Abstract
Sarsaparilla, også kjent som
Smilax Glabra
Rhizome (SGR), viste seg å modulere immunforsvar, beskytter mot leverskade, lavere blodsukker og undertrykke kreft. Men dens effekt på kreft celle adhesjon, migrasjon og invasjon var uklare. I denne studien fant vi at supernatanten vannløselig ekstrakt fra SGR (SW) kunne fremme adhesjon, hemmer migrasjon og invasjon av HepG2, MDA-MB-231 og T24 celler
in vitro
, samt som undertrykke metastasering av MDA-MB-231 celler
in vivo
. Resultater av F-aktin og vinculin dual farging viste økt fokus heft i SW-behandlede celler. Mikromatriseanalyse indikerte en undertrykkelse av TGF-β1 signalering ved SW behandling, som ble verifisert ved sanntids RT-PCR av TGF-β1-relaterte gener og immunblotting av TGFBR1 protein. SW ble også vist å antagonisere TGF-β1-aktiverte celle migrasjon. Samlet vår studie avdekket en ny antitumor funksjon av Sarsaparilla motvirke invasivitet av en undergruppe av kreftceller ved å hemme TGF-β1 signale
Citation. Hun T, Zhao C, Feng J, Wang L, Qu L, Fang K, et al. (2015) Sarsaparilla (
Smilax Glabra
Rhizome) Pakk hemmer migrasjon og invasjon av kreftceller ved å undertrykke TGF-β1 Pathway. PLoS ONE 10 (3): e0118287. doi: 10,1371 /journal.pone.0118287
Academic Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea, Republikken
mottatt: 28 juni 2014; Godkjent: 12 januar 2015; Publisert: 05.03.2015
Copyright: © 2015 Hun et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Microarray data har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (tiltredelse no. GSE58201), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58201.
Finansiering : det ble gitt av National Basic Research Program of China (2010CB529303, 2013CB910504), https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sarsaparilla, også kjent som
Smilax Glabra
Rhizome (SGR), er et naturlig kosttilskudd mye brukt i mat-making og helsevesen, basert på sin evne i detoxicating, rydding varme og lindrende fuktighet [1,2]. Noen SGR holdige drikkevarer, matvarer og kosttilskudd er kjøpes i Sørøst-Asia og Nord-Amerika. Pasienter med dermatitt, syfilis eller urinsyregikt i Sørøst-Asia har hatt nytte av behandling av SGR inneholder urteblandinger for en lang historie [3,4]. For tiden er det også økende vitenskapelige bevis som rapporterer sin terapeutiske potensial for behandling av revmatoid artritt [5], betennelse [6], leverskade [1], hyperinsulinemi [7] og kreft [8].
Funksjonene av SGR er hovedsakelig delt inn i fire aspekter, nemlig immunmodulerende, leverbeskyttende, tumorici-dal og andre. På den immunmodulerende aspekt, den vandige ekstrakt fra SGR utøver en markert hemming av pikrylklorid (PCL) – eller sau røde blodceller (SRBC)-indusert forsinket-type hypersensitivitet (DTH) [6,9]. SGR virker hovedsakelig på cellulær immunrespons (CIR), effektor fase av DTH snarere enn humoral immunrespons (HIR), for således overdragelse SGR en overlegen fordel til andre immunosuppressorer i behandling av CIR-medierte inflammatoriske sykdommer som hepatitt og reumatoid artritt [6,9 ]. Astilbin, en av bioaktive forbindelser isolert fra SGR, kan endre
in vivo
cytokin profiler av lymfocytter og undertrykke migrering av aktiverte T-celler, og dermed lindrende kontakt overfølsomhet og DTH [10,11]. På hepato-beskyttende del, letter Astilbin apoptose av lever-infiltrerende T-lymfocytter og hemmer celle-matrise-adhesjon av splenocytter for å minimere skader på leveren [12,13]. Videre kan det forbedre leverfunksjon ved å reversere transaminaseøkning, senking TNF-α produksjon og reduksjon av hepatotoksisitet av parenchymale celler [12,14]. Taxifolin, en annen forbindelse isolert fra SGR, ble funnet å endre lipidmetabolismen å avlaste leverbelastning [15,16]. Funksjonen til SGR strekker seg også til andre biologiske funksjoner, inkludert undertrykke helicobacter pylori-aktivitet [17], senke blodglukose [2] og reduserende aktivitet av HIV-1 integrase [18]. Alle disse funnene peker til den multifunksjonelle potensialet i SGR.
På kreft aspektet, ble oralt inntak av en urte formel som inneholder SGR funnet å utvide smertelindrende vedvarende tid, forbedre pasientenes livskvalitet og forlenge lang- begrepet overlevelse av pasienter med leverkreft [19]. En annen SGR holdige injeksjon ble oppdaget å redusere tumorvekst på relativt høye doser i mus modeller [20]. Utdrag fra SGR ble funnet å fremme apoptose i human kolorektal kreft HT-29, human leverkreft HepG2 og HepG3 celler [8,21]. Det er også flere hint som angir mulige roller SGR kontrollere celle adhesjon og migrasjon. Astilbin kan undertrykke adhesjonen av splenocytter til ekstracellulær matriks i lever-skade muse modeller [14], og blokkere intercellulær adhesjon mellom humane Jurkat T-celler og ECV-304-celler [13]. I tillegg 5-O-caffeoylshikimic syre, taxifolin og astilbin fra SGR hemmet migrasjon og vedheft av makrofager [22]. Likevel, den direkte rollen SGR pakke på kreftcelle invasivitet er uklar og det mekanistiske grunnlaget mangler. I den foreliggende undersøkelse, evaluerte vi virkningen av supernatanten av vannoppløselige ekstrakt av SGR (SW) på adhesjon, migrasjon og invasjon av tre kreftcellelinjer, og utforsket mulig mekanisme.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Animal studien ble godkjent av Biomedical Etisk komité Peking University Cancer Hospital Institute og utført sammen etablerte institusjonelle dyrevelferd retningslinjer samstemmige med de amerikanske retningslinjene (NIH Publication # 85-23, revidert i 1985).
Material
Matrigel ble kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, CA). Antistoffer mot vinculin og TGFBRI ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og BioWorld (Beijing, Kina) hhv. TGF-β1 var fra Sigma-Aldrich.
Utarbeidelse av SGR pakke
SGR ble hentet fra Ben Cao Fang Yuan Pharmaceutical Co (Beijing, Kina). Prosedyrene for fremstilling av supernatanten av vannløselig ekstrakt fra SGR (SW) ble tidligere beskrevet [23]. Utbyttet prosent for SV var 7,27% (g /g). Løsningsmidlet for fremstilling av SW (forrådsoppløsning) var 3% DMSO i PBS, og DMSO i arbeids oppløsning av SW var lavere enn 0,15% (v /v).
Cellekultur
HepG2, MDA-MB-231 og T24-celler ble erholdt fra ATCC (Rockville, MD) og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) pluss 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Alle reagenser for kultur ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA).
Celleadhesjon assay
Cellene ble utsådd i 6-cm skåler og dyrket med RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS ). Matrigel var 1: 100 fortynnet med serumfritt RPMI 1640 medium, og tilsatt til 96-brønners plate for å tillate å belegge over natten ved 4 ° C. Neste dag ble cellene trypsinisert og oppsamlet i serumfritt medium supplert med angitte doser av SW. Etter medikament pre-behandling i 15 minutter (for T24-celler) eller 30 min (for MDA-MB-231 og HepG2-celler), ble cellesuspensjonen deretter supplert med 0,5% FBS før de ble sådd ut Matrigel pre-belagte 96-brønners plater ved tettheten av 2 x 10
4 per brønn og tillatt å holde seg i 2 timer. Etter fjerning av ikke-adherente celler med PBS, ble adherente celler fotografert med CloneSelect Imager systemet (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Ni mikroskopiske felt av hver brønn ble tilfeldig fanget og cellene ble telt ved hjelp av Image Pro Plus-programvare.
Transwell migrasjon /invasjonen assay
For migrasjon analysen ble cellene sådd i 10 cm retter. Neste dag ble cellene høstet i serumfritt medium og delt i tre like deler. Etter hver del ble supplert med angitte doser av SW, ble halvparten av cellesuspensjon tilsatt til den øvre brønnen av transwell innsatsen (Corning Inc, Corning, NY) med en tetthet på 1 x 10
4 (for T24 og HepG2-cellene ) eller 5 x 10
3 (for MDA-MB-231-celler) per brønn. Den nedre brønn ble det tilsatt med RPMI 1640 inneholdende 10% FBS medium som kjemotaktiske tiltrekkere. Den resterende halvdelen av cellesuspensjonen ble deretter sådd ut i 96-brønners plater for levedyktighet assay. Etter 12 timer for inkubering ble cellene som har trengt inn i undersiden av transwell membranen farget med krystallfiolett og fotografert i henhold mikroskop. 14 mikroskopiske felt ble tilfeldig fanget og telles. For å evaluere effekten av TGF-β1 på cellemigrasjon, ble cellene sultet med RPMI 1640 inneholdende 0,5% FBS i 24 timer og deretter oppsamlet ved trypsinering. Cellesuspensjonen ble delt i fire like deler og hver del ble supplert med løsningsmiddel, 5 ng /ml TGF-β1, 1,5 ug /ul SW SW eller i tillegg til TGF-β1. Etter tilsetning av halvparten av medikament-inneholdende cellesuspensjon inn i det øvre brønn i transwell innskuddet ble den gjenværende cellesuspensjonen tilsettes til 96-brønners plater. Begge plater ble inkubert i 12 timer. Transwell plater ble anvendt for migrering analysen og de 96-brønners plater for celleviabilitet analysen. For invasjon assay, et lag av Matrigel (1: 4 fortynning i serumfritt medium) ble forhåndsbelagt på det øvre brønn av transwell innsatsen før tilsetning av celler, og cellene ble inkubert i 36 timer før krystallfiolett farging. Resten prosedyrer var de samme som migrasjon analysen.
Cell sårheling analysen
To parallelle linjer ble trukket på baksiden av 12-brønners plater med en tusj før celle seeding. Neste dag ble kulturmediet ble fjernet og erstattet med 0,5% FBS /RPMI 1640 medium. 24 timer senere ble en rett linje sår som var vinkelrett på disse parallelle linjer trukket over den vedlagte cellelaget med pipettespissene. Derfor ble såret gapet mellom to parallelle linjer markert. Etter å ha fjernet de flytende cellene med PBS, indikerte doser av SW ble tilsatt i hver brønn. Bildene ble tatt av markedet gap hver 6-8 time før såret lukket opp. Såret hullene ble digitalt kvantifisert ved hjelp av Image Pro Plus-programvare.
Animal modell
7 til 8 uker gamle Balb /c nakne mus (Vital River Laboratories, Beijing, Kina) var injisert gjennom halevenen med 1 × 10
6 MDA-MB-231 celler. Neste dag, mus (n = 8 for hver gruppe) ble oralt administrert med 72,7 mg SW (fremstilt i PBS, lik til 1 g av SGR) eller PBS per dag. Etter to uker ble musene holdt i ytterligere 3 uker før de ble ofret for lunge- og leversamling. Hematoxylin og eosin (H E). Farging ble anvendt for å overvåke og telle metastatiske foci i lunge eller lever
Måling av celleproliferasjon
Celler ble behandlet med SW eller oppløsningsmiddel ble sådd på 96-brønners plater og inkuberes. Cell samløpet Hastigheten ble kvantifisert ved hjelp CloneSelect Imager system.
Western blot
Celler utsatt til SW for angitte tider ble samlet i lyseringsbuffer som inneholdt 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 150 mM NaCl , 2 mM EDTA, 1% SDS, 2 mM ditiotreitol (DTT) og 1 x protease inhibitor cocktail (Roche, Mannhelm, Tyskland) og deretter ultralydbehandlet i 30 sekunder på is. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-kit (Pierce, Rockford, IL). Cellelysater (30 mikrogram per prøve) ble separert på 8% -15% SDS-PAGE før de elektrooverført til nitrocellulosemembraner. Etter blokkering med 5% fettfri melk i 0,1% Tween 20 /TBS (TBST), ble membranene probet med primære antistoffer over natten ved 4 ° C og deretter reprobed med HRP-merkede sekundære antistoff i 45 minutter ved romtemperatur (RT). Signaler ble oppdaget av en forbedret kemoluminescens system fra Pierce (Rockford, IL).
immunfluorescens
Celler ble sådd på steriliserte Dekk. Neste dag, SW ble tilsatt, og cellene ble inkubert i angitt tid. Ved slutten av forsøket ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur før den ble permeabilisert med 0,1% Triton-X-100 i PBS i 4 min. Etter blokkering med 5% BSA /PBS i 1 time, cellene ble inkubert med anti-vinculin-antistoff (1: 100) over natten ved 4 ° C og deretter TRITC-konjugerte anti-mus andre antistoff og FITC-merket phalloidin (Sigma) blandinger for 1 time ved RT. Kjerner ble farget med DAPI før du tar bilder gjennom Leica TCS SP5 laser konfokalmikroskop.
Analyse av brennvidde heft
Intensiteten av vinculin signal og arealet av fokale vedheft ble analysert ved Adobe Photoshop CS5 og image Pro Plus programvare. For det første, Vinculin-farget bildene ble de-mettet, omvendt og de-noised ved hjelp av Photoshop programvare for å produsere vedheft fotavtrykk. Deretter disse vinculin holdige overføringene ble videre valgt ut av terskelverdier i Image Pro Plus-programvare. Gjennom kalibrering, ble området og intensiteten av vinculin holdig fotavtrykk kvantifisert ved hjelp av «telle /størrelse» kommandoen. Totalt 50-celler ble analysert i hver gruppe.
Microarray analyse og sanntids RT-PCR
RNA ble ekstrahert fra HepG2-celler behandlet med SW (1,5 ug /ul) ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen) og cDNA ble syntetisert ved anvendelse av revers transkriptase system (Promega, Madison, WI). Genuttrykk profiler ble undersøkt av Shanghai Bioteknologi Corporation (Shanghai, Kina) med Affymetrix menneskelige genet 1.0st mikromatriser. Microarray data har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (tiltredelse no. GSE58201). Etter Robust Multi-matrise Average (RMA) normalisering,
P
verdi 0,05 og Fold-Change terskel 1.5 ble identifisert til å være statistisk signifikante endringer. KEGG, GO og Gene kort (https://www.genecards.org/) ble brukt til å velge ut gener som ble relatert til celle adhesjon, migrasjon og invasjon. Deretter ble disse genene satt inn STRING database for signalveien søke. Real-time RT-PCR ble brukt til å validere resultatene av microarray og utføres i henhold til produsentens instruksjoner (SYBR, Toyobo). Expression nivåer av alle genene ble normalisert gjennom
GAPDH
genet og 2
-ΔΔCT metoden ble brukt til å beregne relativ genekspresjon. De primere for real-time RT-PCR (
TGFBR1
, fremover, 5′-CCTGGGATTTATAGCAGCAGAC-3 «, revers, 5′-TGACACCAACCAGAGCTGAG-3»;
NTS
, fremover, 5 « -ATTAGTAAAGCACATGTTCC-3 «, revers, 5′-CTCCCAGTGTTGAAAAGCCC-3»;
ID1
, fremover, 5′-GAGCTGAACTCGGAATCCGAAG-3 «, revers, 5′-GATCGTCCGCAGGAACGCATGC-3»;
ID2
, fremover, 5′-TCAGCCTGCATCACCAGAGA-3 «, revers, 5′-CTGCAAGGACAGGATGCTGATA-3»;
ID3
, fremover, 5′-CTGAGCTTGCTGGACGACA-3 «, revers, 5′-ATGTAGTCGATGACGCGCTGTA-3») ble syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina).
Statistisk analyse
data~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). To-tailed students t-test og ANOVA ble benyttet for å bestemme betydningen av forskjeller mellom ulike eksperimentelle grupper.
Resultater
SW øker celle adhesjon
For å teste effekten av SW på kreftcellenes evne til å binde seg til ekstracellulær matriks, utførte vi celleadhesjon analyse ved bruk av hepatom-cellelinje HepG2 (fig. 1A), brystcancer cellelinje MDA-MB-231 (fig. 1B) og blærecancercellelinje T24 (fig. 1C). Det ble funnet at adhesjonen av HepG2-celler i matrigel ble øket med 0,7 ug /ul av SW (fig. 1A), mens virkningen av samme konsentrasjon av SW på adhesjonen av MDA-MB-231-celler var marginal (Fig. 1B) . Det motsatte, økning i adhesjonen ble mer tydelig i T24-celler, og den høyeste adhesjon ble oppnådd med så lite som 0,07 pg /pl til SW (figur 1C.)
Left paneler:. HepG2 (A), MDA-MB-231 (B) og T24-celler (C) ble forbehandlet med angitte doser av SW i 15 eller 30 minutter før utsåing i Matrigel-belagte brønner, og 2 timer senere, klebet celler ble talt etter fjerning av de flytende celler ved PBS. Representative bildene ble vist. Scale bar, 200 mikrometer. Høyre paneler: kvantifisering av data i det venstre panelet, vist var sammensatte resultatene av tre uavhengig eksperimenter med tre eksemplarer. Kolonner, mener; barer, SD.
SW hemmer kreft celle migrasjon
Deretter utførte vi
in vitro
scratch analysen. Celler ble pre-inkubert i 0,5% FBS medium i 24 timer forut for innføringen av grunnen for å utelukke virkningen av FBS på celleproliferasjon. Den sårtilheling ble overvåket med jevne mellomrom før det lukket opp. Vi observerte at SW førte til en nedbremsing av migrasjon i HepG2, MDA-MB-231 og T24-celler (fig. 2A, B og C), med MDA-MB-231-celler som viser den mest åpenbare inhiberende effekt (Fig. 2B ). Vi la merke til at det kreves forskjellig tid for forskjellige cellelinjer for å lege sårene. I tillegg har samme konsentrasjon av SW viste tydelig hemming på sårheling i forskjellige cellelinjer. Dette kan forklares med celle linage spesifisitet ved migrasjon. Tatt i betraktning den ruhet og subjektivitet scratch analysen, har vi også brukt transwell migrasjon analysen. Cellene som lyktes i å klemme gjennom mikrohullene i basis membranen i SW-behandlede gruppen var betydelig mindre enn de i kontrollgruppen (Fig. 3A, B og C, venstre og midtre paneler), med liten påvirkning på cellenes levedyktighet (fig. 3A, B og C, høyre panel). Disse resultatene peker på den inhiberende virkning av SW på kreftcellemigrering.
In vitro
bunnen av assay ble anvendt for å evaluere virkningen av SW på migrering av HepG2 (A), MDA-MB -231 (B) og T24-celler (C). Representative bildene ble vist i panelet til venstre; kvantifisering av dataene i panel som ble vist i panel høyre, viste sammensatte resultater fra tre uavhengig forsøk med triplikate parallelle prøver. Migrasjonen indeksen representerer migrasjon hastighet i forhold til kontrollgruppen. Kolonner, mener; barer, SD.
HepG2 (A), T24 (B) og MDA-MB-231 (C) celler ble sådd inn i transwell innsatsen i nærvær av angitte doser av SW i 12 timer. Celler som når undersiden av transwell membranen ble farget og representative bildene ble vist i øvre panel. Scale bar, 200 mikrometer. Dataene i venstre panel ble kvantifisert og vist i det midtre panelet og cellen levedyktighet ble reflektert av celle samløpet hastighet i panelet til høyre. Vist var sammensatte resultatene av to uavhengig eksperimenter. Kolonner, mener; barer, SD; NS, ikke statistisk signifikant.
SW hemmer kreft celle invasjon
in vitro Hotell og metastase
in vivo
Vi har også testet effekten av SW på kreftcelle invasjon. Likevel, vi brukte den samme transwell enhet pluss lasting av et lag med matrigel over basen membran. Som forventet, SW behandling forhindret alle tre cellelinjer fra invaderende over matrigel å nå den nederste side av basismembran (fig. 4A, øvre panel og nedre venstre panel). I tillegg 36 timers eksponering for angitte doser av SW som utøves ubetydelig inhibering av celleproliferasjon (fig. 4A, høyre panel lavere). For ytterligere å evaluere effekten av SW på metastaser
in vivo
, MDA-MB-231 metastatisk mus modellen ble brukt. Som vist på fig. 4B, oral administrering av SW i 2 uker markant redusert antall lungemetastaser. Det er ingen levermetastatiske foci ble observert i begge grupper (S1 Fig.)
(A) transwell kamrene ble forhåndsbelagt med 60 ul matrigel fortynning (1: 4 i serumfritt medium). Før såing celler. Celler ble inkubert med angitte doser av SW i 36 timer før farging. Representative bilder ble vist i øvre panel. Scale bar, 200 mikrometer. Dataene for migrering og cellelevedyktigheten ble kvantifisert og vist henholdsvis i det nedre panel, vist var kompositt resultatene av to uavhengig eksperimenter med tre paralleller. Kolonner, mener; barer, SD; NS, ikke statistisk signifikant. (B) Venstre panel: representative bilder av H E farget lunge vev i PBS og SW-behandlede gruppen. Parafininnstøpte lungene ble delt ved 30-mikrometer intervaller og 10 MDA-MB-231 kreftceller ble identifisert som metastaser. Forstørrelse, 4 × (øverst) og 20 × (lavere). Høyre panel: kvantifisering av lungemetastaser i PBS og SW-behandlede mus (n = 8 for hver gruppe). Kolonner, mener; barer, SD.
SW øker brennvidde heft
Det ble rapportert at antall og størrelse på fokale sammenvoksninger var omvendt proporsjonal med migrasjon hastighet [24]. For dette utføres dobbelt fluorescent farging av F-aktin og vinculin å vurdere effekten, om noen, av SGR på fokal adhesjon [20,24,25]. Etter eksponering for SW i 0,5 timer, HepG2 og T24 celler begynte å stille sterkere vinculin signal hovedsakelig rundt cellen periferien, viser en fascikkel lignende eller spot-lignende fasong (Fig. 5A). Tilsvarende ble store spennings fiber over cellen kroppen tapt, med F-aktin fibrene gradvis skifte til celle periferien og co-lokalisere det med vinculin også. Vi kvantifisert områder og fluoriserende intensiteter av vedheft områder. Som vist på fig. 5B, adhesjonen areal per celle forhøyet i 0,5 timer og nådde platå på 1 time i SW-behandlede HepG2-celler, mens det allerede oppnådd topp ved 0,5 timer etter SW behandling i T24-celler. Lignende resultater ble oppnådd i intensitet kvantifisering (fig. 5C).
(A) og HepG2-T24-celler ble behandlet med SW (3,5 ug /ul) for angitte ganger og deretter immuno-farget med F-aktin (FITC -phalloidin) og vinculin (rød). Kjerner ble kontra av DAPI (blå). Representative bildene ble vist. Scale bar, 100 mikrometer. (B) Arealet av vedheft sider per celle (der F-aktin og vinculin slått sammen). Viste sammensatte resultatene av to uavhengig eksperimenter (n = 50 celler). Kolonner, mener; barer, SD. (C) Fluorescensintensiteten av vinculin i adhesjons lapper per celle. Viste sammensatte resultatene av to uavhengig eksperimenter (n = 50 celler). Kolonner, mener; barer, SD.
SW motvirke TGF-β1-indusert oppregulering av gener relatert til invasivitet
For å få en dypere forståelse av mulige mekanismen bak alle disse resultatene, vi utførte en genekspresjon microarray analyse med SW-behandlet HepG2 celler. Vi fant det var 118 gener med mer enn 1,5 ganger ekspresjon endring i celler behandlet med SW, noen av dem var knyttet til celle motilitet, metabolisme, og oksidativt stress (Fig. 6A). Deretter analyserte vi en undergruppe av gener assosiert med celle invasivitet hjelp STRING database. Som vist på fig. 6B, har de fleste av disse 12 gener ble direkte eller indirekte regulert av TGF-β1 vei, noe som indikerer at TGF-β1 reaksjonsvei kan være involvert i SW-regulert fenotyper. Real-time RT-PCR ble utført for å evaluert uttrykk nivåer av 5 gener, dvs.
TGFBR1
,
NTS
,
ID1
,
ID2
, og
ID3
i HepG2 og T24-celler behandlet med TGF-β1 med eller uten SW. SW alene reduserte nivåer av
NTS
,
ID1
,
ID2
, og
ID3
i HepG2 celler og
TGFBR1
,
NTS
,
ID1
, og
ID2
i T24 celler. På den annen side, TGF-β1 signifikant forhøyet mRNA-nivåer av disse genene i begge cellelinjer (Fig. 6C), som bekrefter at disse genene er på nedstrømssiden av TGF-β1 signalering. Men flertallet av TGF-β1-indusert økning i genekspresjon ble motvirket av samtidig behandling med SW, med unntak av
ID1
i HepG2 celler (Fig. 6C). I tillegg observerte vi oppregulert proteinnivåer TGFBR1 i TGF-β1-behandlede HepG2 og T24 celler, som ble reversert av SW (Fig. 6D). For ytterligere å bekrefte den hemmende effekten av SW på TGF-β1 signalering, evaluerte vi virkningen av SW på TGF-β1-indusert migrering. Som vist på fig. 7, TGF-β1-promo migrering ble markert opphevet ved SW i HepG2, MDA-MB-231 og T24-celler, mens cellelevedyktigheten var upåvirket av SW (Fig. 7A, B og C).
(A ) varmen kartet funksjonelle berikelse av differentialy uttrykte gener fra HepG2 chip resultat. Klynge 3,0 og Treeview programvare ble benyttet for å generere kart varmen. Red: oppregulering versus mener; green: nedregulering versus mener. (B) Den regulerende nettverk blant gener relatert til adhesjon, migrasjon og invasjon i (A) ved hjelp av STRING-databasen. (C) Sanntid RT-PCR verifisering av genene i HepG2 og T24-celler behandlet med TGF-β1 med eller uten SW. Vist var sammensatte resultatene av tre uavhengig eksperimenter med tre eksemplarer. Kolonner, mener; barer, SD. (D) Virkning av SW på TGF-β1-indusert oppregulering av TGFBR1 ble evaluert ved immunblotting. Vist var representative resultater fra 3 uavhengige eksperimenter.
HepG2 (A), ble MDA-MB-231 (B) og T24 (C) celler utsådd i transwell innstikk i nærvær av TGF-β1 pluss SW. 12 timer senere ble cellene farget og avbildet. Representative bilder ble vist i panelet til venstre. Scale bar, 100 mikrometer. Dataene i migrering ble kvantifisert og vist i det midtre panelet. Cellen levedyktighet ble reflektert av celle samløpet hastighet i panelet til høyre. Vist var sammensatte resultatene av to uavhengig eksperimenter med tre eksemplarer. Kolonner, mener; barer, SD; NS, ikke statistisk signifikant.
Diskusjoner
SGR, også kjent som Sarsaparilla, ble rapportert å vise kreft potensial [8,21]. Flere SGR inneholder urte formler som brukes i Sørøst-Asia ble vist seg å hemme kreft
in vitro Hotell og
in vivo product: [20,26]. De fleste av tidligere studier fokusert på den inhiberende virkning av SGR på kreftcellevekst, og bare noen få vurdert sin virkning på invasivitet av kreftceller. En SGR holdig urte formel ble vist å undertrykke lungekarsinom metastase [27]. Forbindelser isolert fra SGR, dvs. 5-O-caffeoylshikimic syre, taxifolin og astilbin, ble vist å ha hemmende virkning på adhesjon og /eller migrering av immunceller [22]. I tidligere studie har vi funnet cellevekst inhibering av SGR var en relativt langvarig virkning (mer enn 24 timer) under høye doser [21]. I den foreliggende undersøkelse, vi, for første gang, rapporterte den hemmende effekten av SGR ekstrakt på invasivitet av tre kreftceller, sannsynligvis gjennom undertrykkelse av TGF-β1 pathway. Det bør nevnes at all
in vitro
eksperimenter ble utført med lave doser av SW i løpet av kort sikt for å minimalisere skjevhet resulterte fra SW-indusert veksthemming.
Focal adhesjon er den grunnleggende struktur Modulenheten enheten~~POS=HEADCOMP av celleadhesjon, vil eventuelle endringer i dens struktur eller sammensetning påvirker adhesjonen styrken av celler i det hele tatt [24,25]. Dannelsen av fokale vedheft går gjennom flere stadier, med begynnende vedheft, focal kompleks og deretter brennvidde heft [25]. Størrelsen og modenhet fokale sammenvoksninger ble rapportert å være omvendt korrelert med cellemigrasjon hastighet [24]. I denne studien, observerte vi en gradvis forskyvning av vedheft patcher fra cellekroppen til celle omkrets i SW-behandlet HepG2 og T24 celler, med sterkere vinculin signal og større heft størrelsen på cellen cortex. Dette fenomenet var, i det minste delvis, på grunn av plass- og seterettet forskyvning av adhesjons-relaterte proteiner, spesielt i T24-celler. Interessant, SW-indusert store og faste perifere sammenvoksninger lignet brennvidde heft kinase (FAK) -deficient celler [25,28]. I tillegg kan celler som mangler enten tyrosin fosfataser som SHP-2 eller Src kinaser oppviste også et lignende mønster adhesjon [24,29]. Derfor kan en svekkelse av FAK-Src vei mekle denne SW-indusert effekt, noe som krever videre undersøkelser.
chip Resultatet indikerte en undertrykkelse av TGF-β1 signalisering i SW-behandlede celler. Gener inkludert
HMOX1 product: [30,31],
PSAT1 product: [32],
TGFBR1 product: [33],
EDNRA product: [34,35],
NTS product: [36,37],
ID1 product: [38,39],
ID2 product: [40,41] og
ID3 product: [42,43 ], alt relatert til celle adhesjon, migrasjon og invasjon, ble enten direkte eller indirekte regulert av TGF-β1 signalveien. Den inaktivering av TGFBR1 s kinase-domene kan forhindre TGF-β1 signalering fra forplanter seg nedover [33]. I mellomtiden, oppheving av TGF-β1 signale bruker dominant negativ TGFBR kan blokkere epitel-mesenchymale overgang (EMT) bryter
in vivo product: [44], noe som tyder på at undertrykkelse av TGFBR kan gi et mulig middel for å undertrykke TGF-β1 signale . I denne studien ble TGF-β1-indusert TGFBR1 redusert av SW. I tillegg SW opphevet TGF-β1-indusert økning i migreringen, noe som bekrefter den hemmende effekten av SW på TGF-β1 veien.
Det skal nevnes at TGF-β1 signalering ble funnet å øke celleadhesjon og fremme fokal adhesjon [45], kan derfor SW-indusert celle-adhesjon og fokal adhesjon er avhengige av forskjellige mekanismer. Dette øker muligheten for at SW-hemmet kreft celle invasivitet kan være den integrerte effekten av flere signal hendelser. Andre veier ble også spådd å bli påvirket av SW i microarray analyse, slik som metabolisme og oksidativt stress. Nyere studier markere bidrag deregulert metabolisme og oksidativt stress til kreftcelle invasivitet [46,47]. Enten SW kunne utnytte disse banene å regulere kreft celle invasivitet fortjener nærmere undersøkelse.
Sammen fant vi SGR kunne fremme celle adhesjon muligens ved å øke størrelsen og styrken av fokale sammenvoksninger, og hemmer migrasjon og invasjon av HepG2, MDA -MB-231 og T24 celler. Undertrykkelse av TGF-β1 signale delvis bidrar til SW-indusert migrering inhibering. Selv om disse resultatene ble oppnådd fra en undergruppe av kreft cellelinjer, kan romanen anticancer funksjonen til SGR gi en mulig molekylære grunnlaget for fremtidig klinisk anvendelse i behandling av kreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Ingen metastaser ble observert i lever av mus
Representative bilder av H . E farget levervev i PBS og SW-behandlede gruppen. Parafininnstøpte lever ble delt på 30 mm-intervaller og 10 MDA-MB-231 kreftceller ble identifisert som metastaser. Scale bar, 200 mm, forstørrelse × 10
doi:. 10,1371 /journal.pone.0118287.s001 plakater (TIF)
