En asymmetrisk celledeling produserer to datterceller med ulike cellulære skjebner. Denne prosessen er meget viktig for dannelsen og utviklingen av kreft og har betydelig terapeutisk potensial. Her identifiserer vi lever lenge proteiner i dele celler under aldring ved bruk av spirende gjær, Saccharomyces cerevisiae. Gjær mor celler gjennomgå et begrenset antall av asymmetriske divisjoner som definerer replicative levetid.
For det første? Vi bygge et system for å identifisere de langlivede proteiner. Vi brukte stabil-isotop puls-chase og total proteom- massespektrometri for å identifisere proteiner som var både lang levetid og beholdt i aldrende mor celler etter? 18 celler divisjoner. Vi identifiserte? 135 proteiner som vi betegner som langlivede asymmetrisk beholdt proteiner (laiv).
Deretter tar vi et annet system for å teste og verifisere langlivede proteiner. Tagging et protein av interesse med RITE systemet skaper et fusjonsprotein, som i utgangspunktet uttrykker protein-GFP, deretter gjennom en østradiol-induserbar rekombinasjon hendelse, uttrykker protein-RFP. Det opprinnelige protein er merket grønt, og etterfølgende proteiner merket med rødt.
Endelig kan akkumulering av noen laiv med suksessive celledelinger resulterer i en effektiv økning i doseringen av protein i eldre celler. Plasmamembraner laiv kan både endres og økning i nivåer med påfølgende celledeling
Lange varig proteiner bidra til aldersrelatert fenotyper og trolig eksisterer i andre organismer.
PARKIN E3 UB ligase er mutert ved Parkinsons sykdom (PD) og kontrollerer mitokondrie autofagi. Parkin funksjonene via en såkalt RING-hect hybrid mekanisme, karakterisert ved at en katalytisk Cys-rest i domenet RING2 mottar UB fra en E2 og overfører den til substratet. Her bruker vi kvantitative proteomikk og live-cell imaging å dissekere enkelte trinnene i Nature1 kinase-PARKIN UB ligase mitokondrie kontroll pathway unormal ved Parkinsons sykdom.
PARKIN aktivering av Nature1 produserer UB kjettinger på mitokondriene, og PARKIN avhengig kjedeenhet er nødvendig for oppsamling av poly-fosfo-UB på mitokondrier. En ti-Plex tandem masse tagging kvantitativ proteomikk eksperiment viste en økning på 3 ganger i p-S65 UB ved 30 min etter depolarisering i Nature1 + /+ mus embryonale? Broblasts (MEFs).
Nature1 fremmer PARKIN tilknytning poly-UB kjedene ved å fosforylere både PARKIN og poly-UB.
UB kan gjennomgå kjedeforlengelse på syv lysines og N-terminal metionin, med forskjellige skjebner for ulike koblingstyper. PARKIN fremmer syntesen av kanoniske og ikke-kanoniske poly-UB kjettinger på depolariserte mitokondrier på en måte som er avhengig av katalytiske Cys rester og S65 innenfor sitt UBL domene.
For å oppsummere, tar vi kraften av proteomikk til analyse enkelte trinnene i komplekse fosforylering drevet UB kaskader. Det vil være nyttig for å forstå signale-ubiquitylation baner i fremtiden.
