PKC-antistoffer. E. Densitometrisk analyse av resultatene i figur 5D. Nivået av ANX7 i utfellingene ble bedømt etter normalisering ANX7 signaler til fosfo-PKC signalene fra cellelysater. F. Western blot med anti-BART og anti-fosfor-PKC antistoffer som viser to S2-013 kloner transfektert med siRNA for BART (siBART-1 og 2) sammenlignet med mock (Neo-1) og egge (Scr-1) kontroll kloner.
BART RNAi S2-013 cellene hadde forhøyet aktive PKC nivåer og uendret stabile nivåer av PKCS (fig. 5F). Dette resultatet indikerer at BART kan være assosiert med reduserte nivåer av aktiv PKC. Vi hypotese at BART regulerer interaksjoner mellom ANX7 og aktive former av target PKCS som et stillas molekyl og /eller en last protein av ANX7, gjør det mulig å redusere ANX7 mål PKC-aktivitet, og i sin tur, hemmer celle invasjon.
PKC aktiviteten er ikke direkte regulert av ANX7
for å undersøke hvilken rolle PKC i å regulere fosforylering av ANX7, som tidligere rapportert i kromaffinceller [8], ble S2-013 og PANC-1 celler metabolsk merket med [
32P] -orthophosphoric syre, og deretter stimulert med PMA. Den radioaktivt merket-ANX7 ble immunopresipitert med anti-ANX7 monoklonalt antistoff og ble analysert ved fosfor-avbildning (fig. 6A). Hvis ANX7 er et substrat av spesifikke PKCS, bør nivået av ANX7 fosforylering føre til betydelig økt endringer i respons til PMA. Imidlertid gjorde PMA stimulering ikke øke nivåene av ANX7 fosforylering i hver cellelinje. Deretter
in vitro-fosforylering
analyser ble benyttet for å bestemme hvorvidt PKC-aktivitet ble direkte regulert av ANX7 (fig. 6B). Renset rotte hjerne, med en renhet på mer enn 95% og inneholdende klassiske og nye PKC-isoformer, ble inkubert med rekombinant ANX7 protein med eller uten rekombinant BART protein. ANX7 ikke endre aktiviteten til PKCS og legge BART protein ble ikke assosiert med regulering av PKC aktivitet. Disse resultater antyder at ANX7 er ikke et substrat for PKC, og at ANX7 ikke endrer fosforylering nivåer av målet PKCS direkte.
A. S2-013 og PANC-1 celler ble prelabeled med [
32P] -orthophosphoric syre og stimulert eller ikke med PMA. ANX7 ble immunopresipitert, separert ved SDS-PAGE og analysert ved autoradiografi. En immunblot ble utført på cellelysatet som en lasting kontroll. B.
In vitro
fosforylering analyser for å undersøke effekten av BART og ANX7 på PKC-fosforylering. Renset rotte hjerne ble inkubert med rekombinant ANX7 med eller uten rekombinant BART. Reaksjonsproduktene ble analysert ved en ELISA-analyse. ABS på
Y
-aksen betyr absorbans ved 492 nm som referanse målt med en mikroplateleser.
PKCα er assosiert med BART-ANX7 komplekser
For å identifisere spesifikke isoformer av PKC som binder til ANX7 i dette systemet, ble en nøyaktig ekspresjonsprofilen av klassisk og nye PKCS generert ved Western blotting ved å bruke individuelle anti-fosfo-PKC-antistoffer i BART RNAi celler avledet fra S2-013 (fig. 7A). Siden fosforylering nivåer av målet PKCS ble økt i BART RNAi celler (fig. 5F), oppregulert fosfo-PKCS i BART RNAi celler ble valgt for videre analyse. Blant disse ble PKCα betydelig aktivert ved BART knockdown i S2-013. I tillegg PKCα var rikelig fosforylert i ANX7 RNAi cellene S2-013 og PANC-1 (Fig. 7B). Deretter binding av ANX7 med fosforylert PKCα ble demonstrert av immunoprecipitation og Western blotting-analyse i S2-013 celler (Fig. 8A). Fosfor-PKCη ble ikke immunoutfelt med ANX7. For å undersøke subcellulære colocalization av fosforylert PKCα ble S2-013 celler immunostained. Fosforylert PKCα ble lokalisert i lamellipodial lignende fremspring (pilene i fig. 8B). I tillegg ANX7 og fosforylerte PKCα ble rekruttert til ledende kantene under sårtilheling av kontroll S2-013 celler (øverste panelene i Fig. 8C). Nedbryting av BART fremkalte ikke akkumulering av ANX7 på forkantene og påfølgende colocalization med fosforylert PKCα (nedre paneler i Fig. 8C). Disse resultatene indikerer at PKCα er interdependently forbundet med BART og ANX7 i moduler PDAC celle migrasjon.
A. Western blot med antistoffer mot de klassiske og nye PKC isoformer viser to S2-013 kloner transfektert med siRNA for BART i forhold til mock og eggekontroll kloner. B. siRNA oligonukleotider rettet mot ANX7 og negative egge kontroll ble transient transfektert inn S2-013 og PANC-1 celler. Western blot med antistoffer mot de klassiske og nye PKC isoformer ble utført.
A. Immunpresipitasjon av ANX7 (venstre panel) eller fosfor-PKCα (høyre panel) fra S2-013 celler ble undersøkt ved Western blotting ved hjelp av antistoffer mot ANX7, fosfor-PKCα og fosfor-PKCη. B. immunocytokjemisk farging i S2-013-celler, som bestemt med anti-fosfo-PKC-antistoff (grønn). Blå, DAPI farging. Piler, fosforylert PKC på lamellipodial lignende fremspring. Bar, 10 mikrometer. C. Sammenflytende kulturer av kontroll og BART RNAi S2-013 celler ble såret. Etter 4 timer ble cellene immunostained hjelp av anti-ANX7 (grønn) og anti-fosfo-PKCα (rød) antistoffer. Blå, DAPI farging. Barer, 10 mikrometer.
Spesifikke hemmere av PKCα hemmer økt celle migrasjon av knockdown av BART og ANX7
For å undersøke om PKCα signalering er involvert i økt migrasjon av BART eller ANX7 knockdown i S2-013, en PKCα /β1 inhibitor Ro-32-0432 og en bestemt PKCα hemmer safingol ble brukt i
in vitro
invasjon analyser. Som vist på fig. 9A og 9B ble fosforylert PKCα spesielt redusert med Ro-32-0432 og safingol behandling, men uttrykk for fosfor-PKCη ble ikke endret. Den største migrering av S2-013 celler skjedde etter banket ned BART eller ANX7; imidlertid økt migrasjon ble inhibert ved preinkubering med Ro-32-0432 (fig. 9C) og safingol (Fig. 9D). Økt invasivitet av BART eller ANX7 knockdown ble ikke hindret av preinkubering med en Myristoylated pseudosubstrate PKCη inhibitor (Fig 9E.) Og en PKCδ inhibitor (rottlerin, data ikke vist). Disse resultater antyder at aktivering av PKCα er nødvendig for PDAC cellemigrering indusert av BART eller ANX7 knockdown.
A. BART RNAi S2-013 celler og S2-013 celler transient transfektert med ANX7-siRNA ble forbehandlet med eller uten Ro-32-0432. Aktiviteten av PKCα og η ble vurdert ved Western blotting. B. Celler som er vist i (A) ble forbehandlet med eller uten safingol. Aktiviteten av PKCα og PKCη ble vurdert ved Western blotting. C. Effekten av Ro-32-0432 på celle invasjon ble undersøkt ved hjelp av transwell invasjon analysen. Migrerte celler i fire felt per gruppe ble talt opp. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Kolonner
, mener;
barer
, SD. *
p
0,001 sammenlignet med ikke-behandlede celler. D. Effekten av safingol på celle invasjon ble undersøkt ved hjelp av transwell invasjon analysen. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Kolonner
, mener;
barer
, SD. *
p
0,001; **
p
0.003 sammenlignet med ikke-behandlede celler. E. Effekt av rottlerin og pseudosubstrate PKCη inhibitor på celle invasjon ble undersøkt ved hjelp av transwell invasjon analysen. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Kolonner
, mener;
barer
, SD.
Diskusjoner
PDAC er en av de dødeligste kreft på grunn av sin evne til omfattende invadere omkringliggende vev og metastaserer tidlig [24 ]. Omfattende lokal infiltrasjon og metastasering er de viktigste årsakene til dødsfall i PDAC [25]. I lys av den rollen BART i begrenser PDAC celle invasjon, ble denne studien designet for å identifisere BART bindende proteiner assosiert med PDAC celle invasivitet. De viktigste funksjonene i denne rapporten er som følger:.
BART og ANX7 kan fungere sammen i komplekse å hemme cellemigrasjon
BART og ANX7 kan hemme celle invasjon ved å redusere aktiv PKC ved ledende kanter.
Fosforylert PKCα er ansvarlig for den økte invasivitet av PDAC celler sett med BART eller ANX7 knockdown. PKCα er interdependently forbundet med BART og ANX7 i moduler invasivitet av PDAC celler.
Det ble ikke observert hyppig tap av ANX7 uttrykk i prostatakreft, særlig i metastaser og lokalt tilbakefall av hormon refraktær sykdom [7]. Mens null
ANX7
– /- mus dør i løpet embryogenesen ANX7 heterozygote mus (
ANX7
+/-) utvikle, moden, og alder normalt, og mer interessant, har en kreft-utsatt fenotype [10]. Et bredt spekter av spontane svulster har blitt oppdaget i
ANX7
+/- mus, blant annet i lever, prostata, endometrium, spyttkjertel, og thymus [11]. I mus, haploinsufficiency av ANX7 ekspresjon synes å drive progresjon av kreft på grunn av genom ustabilitet gjennom en diskret signalveien involvere andre tumorsuppressorgener, DNA-reparasjonsgener, og apoptose-relaterte gener. Våre data antyder at BART og ANX7 spille en rolle i å redusere graden av fosforylering PKCα i PDAC celler.
In vitro
forsøk ikke klarte å vise at ANX7 redusert direkte aktivitet av PKC (fig 6B.); imidlertid, fig. 6A viser definitivt at ANX7 var ikke et substrat for PKC i PDAC celler. Selv om mekanismen som regulerer ANX7 PKC-aktivitet er ukjent, er det bemerkelsesverdig at BART og ANX7 kunne fungere sammen for å redusere aktiviteten til PKCα isoformen og, i sin tur, undertrykke invasivitet av PDAC celler. Denne studien aktivert evaluering av et mobilsignalveien regulert av
ANX7
tumorsuppressorgen i PDAC. Videre studier er nødvendig for å fastslå hvilke molekyler direkte undertrykke PKCα, og å identifisere presise substrater av PKCα, for å forstå mekanismene som er involvert i BART-ANX7 hemming av celle invasjon.
Rollen PKCα i PDAC celle migrasjon har ikke blitt grundig undersøkt. Flere linjer av bevis indikerer at PKCα spiller viktige roller i celleproliferasjon /migrasjon /invasjon, inkludert menneskelige dårlig differensiert leverkreft [26], livmorkreft [27] og magekreft [28]. Celle signalveier som involverer den PKC-familie blir initiert ved binding av en ligand, slik som en vekstfaktor, til sin respektive celleoverflatereseptor, som utløser nedbryting av fosfolipider av fosfolipaser C og D og produksjon av diacylglycerol (DAG). DAG binder seg til og aktiverer de fleste PKC-isoformer, som deretter translocate til spesifikke subcellulære avdelinger som varierer avhengig av den PKC-isoformen og celletype. Til syvende og sist, MAPK, inkludert det ekstracellulære signalregulerte protein kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), og p38MAPK, spiller en avgjørende rolle i cellemigrasjon mediert av PMA-aktiverte PKCS [19], [29 ]. Som BART og ANX7 oppheve fosforylering av ERK i PDAC celler er blitt påvist (data ikke vist), noe som tyder på at PKCα kan være forbundet med modulering av ERK-aktivitet, muligens i forbindelse med BART-ANX7 relatert hemming av invasivitet. Videre er det mulig at PKCα-indusert exocytose modulerer cellemigrering. Dermed er fremtidige studier av PKCα garantert videre karakterisere sin exocitic funksjon og belyse dens potensielle bidrag til celle migrasjon.
I sammendraget, funnene som presenteres i denne studien er støttende av de sentrale rollene BART i samordnet regulering
