Abstract
Bakgrunn
Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er en ledende årsaken til kreft død på verdensbasis. Tidlig diagnose er avgjørende for forbedring av overlevelse og prognose av pasientene. Foreløpig er det ingen effektiv biomarkør tilgjengelig i kliniske settinger for tidlig deteksjon av lungekreft. Endrede uttrykk i mange krefttyper, inkludert NSCLC og stabil tilværelse i plasma gjøre microRNAs (mirnas) en gruppe av potensielt nyttige biomarkører for klinisk vurdering av pasienter med NSCLC.
Mål
For å evaluere de potensielle verdiene av miRNAs som blodbaserte biomarkører for tidlig diagnose og prognose hos NSCLC pasienter.
Metoder
Perifere blodprøver fra friske frivillige og NSCLC pasienter tidlig-iscenesatt før og etter operasjonen ble samlet inn, og plasma ble separert. Uttrykk av ti miRNAs i plasma og kreft deler av pasientene ble oppdaget av kvantitativ real-time PCR.
Resultater
Mirna (MIR) -486 og MIR-150 ble funnet å vesentlig skille lungekreftpasienter fra friske frivillige. Areal under kurven for MIR-486 og MIR-150 var 0,926 (følsomhet, 0.909, spesifisitet, 0,818), henholdsvis, og 0,752 (spesifisitet, 0,818 følsomhet, 0,818). I respons på behandling, pasienter med nedregulert Mir-486 uttrykk viste langvarig tilbakefall overlevelse enn de med un-redusert Mir-486 uttrykk (median, unådde vs. 19 måneder, hazard ratio, 0,1053; 95% konfidensintervall, 0,01045 til 1.060;
P
= 0,056)
Konklusjoner
resultatene tyder på at MIR-486 og MIR-150 kan være potensielle blodbaserte biomarkører for tidlig diagnose av NSCLC. . Overvåking endring av Mir-486 uttrykk i plasma kan være en effektiv og ikke-invasiv metode for tilbakefall prediksjon av pasienter tidlig-iscenesatt NSCLC
Citation. Li W, Wang Y, Zhang Q, Tang L, Liu X Dai Y, et al. (2015) mikroRNA-486 som en biomarkør for tidlig diagnose og Tilbakefall av ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (8): e0134220. doi: 10,1371 /journal.pone.0134220
Redaktør: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, USA
mottatt: 8 mai 2015; Godkjent: 07.07.2015; Publisert: 03.08.2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av Changzhou Science and Technology Support Program (nr CE20125002)
Konkurrerende interesser: Jim Lu er aksjonær og eieren av Chang GoPath Diagnostic Laboratory Co Ltd og GoPath Laboratories LLC i Buffalo Grove, IL, USA. Zhongmin Guo er ansatt i Chang GoPath Diagnostic Laboratory Co Ltd og GoPath Laboratories LLC i Buffalo Grove, IL, USA. Wanshuai Li, Qi Zhang, Lili Tang, Xiaoping Liu, Yunhua Dai, Liang Xiao, Shuguang Huang, og Lu Chen er ansatt i Chang GoPath Diagnostic Laboratory Co Ltd Ingen potensiell konkurrerende interesse er beskrevet av de andre forfatterne. Studien ble delvis finansiert av Chang GoPath Diagnostic Laboratory Co Ltd i Kina og GoPath Laboratories LLC i Buffalo Grove, IL, USA. Den kommersielle tilknytning til forfatterne og studien endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 80% av lungekreft, som er en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. I løpet av de siste tiårene har fremskritt i kirurgiske teknikker og strategier for kjemoradioterapi og målet terapi har betydelig forbedret overlevelse av pasienter med lungekreft [2, 3]. Til tross for forbedringer av kliniske tilnærminger i behandling av lungekreftpasienter, overlevelsen av pasienter med lokalavansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) forblir fattige, med en 5-års total overlevelse (OS) på 15% for stadium III NSCLC pasienter behandlet med samtidig kjemoradioterapi [3, 4]. Det er anslått at mer enn 200.000 nye lunge krefttilfeller og rundt 150 000 dødsfall knyttet til lungekreft forekommer årlig i USA [1]. Tidlig diagnose representerer en av de mest effektive strategier for å forbedre overlevelse og prognose av lungekreftpasienter [2]. Men det er ingen klinisk biomarkør i bruk i dag for tidlig diagnose og prediksjon av prognose for pasienter med lungekreft.
microRNAs (mirnas) er single-RNA arter som utgjør en klasse av ikke-kodende RNA, og dukker som viktige regulatorer av genuttrykk [5]. Mange studier har vist at mirnas oppviser endret ekspresjon i forskjellige krefttyper, og kan tjene som viktig prognostisk biomarkør av kreft [6-8]. Nyere funn som humant plasma inneholder stabilt uttrykt mikroRNA har avdekket et stort potensial for blod-basert miRNA signatur som lettvinte biomarkører for klinisk vurdering av kreft hos mennesker [8-10]. For eksempel, sirkulerende MIR-21 var signifikant høyere hos pasienter med NSCLC enn det i normale kontroller, [9, 11]. Serumnivåer av MIR-486, MIR-30d, MIR-1 og MIR-499 var signifikant assosiert med total overlevelse hos NSCLC pasienter [8]. Serum MIR-210 var signifikant oppregulert i NSCLC pasienter, sammenlignet med friske kontrollpersoner [12].
I denne studien har vi undersøkt litteraturen og valgt ti mirnas relatert til NSCLC, inkludert MIR-126 [13 ], MIR-150 [14], MIR-155, MIR-205 [11, 15], Mir-21 [9, 11], MIR-210 [12], Mir-26b [10], MIR-34a [7 ], MIR-451 [16] og MIR-486 [8, 9], for å sammenligne miRNA nivåer mellom friske frivillige og NSCLC pasienter.
Materialer og Metoder
pasienter
Denne studien retrospektivt registrert tidlig stadium pasienter (før stadium IIIa) som tidligere hadde fått lunge resections for primær NSCLC mellom november 2012 og februar 2014. pasientene ble identifisert fra biorepository database med kirurgisk patologi fra Institutt for Thoracic Surgery, nr 2 Folkets sykehus i Changzhou, Changzhou, Jiangsu, Kina. Det var ingen andre inklusjons eller eksklusjonskriteriene for denne studien. Svulster ble iscenesatt i henhold til svulsten-node-metastaser (TNM) staging system av amerikanske Joint Committee on Cancer [17]. Kontrollpersoner ble rekruttert fra personer som søkte en rutinemessig helsesjekk opp på fysisk helse Examination Centre of No. 2 Folkets sykehus i Changzhou, og hadde ikke tidligere blitt diagnostisert med kreft. En 5-ml perifer venøs blodprøve ble tatt fra friske frivillige og pasienter med NSCLC 2 dager før og 7-10 dager etter kirurgi, og samles opp i en antikoagulant rør med etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Hele blodprøver ble deretter sentrifugert ved 1000 g i 30 min ved 4 ° C i en Sigma 3K15 sentrifuge (SIGMA Laborzentrifugen, Osterode am Harz, Tyskland). Plasma ble umiddelbart samlet, frosset og lagret ved -80 ° C for videre analyser. Gjentatt opptining ble unngått under lagring for å sikre kvaliteten på prøvene. I tillegg matchet formalinfiksert, ble parafininnstøpte (FFPE) vev av de 11 NSCLC samlet for å følge analyser. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av nr 2 Folkets sykehus i Changzhou og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne i studien.
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR)
RNA-ekstraksjon ble utført som beskrevet [12] med små modifikasjoner. Total RNA, inkludert mirnas, ble ekstrahert og renset fra 200 ul plasma eller 4 lysbilder av FFPE svulstvev ved hjelp av Qiagen miRNeasy Mini Kit eller QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til protokollene fra produsenten. Renheten og Konsentrasjonen av RNA ble bestemt ved bruk av en dual-beam spektrofotometer ultrafiolett (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). For kvantitativ påvisning av miRNA ved RT-PCR [18], renset plasma miRNA ble omdannet til cDNA ved revers transkripsjon reaksjoner under anvendelse av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, USA) og miRNA-spesifikke stem- sløyfe primere ble levert av TaqMan mikroRNA Analyser (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, USA). Totalt 10 mirnas som har blitt rapportert å vise endrede uttrykk i lungekreft ble valgt for analyse og deres sekvenser er vist i S1 tabell. RT reaksjonene ble blandet i henhold til produsentens protokoll og utført på en Applied Biosystems 9700 PCR instrument ved anvendelse av følgende betingelser: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, 85 ° C i 5 min, hold ved 4 ° C . Expression nivåer av de valgte mirnas ble testet ved hjelp av kvantitativ real-time PCR-analyse i en ABI 7900HT rask real-time PCR system (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, USA). Real-time PCR-reaksjoner ble utført i en 5 ul reaksjonsblanding inneholdende 2,5 ul TaqMan PCR Universal Master Mix II (Applied Biosystems, Inc.), 0,25 ul miRNA-spesifikke primer /probe blanding (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY , USA), og 2,25 ul fortynnet RT cDNA som templat ved hjelp av følgende Syklusparametrene parametrene~~POS=HEADCOMP: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Reaksjoner ble utført in triplo. Real-time PCR data ble samlet inn ved hjelp av SDS 2.2 programvare (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, USA) og relative nivåer av de testede miRNA i plasma og vevsprøver ble beregnet ved hjelp av C. elegans syntetisk Mir-39 og RNU44 som normalisering kontroller, henholdsvis [18-20]. Sekvenser av begge normalisering styre primere er vist i tabell S1. Syklusen terskel (CT), som ble definert som antall PCR-sykluser som er nødvendig for det fluorescente signalet til å være høyere enn en terskelverdi som indikerer referanse variasjoner, ble registrert. Relative genuttrykk nivåer av testede prøvene ble representert av to
-ΔΔCT, hvor ΔΔCT = CT
mirnas-CT
normalisering kontroll.
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble foretatt ved hjelp av GraphPad Prism versjon 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) og SPSS statistikkpakke, versjon 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) for Windows. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Mann Whitney test ble brukt til å analysere forskjeller i miRNA plasmakonsentrasjoner mellom NSCLC pasienter og friske frivillige. Mottaker som opererer egenskaper (ROC) analyse ble gjennomført for å bestemme evnen av plasma miRNA nivåer for å diskriminere mellom NSCLC pasienter og friske frivillige. Sammenhengen mellom vev og plasma miRNA nivåer ble analysert ved hjelp av Spearmans korrelasjonskoeffisient. Log-rank (Mantel-Cox) Test ble brukt til å vurdere sammenhengen mellom tilbakefall overlevelse (RFS) og miRNA uttrykk endringer før og etter operasjonen. En
P
-verdi. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
MiR-486 og MIR-150 ble betydelig økt i plasma av NSCLC pasienter
for å identifisere potensielle blodbaserte miRNA biomarkører for NSCLC pasienter, vi analysert kvantitativt uttrykk nivåer av 10 kandidat mirnas i plasma fra 11 NSCLC pasienter og 11 normale individuelle kontroller. Kliniske og histopatologiske kjennetegn ved NSCLC pasienter og kontrollpersoner er oppført i Tabell 1. ble ikke observert noen statistisk signifikant forskjell i alder og kjønn mellom pasienter og kontrollpersoner.
Kvantitativ analyse av 10 kandidat mirnas bestående av MIR -126, MIR-150, MIR-155, MIR-205, MIR-21, MIR-210, MIR-26b, MIR-34a, MIR-451 og MIR-486 i plasma ved real-time PCR viste betydelig høyere nivåer av MIR-486 (
P
= 0,008) og Mir-150 (
P
= 0,0488) i plasmaprøver fra NSCLC pasienter enn de fra normale kontrollpersoner (tabell 2 og figur 1). Ingen signifikante forskjeller ble observert i plasmanivået av de gjenværende mirnas mellom NSCLC pasienter og normale individer. Nivåene av de testede mirnas i enkelte plasmaprøve er vist i figur 1 og gjennomsnittlig uttrykk nivåer av testede mirnas i plasma av NSCLC og normale kontrollpersoner er oppsummert i tabell 1.
Plasmanivåer av MIR-126 , MIR-150, MIR-155, MIR-205, MIR-21, MIR-210, MIR-26b, MIR-34a, MIR-451 og MIR-486 i 11 friske frivillige (sunn) og 11 NSCLC pasienter ble analysert ved hjelp QRT-PCR og normalisert med cel-MIR-39. Solid prikker viste relative uttrykk for miRNAs i hvert fag; tverrgående linjer indikert hjelp av mirnas i hver gruppe.
For å finne ut om høyere nivåer av MIR-486 og MIR-150 i plasma er assosiert med deres økte uttrykk i lungekreft vev, analyserte vi korrelasjoner av deres ekspresjonsnivåer mellom plasma og kreftvev. Spearmans korrelasjonskoeffisient indikerte at MIR-486 nivåer i plasma var sterkt korrelert med sitt uttrykk nivået i vev (Spearman r, 0,8273; 95% konfidensintervall (CI), 0,4348 til 0,9556;
P
= 0. 0,0027) , mens ingen signifikant korrelasjon (Spearman r, 0,5455; 95% CI, -0,1014 til 0,8681;
P
= 0,0876) mellom plasma og vev nivåer for MIR-150 ble observert (figur 2). Dette funnet tyder på at endret uttrykk av MIR-486 i plasma er kreft spesifikk.
Korrelasjon analyser for plasma og vev nivåer av MIR-486 og MIR-150 ble utført med GraphPad Prism 5.0 software. (A) Spearmans korrelasjonskoeffisient analyse av plasma og vev MIR-486 nivåer. (B) Spearmans korrelasjonskoeffisient analyse av plasma og vev MIR-150 nivåer.
MiR-486 og MIR-150 er potensielle blodbaserte biomarkører for påvisning av NSCLC
For ytterligere å utforske den kliniske nytten av MIR-486 og MIR-150, utførte vi mottaker Driftsegenskaper (ROC) analyse på plasma miRNA data fra lungekreftpasienter og normale kontrollpersoner. Analysen observert at arealet under kurven (AUC), sensitivitet og spesifisitet for MIR-486 var 0,926, 0,909 og 0,818, respektivt, og de for MIR-150 var 0,752, 0,818 og 0,818, respektivt (figur 3). Funnene implisere differensial uttrykk for MIR-486 og MIR-150 som potensielle blodbaserte biomarkører for påvisning og diagnostisering av lungekreft.
ROC analyse ble utført med SPSS 16.0 programvare. Den solide og stiplede linjen indikerte ROC kurve av MIR-486 og MIR-150, henholdsvis. AUC, arealet under kurven.
nedregulert plasma MIR-486 nivå etter kirurgi er forbundet med langvarig tilbakefall overlevelse av NSCLC pasienter
For å bestemme mulige roller MIR-486 og MIR-150 forutsi kliniske utfall av lungekreftpasienter, brett endringer i plasmanivået av MIR-486 og MIR-150 før og etter operasjonen ble registrert og var korrelert med overlevelse av pasientene. Relative uttrykk nivåer og brett endringer av MIR-486 og MIR-150 før og etter operasjonen for den enkelte pasient er vist i tabell 2. Alle 11 pasienter ble fulgt etter første operasjon og maksimal oppfølgingsperioden nådde 24 måneder. Under oppfølgingen ble tre pasienter (pasient nr, 101, 103 og 152) diagnostisert som lokalt tilbakefall eller distal metastaser, mens de andre åtte pasienter ble diagnostisert som ingen tilbakefall tabell 2).
Blant 11 pasienter, flertallet av pasientene hadde betydelig redusert plasmanivå etter operasjonen for både MIR-486 og MIR-150 (tabell 2). Vi delte pasientene inn i to grupper i henhold til endringene av miRNA nivåer etter operasjonen. Pasienter med betydelig reduserte miRNA nivåer i plasma (endring 0,8) ble kategorisert i nedregulert (DR) gruppe, og resten pasienter i uavkortet (UR) gruppe. Survival analyse av to grupper av pasienter viste at nedregulert MIR-486-nivå i plasma ble assosiert med forlenget overlevelse av pasienter med unådde median overlevelse for DR og 19 måneder for UR gruppe (figur 3, hazard ratio, 0,1053; 95% CI , 0,01045 til 1,060;
p
= 0,0561). Selv om forskjellen ikke når statistisk signifikant nivå på grunn av begrenset antall pasienter for studien, utviklingen av foreningen er åpenbar og funn støtter en videre studier i en stor pasient kohort. Det ble ikke observert forskjell i pasientens overlevelse for plasma MIR-150 nivå mellom DR og UR grupper (figur 3, hazard ratio, 0,7936; 95% CI, 0,07682 til 8,198;
P
= 0,7936)
diskusjon
NSCLC er en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis, og tidlig diagnose er avgjørende for prognose av pasientene [1, 2]. Mangel på diagnostiske biomarkører for tidlig deteksjon har gjort lungekreft en av kreft hos mennesker med den verste prognosen. Sirkulerende mirnas har blitt rapportert å være bemerkelsesverdig biomarkører for kreftdiagnose på grunn av deres overflod og stabilitet i sirkulerende blod [6-8]. I denne studien sammenlignet vi plasmanivåer av ti mirnas som er rapportert å ha endret uttrykk i NSCLC [7-16], mellom friske frivillige og scene NSCLC pasienter tidlig. Vår studie identifisert to kandidat miRNAsmiR-486 og MIR-150 som potensielle blodbaserte biomarkører for tidlig diagnose og prognose av NSCLC pasienter (fig 1).
Serum MIR-150 har blitt rapportert å være abnormt økt i tidlig iscenesette NSCLC pasienter og signifikant korrelert med fjernmetastaser [14]. MiR-150 fremmer proliferasjon av lungekreftceller ved å målrette P53 [21, 22] og BAK1 [23], og spiller derfor en viktig rolle i patogenesen mekanistiske av lungekreft. Studier av diagnostisk verdi av MIR-150, spesielt for tidlige stadier av lungekreft, er begrenset. I samsvar med tidligere rapporter [21-23], vår studie observert betydelig økt uttrykk av MIR-150 i både kreft vev og plasma av scenen NSCLC pasienter tidlig. Enda viktigere, viste vi at høyere MIR-150 kunne påvises i plasma av tidlige stadier av lungekreftpasienter og var i stand til å skille lungekreftpasienter fra friske individer med AUC-verdi på 0,752 (figur 2). Dette funnet impliserer MIR-150 som en blod-basert kandidat biomarkør for tidlig deteksjon av lungekreft.
Et annet interessant funn fra studien er at MIR-486 ser ut som en mer betydelig biomarkør for klinisk vurdering av lungekreftpasienter . Data samlet fra forskjellige tidligere studier på MIR-486 i lungekreft var kontroversielt. Peng et al har rapportert at MIR-486 er betydelig nedregulert i kreft [24]. Wang et al videre rapportert at nedregulering av MIR-486 i lungekreft signifikant korrelert til stadier og lymfe metastasering av pasienter [25]. Studier av Solomides et al viste at MIR-486 er redusert i lungekreft vev [10]. Men en studie av MIR-486 viste at oppregulert MIR-486-nivå i plasma ble korrelert med kort total overlevelse [8]. I denne studien demonstrerte vi at MIR-486 ble oppregulert i plasma fra pasienter med NSCLC og fremstår som en mer sensitiv og spesifikk markør i plasma for å differensiere tidlige stadier av lungekreft fra normale individer (AUC, 0,926, fig 2), så sammenlignet med MIR-150. Dette funnet tyder på at MIR-486 er en mer lovende markør for tidlig påvisning av lungekreft i perifert blod. Vi innser at vår Resultatet er uforenlig med funn fra noen av de tidligere studiene som rapporterte konstant nedregulering av MIR-486 i lungekreft [10, 24, 25]. Dette inconsistence kan skyldes raseforskjellen i gruppene for studiet.
Det er blitt vist at avvikende miRNA nivåer i perifert blod hos kreftpasienter er forårsaket av deregulert miRNA ekspresjon i tumorvevet som hemmelige tumor-avledede mirnas i kroppsvæsker inkludert perifert blod [15]. For å finne ut om unormale nivåer av miR486 og miR150 i plasma tumorspesifikk, sammenlignet vi tilsvarende vev miRNA nivåer og plasma miRNA nivåer. Vi fant ut at at NSCLC vev MIR-486 nivåer var signifikant korrelert med plasmanivå, mens ingen statistisk korrelasjon ble observert i MIR-150 nivåer (fig 3). Disse resultatene antyder at MIR-486 kan være mer tumorspesifikt enn MIR-150. Basert på dette funnet, hypotese vi at nivåene av mirnas i plasma kan bli brukt for å overvåke status av lokale tumorer, for eksempel tilbakefall etter operasjonen. For å teste denne hypotesen, sammenlignet vi MIR-486-nivå i plasma før og etter operasjonen. Vi fant at nivåene av MIR-486 i plasma betydelig redusert i flertallet av pasienter etter kirurgiske fjerning av svulster, mens bare tre tilfeller forble høye nivåer av MIR-486 i plasma. Interessant analyse av sammenslutning av plasmanivået av MIR-486 med RFS oppfølgingsdata på pasienter viste en tett sammenheng med endringer av plasma MIR-486 med tilbakevendende statusene for pasientene. Pasienter med nedregulert plasma MIR-486 nivåer etter operasjonen hadde forlenget RFS enn de med høye nivåer av MIR-486 i plasma (fig 4). Dette funn impliserer at endringer av MIR-468 nivåer i plasma som svar på operasjonen kan være en lovende blod-baserte markør for å forutsi lokalt tilbakefall av tumor etter kirurgi i NSCLC. På grunn av begrenset antall pasienter i denne studien, er en stor kohort av pasienter under rekruttering i vår fortsetter studie for å ytterligere bekrefte dette viktig funn.
Foreningen for RFS og plasma miRNA nivå endringer før og etter operasjonen ble plottet med Log-rank (Mantel-Cox) Test. (A) Totalt RFS av alle NSCLC pasienter. (B) Association of RFS og endring av plasma MIR-486 nivå før og etter operasjonen. (C) Association of RFS og endring av plasma MIR-150 nivå før og etter operasjonen. DR, nedregulert; UD, un-nedregulert; HR, hazard ratio; KI, konfidensintervall.
Konklusjoner
Plasmanivåer av MIR-486 og MIR-150 kan være potensielle biomarkører for tidlig diagnose av NSCLC pasienter. Overvåking plasma MIR-486 nivåer før og etter operasjonen kan forutsi risiko for tilbakefall for tidlig stadium av NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Target sekvensene av miRNA sonder
doi:. 10,1371 /journal.pone.0134220.s001 plakater (docx)
Takk
Takk Dr. Leiming Cai (The Department of Pathology , nr 2 Folkets sykehus i Changzhou) for klinisk informasjon og prøvetaking. Dette arbeidet ble støttet av Changzhou Science and Technology Support Program (nr CE20125002).
