Abstract
Fremskritt innen kreft initiere celler og høy gjennomstrømming
in vivo
shRNA skjermer har markert et behov for å observere veksten av kreftceller i kreft modeller på klonal nivå . Mens
in vivo
kreftcellevekst heterogenitet i xenotransplantater er blitt beskrevet, har det ennå skal måles. Her testet vi en tilnærming til å kvantifisere klonal vekst heterogenitet av kreftceller i subkutane xenograft musemodeller. Ved hjelp av en high-throughput sekvenseringsmetode, vi fulgte skjebnen
in vitro Hotell og
i viv
o av ti tusen HCT-116 celler individuelt merket med en unik strekkode levert av lentiviral transduksjon. Mens veksten
in vitro
var mindre homogen enn forventet, vi fortsatt finne at 95% av den endelige celler avledet fra 80% av de opprinnelige cellene. I xenotransplantater, men 95% av de hentede strekkode-celler stammer fra bare 6% av opprinnelig injiserte celler, en effekt som vi begrepet «klonale dominans». Vi observerte denne klonal dominans i ytterligere to xenograft modeller (MDA-MB-468 og A2780
cis) og i to forskjellige vertsstammer (NSG og Nude). Ved nøyaktig og reproduserbart kvantifisere klonal kreft celle vekst
in vivo
, finner vi at en liten del av kloner står for de aller fleste av de etterkommer celler, selv med HCT-116, en cellelinje rapportert å mangle en svulst -initiating rommet. Den stokastiske
in vivo
utvelgelsesprosess vi beskrive har viktige implikasjoner for feltene
in vivo
shRNA screening og kreft initiere celler
Citation. Nolan-Stevaux O, Tedesco D, Ragan S, Makhanov M, Chenchik A, Ruefli-Brasse A, et al. (2013) Måling av kreft celle vekst heterogenitet gjennom Lentiviral Barcoding Identifiserer Klonal Dominans som en karakteristikk av
In Vivo
Tumor engraftment. PLoS ONE 8 (6): e67316. doi: 10,1371 /journal.pone.0067316
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 05.02.2013; Godkjent: 16 mai 2013; Publisert: 26 juni 2013
Copyright: © 2013 Nolan-Stevaux et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Cellecta, Inc. var en leverandør av lentiviral shRNA bibliotek for denne studien og er arbeidsgiver for Donato Tedesco, Mikhail Makhanov og Alex Chenchik. Olivier Nolan-Stevaux, Seamus Ragan, Astrid Ruefli-Brasse, Kim Quon og Paul D. Kassner er ansatt i Amgen. Denne studien ble finansiert av Amgen Inc. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
I de senere årene, xenograft musemodeller av kreft har blitt brukt til å undersøke grunnleggende spørsmål i tumorbiologi så forskjellige som eksistensen av kreft initiere celler eller muligheten for å identifisere nye kreft målgener ved hjelp av
in vivo
shRNA frafall screening tilnærminger. I begge felter er imidlertid relativt dårlig forståelse av veksten av dynamisk xenograft-modeller forårsaket forvirring.
Først resultater fra seriefortynning eksperimenter, hvor meget lavt antall kreftceller injisert subkutant i mus har blitt brukt for å understøtte [1], [2] eller avkrefte [3] eksistensen av sjeldne kreftceller initiere inne heterogene bassenger av kreftceller i faste tumorer [4]. Imidlertid, kreftceller i tumorer ikke eksisterer i seg selv, men er omgitt av andre kreftceller. Hvis således et par kreftceller injiseres i en mus og ikke klarer å vokse, kan den reflektere deres mangel på kreft initiere potensial; eller mer prosaisk, det faktum at de ikke var i et optimalt miljø, omgitt av andre kreftceller (tumor Starte eller ikke). Sporing oppførselen til de antatte kreft initiere celler omgitt av antatte ikke-kreft initiere celler vil gi sårt tiltrengt klarhet.
For det andre metoder som bruker sammenslåtte biblioteker av lentiviral vektorer som koder hundrevis av shRNA triggere har vært banebrytende for å identifisere potensielle roman kreftfremmende gener
in vivo product: [5], [6]. Men mens
in vitro
samlet shRNA rullegardiner (for et nylig eksempel, se [7]), og
in vivo
samlet shRNA berikelse skjermer for å identifisere kreft-undertrykkere eller vekst hemmende mekanismer har vært vellykket [8], [9],
in vivo
shRNA rullegardiner har ikke vært mye kopiert. Også her ville en bedre forståelse av veksten heterogenitet i xenograft-modeller bidra til å tolke og å forutsi resultatene fra slike screening tilnærminger. Bemerkelsesverdig, mens romlig fenotypiske heterogenitet er dokumentert i xenograft kreft modeller [10], [11], klonal kreft celle vekst heterogenitet i xenograft modeller har aldri blitt målt.
Her har vi brukt en metode for lentiviral strekkode tagging nøyaktig og samtidig måle veksten karakteristikkene av tusenvis av individuelle kreftceller inne i en pool av umerkede kreftceller dyrket
in vitro
eller injisert subkutant
in vivo
i sterkt immunmangelfull mus. Våre resultater viser den bemerkelsesverdige heterogene veksten av kreftceller i flere xenograft-modeller, hvorved små antall av individuelle kreftcellekloner overtar en opprinnelig jevnt fordelt og heterogen cellepopulasjon, en effekt som vi har kalt «klonale dominans». Som et resultat av våre observasjoner, foreslår vi en ny klonal celle sporing metode for å omgå konfunderende effekt av klonal dominans i sammenheng med sammenslåtte
in vivo
shRNA rullegardiner. Vi anbefaler også bruk av denne metoden for å måle bidraget fra antatte kreft initiere celler sub-populasjoner, ikke i isolasjon, men i løpet av en heterogen kreftcellepopulasjon.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen og mus Strain
mus ble ivaretatt i henhold til
guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, 8
th
Edition fra National Institute of Health. Dyrene ble plassert på et anlegg internasjonalt akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC), i ventilerte mikro-isolator boliger. Dyr hadde
ad libitum
tilgang på fôr og vann via automatisk vanningssystem. Dyrene ble holdt på en 12 timers: 12 timers lys: mørkesyklus, i rommene ved 22 ° C og 45% luftfuktighet. Vår forskningsprotokoll og dyr bolig planen ble godkjent av Amgen South San Francisco Institutional Animal Care og bruk Committee (Amgen South San Francisco IACUC, Protocol # 2011-01108). Åtte uker gammelt NOD /SCID IL2rg mus (NSG) (Jackson Laboratories stamme # 5557) og ti uker gammelt atymiske nakne mus (Charles River stamme nr 490) ble brukt i denne studien.
Lentiviral Library titer Bestemmelse ved FACS
titer av den samlede lentiviral biblioteket ble bestemt direkte i HCT-116 celler ved FACS måling av prosenten av mCherry positive celler fra en seriell fortynning av lentiviral bassenget. Kort sagt ble titreringer av lentiviral bassenget tilsatt til 1,5 x 10
5 HCT-116 celler i vekstmedium (McCoys 5A, 10% FBS) inneholdende DEAE Dextran (MP Biomedicals, katalog # 195133) ved 10 ug /ml. Celler ble utsatt for virus i 16 timer og infeksjon Mediet ble aspirert og byttet ut med komplett vekstmedium uten DEAE Dextran. Cellene ble igjen i kulturen i ytterligere 48-72 timer og ble trypsinert, vasket med Dulbeccos PBS og fiksert i en 2% paraformaldehyd oppløsning. Fikserte celler ble analysert for prosentandelen av mCherry positive celler ved hjelp av FACS (Becton Dickinson LSRII). Den multiplisitet av infeksjon (MOI) og titer, rapportert som transduse enheter pr ml (TU /ml), ble bestemt fra den prosentandel av transduserte celler og volumet av lentiviral lager som brukes. MOI ble først bestemt ved hjelp av ligningen% transduserte celler = 100 * (1-e
– (MOI)) og titer-verdien ble bestemt ved å bruke ligning Titer = [MOI × # celler ved infeksjon] /vol (ml virus) = TU /ml [12] – [15]. For dette viral basseng, 10 ul av virus resulterte i 12,9% mCherry-positive celler og den beregnede titer på 2 x 10
6 TU /ml ble anvendt for å bestemme den passende volum av virus for etterfølgende eksperimenter ved valgt MOI s.
Beregninger av Transduksjon Effektivitet og Antall Lentiviral Setter Per Cell
viruspartikler er forventet å distribuere tilfeldig i individuelle celler og prosentandelen av infiserte celler ved en gitt MOI (hvor MOI = transducing Units /Mobil) kan estimeres ved en Poisson-fordeling hvor den prosent av infiserte celler er lik 100 * (1-e
– (MOI)) (tabell 1). Sannsynligheten for hvilket som helst antall viruspartikler i en gitt celle er således gitt ved den Poisson-ligningen p (v) = (M
ve
-v) /v !, hvor M = MOI og v er antall virons infiserer cellen. Disse formler kan brukes til å beregne titer på en viral basseng i en gitt cellelinje og beregne prosentandelen av celler infisert med en rekke virons (tabell 2).
Lentiviral infeksjon Fremgangsmåte for KE-U6-TET Biblioteket i HCT-116
HCT-116 celler (Colon Cancer Cell line – ATCC # CCL-247) med en dobling tid på 21 timer. ble dyrket i fullstendig vekstmedium [McCoys 5A medium (Life Technologies # 16600-082), 10% Tet System Godkjent FBS (Clontech # 631101), 0,1 mg /ml Normocin (Invivogen # maur-nr-1)]. KE-U6-TET, en lentiviral bibliotek inneholdende 27.500 individuelle Tet-induserbare strekkode shRNA-sekvenser med en titer på 2 x 10
6 Transduksjon enheter (TU) /ml ble brukt i forbindelse med 10 ug /ml DEAE Dextran (MP Biomedicals # 195133) for å oppnå en (MOI) på 0,1, hvor sannsynligheten for å infisere en celle med mer enn én partikkel lentiviral er beregnet til å være mindre enn 5% (tabell 2) [15]. I korthet, 3 x 10
6 HCT-116-celler ble resuspendert i 8,5 ml komplett vekstmedium supplert med DEAE Dextran (10 ug /ml) og transdusert med 150 ul KE-U6-TET bibliotek, og inkubert i 16 timer, noe som resulterer i en celle befolkning på 3 × 10
6 celler som inneholder ~ 3 × 10
5 celler infisert med et enkelt lentivirus og bærer en individuell strekkode.
Lentiviral Infeksjon Prosedyre for Luciferase bibliotek i HCT-116, MDA-MB-468 og A2870
cis
En lentiviral bibliotek som inneholder 27 nøytrale Renilla
luciferase
shRNAs sekvenser forbundet med 2% av strekkoder som finnes i biblioteket var brukes på en MOI på 0,18, 0,17 og 0,15, henholdsvis i HCT-116, MDA-MB-468 (Breast Cancer Cell line – ATCC # HTB-132) og A2780
cis plakater (Cisplatin Resistant Ovarian Cancer Cell line – Sigma-Aldrich # 93112517) celler. Den projiserte prosentandelen av infiserte celler med mer enn en lentiviral partikkel er beregnet til å være mindre enn 10% på følgende måneder (tabell 2). I korthet, 3 x 10
6-celler ble resuspendert i 8,5 ml vekstmedium supplert med polybren (5 ug /ml), transdusert med lentiviral bibliotek, og inkubert i 16 timer, noe som resulterer i en cellepopulasjon av 3 x 10
6 celler som inneholder ~ 5 × 10
5 transduced celler, ~ 90% av disse er anslått til å være infisert med et enkelt lentivirus og bærer en enkelt strekkode (tabell 2).
In vitro
Experiment
16 timer etter transduksjon med KE-U6-TET bibliotek, prøver av 10
5 HCT-116 celler som inneholder ~ 10
4 individuelt merkede celler ble sådd i triplikat i T175 cellekulturflasker og dyrket kontinuerlig i 8 dager i fullstendig vekstmedium, med media etterfylling etter 2-3 dager. For hver
in vitro
replikere, ble alle cellene fra hver T175 kolbe brukes ved høsting på dag 8 for genomisk DNA.
NSG Xenotransplantat Experiment
16 h post- transduksjon med KE-U6-TET bibliotek, prøver av 10
5 HCT-116 celler som inneholder ~ 10
4 individuelt merkede celler ble blandet med 3 × 10
6 ikke-omformet HCT-116 celler og resuspendert i 200 ul 01:01 PBS: Matrigel løsning (BD Biovitenskap # 356235) før subkutan injeksjon i 8-ukers gamle kvinnelige NSG mus (lager # 005557, Jackson laboratorier). Hver xenograft ble tillatt å vokse i 12 dager før den resulterende subkutan tumor nådde en størrelse på rundt 500 mm
3. På dette punktet, ble svulster høstet for genomisk DNA.
Nude xenograft Eksperimenter
16 timer etter transduksjon med Luciferase bibliotek, 3 × 10
6 celler (HCT-116, MDA-MB-468 eller A2780
cis) ble resuspendert i 200 pl PBS 01:01: Matrigel-løsning (BD Bioscience # 356235) før subkutan injeksjon av 10 uker gamle hunn naken mus (stock # 490, Charles River Laboratories). HCT-116 og A2780
cis xenograft fikk vokse i 14 dager og MDA-MB-468 i 24 dager inntil det resulterende subkutan tumor nådde en størrelse på ca. 500 mm
3. På dette punktet, ble svulster høstet for genomisk DNA.
Tet undertrykkelse av shRNA uttrykk i fravær av Doxycycline og induksjon med Doxycycline
Effektiviteten av TET repressor element i vektoren ble vurdert i løpet av en 15 dagers eksperiment. Tre uavhengige infeksjoner av 9 x 10
7 HCT116-celler i vekstmedium (McCoys 5A, 10% FBS) inneholdende DEAE Dextran (MP Biomedicals, katalog # 195133) ved 10 ug /ml ble utført med 27,5 k shRNA bibliotek ved en MOI = 0,3 i Corning Cell Stack 10 skip (katalog # 3271). For å maksimere fremstilling av biblioteket, ble hver innført i shRNA ~1000 uavhengige celler. Etter 24 timer ble media infeksjon aspirert og erstattet med komplett vekstmedium med 2 ug /ml puromycin (InvivoGen, katalog # maur-pr-5) for å begynne seleksjon for infiserte celler. 72 timer etter transduksjon, ble en celle pellet av ~ 9 × 10
7 celler samlet for referanse for hver infeksjon tre eksemplarer (dag 0-prøven). 9 × 10
7 celler ble re-seeded og vedlikeholdes i kultur med komplett media med 2 mg /ml puromycin. Celler ble passert ved 3 dagers intervaller ut til 15 dager, reseeding 9 x 10
7-celler og opprettholde selektivt trykk med puromycin for varigheten av forsøket. Celle pellets for tredoble prøver fra dag 0 og 15 ble sendt til sekvensering av DNA-strekkoder av high-throughput sekvensering. Celler som shRNA uttrykk ble indusert ble behandlet etter re-seeding 9 × 10
7 celler på dag 0 med Doxycycline (Sigma-Aldrich, katalog # D-9891) på 0,5 mikrogram /ml i 15 dager.
Recovery og Kvantifisering av strekkoder
prober ble preparert for høy gjennomstrømming sekvense på Illumina HiSeq2000 følgende Cellecta protokoll (https://www.cellecta.com/resources/protocols). Settet med strekkoder som brukes til bygging av biblioteket besto av 27.500 18-nukleotid individuelle lange strekkoder, perfekt balansert i AT /GC og purin /pyrimidin, utformet ved hjelp av en proprietær Cellecta algoritme. Minimum Hamming avstand mellom strekkoder i settet er 4, så opp til 3 mutasjoner i en 18-nukleotidsekvens kan oppdages og ødelagte strekkoder avvist, og gir riktig nivå av beskyttelse for den aktuelle nøyaktigheten av Illumina sekvenseringsteknologi. Strekkode-ID-nummer ble kodet på strekkoden sekvens ved hjelp av kvaternære tallsystemet (A-0, T-1, G-2, C-3), slik at justeringsprosedyrer for strekkode-dekonvolvering var ikke nødvendig. Bruke Cellecta omvendelse algoritme, ble strekkode ID-numre hentet fra hvert riktig strekkode og overflod av hver strekkode i sekvensert prøven måles. Med denne fremgangsmåten, er kompleksiteten i beregningen ikke er avhengig av kompleksiteten til biblioteket. Kompleksiteten er O (n) var n er antall leser i sekvensert sonder. FASTQ og qseq filer fra Illumina HiSeq2000 maskinen ble brukt i analysen.
Clone Størrelse Estimering
For hver prøve, antall strekkode teller tilsvarende én transdusert celle ble beregnet basert på total antall strekkode tellinger i prøven og totale antall transduserte celler i prøven (sistnevnte beregnet i henhold til genomisk DNA, og utvinning transduksjon MOI, og bekreftet ved PCR-proben utbytte). For å estimere størrelsen på hver klon i transduced cellepopulasjon (antall celler som bærer samme strekkode), strektellinger ble deretter normalisert til den beregnede encellede strekkode teller.
Resultater
Måle kloneutvinningsgrad
in vivo
for å spore kloner som stammer fra enkeltceller i en kreftcelle befolkning, er infisert vi HCT-116 kolorektal kreft celler med lentiviral bibliotek som inneholder 27.500 uavhengig induserbar shRNA sekvenser, hver forbundet med en individuell 18 nucleotide strekkode. Vi infisert 3 x 10
6 HCT-116-celler ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 0,1. Under disse smitteforhold, Poisson fordelingen analyse spår et minimalt antall dual infeksjons hendelser ( 5% av omsatte celler) [15] (tabell 2). Transduksjon ga ~3 × 10
5 individuelt strekkode celler (tabell 1). Tre sett med 10
4 HCT-116 strekkode celler (10
5 celler totalt gitt en MOI på 0,1) ble dyrket i kultur
in vitro
for 8 dager eller ca 9 populasjonsdoblinger. Genomisk DNA fra de tre bassenger av celler dyrket
in vitro
ble utsatt for strekkode high-throughput sekvensering og størrelsen (celletall) for hver detektert klon i populasjonen transduserte ble beregnet på grunnlag av det antall ganger hver strek -koden punkt ble hentet (fig. 1).
A lentiviral bibliotek inneholdende 27.500 unike strekkoder ble anvendt til å transdusere HCT-116-celler ved en MOI på 0,1. Bassenger av 10
5 celler, tilsvarende 10
4 individuelt merkede celler ble enten blandet med 3 × 10
6 celler og implantert subkutant i NSG mus eller dyrket i kultur
in vitro
. Cellene ble høstet etter 9 dager og svulst fjernet etter 12 dager, og total DNA-preparater fra celler eller svulster ble utsatt for strekkoden henting prosedyren.
Parallelt tre sett med 10
4 strek HCT-116-celler (10
5 totalt antall celler gitt en MOI på 0,1) fra den samme opprinnelige virale transduksjon hendelse ble samlet 16 timer etter transduksjon og hver for seg blandet med 3 x 10
6 uinfiserte HCT-116-celler og fortynnet i 50% Matrigel, forut for subkutan injeksjon i flanken av tre alvorlig immunmangelfull hunn NSG mus. Hver xenograft ble tillatt å vokse i 12 dager før den resulterende subkutan tumor nådde en størrelse på rundt 500 mm
3. Genomisk DNA fra de tre xenografttumorer ble utsatt for de samme strekkode utvinning og klone størrelse estimeringsprosedyrer som
in vitro
prøver (Fig. 1).
in vivo
klon gjenfinning hastigheten ble beregnet som forholdet mellom det midlere antall av strekkode- kloner som er identifisert i de tre xenografttumorer og det midlere antall av strekkode–kloner som er identifisert i de tre cellepopulasjoner dyrket
in vitro
, uavhengig av klonet størrelse (fig. 1). Som vist i tabell 3, den observerte klone henting hastigheten var nesten 60% og antall kloner identifisert i
in vitro
innstilling i hvert replikat var svært nær den anslåtte verdien av 10
4 kloner. Av notatet, når en cellesuspensjon som inneholder Matrigel injiseres subkutant, en liten mengde (~ 10%) av den injiserte væske siver ut av injeksjonsstedet, sto for en brøkdel av den tapte strekkoder i
in vivo
setting.
in vivo
«Klonal dominans» Inside HCT-116 xenografter
For å vurdere og sammenligne hvordan strekkode cellene deles
in vitro
og
in vivo
, analyserte vi fordelingen av sine strekkoder etter hvor ofte de ble hentet av HTS. Den fulle datasett av kloner og strekkode teller er tilgjengelig (tabell S1)
I en første diagrammet, vi analyserte klonal fordeling av celler dyrket
in vitro
. Vi plottet antall uavhengige kloner (fig. 2A – blå søyler) eller den totale samlede antall celler (figur 2A -. oransje linjer) for hver klon størrelseskategori over X-aksen. For eksempel
in vitro
, var det 2,649 uavhengige kloner av en størrelse som varierer mellom 512-1023 celler, noe som indikerer at disse klonene i «512-1023» celler kategorien må ha gjennomgått et gjennomsnitt på 8 populasjonsdoblinger ( fig 2A -. blå linjen verdi for X-aksen kategorien «512-1023»). Disse 2,649 kloner bidro totalt 1,017,216 kommer strekkode celler på
in vitro
kultur i 8 dager (figur 2A -. Oransje linjen verdi for «512-1023 «X-aksen kategori). Som bevis på at
in vitro
klonal vekst er stort sett homogen, 95% av de etterkommer strekkode celler som finnes etter 8 dager med
in vitro
kultur ble avledet fra 80% av opprinnelig merket kloner og var finnes klone kategoriene «128-4095» indikerer minst 7 befolknings divisjoner.
for hver graf, antall uavhengige kloner (blå søyler) eller det totale samlede antall celler (oransje søyler) er plottet for hver klone størrelseskategori over X-aksen. (A) Fordeling av HCT-116 strekkoder
in vitro
: 80% av strekkoder (kloner) ble identifisert i kategoriene «128-255» til «2048-4095», som indikerer at 80% av cellene deles mellom 7 og 12 ganger; 95% av cellene ble identifisert i kategoriene «128-255» til «2048-4095», som indikerer at 95% av cellene hører til kloner avledet fra 80% av opprinnelig transduserte celler, som fordelt mellom 7 og 12 ganger. Skala for antall celler ble justert 500 ganger for å tillate side ved side sammenligninger av klon tall og celle tall. (B) Fordeling av HCT-116 strekkoder
i
vivo
: 75% av strekkoder er funnet i kategoriene «mangler» til «2-3», som indikerer at de enten ikke overleve i det hele tatt, ikke dele, eller deles ikke mer enn en gang og representerte bare 1% av de hentede merkede cellene. Det ble imidlertid bare 6% av strekkoder som ligger i kategoriene «64-127» til «16384-32767», som indikerer at de delt mellom 6 og 14 ganger; 95% av cellene påløpt i kategoriene «64-127» til «16384-32767», som indikerer at 95% av de merkede cellene er avledet fra 6% av opprinnelig strek kloner som delte mest. Skala for antall celler ble justert 25 ganger for å tillate side ved side sammenligninger av klone tall og celle tall.
I et annet diagram, vi analyserte klonal fordeling av celler dyrket
in vivo
: vi igjen plottet antallet uavhengige kloner (figur 2B – blå søyler.) eller den totale samlede antall celler (fig 2B – oransje søyler.) for hver klon størrelseskategori over X-aksen.
in vivo
distribusjoner ser dramatisk forskjellig fra
in vitro
distribusjoner.
In vivo
, 75% av kloner gruppert i «Missing-3 «kategorier, som viser at 75% av cellene i utgangspunktet injisert
in vivo
gikk færre enn to celledelinger (fig. 2B – blå søyler – «mangler» eller «1» eller «2-3» kategorier). Som bekrefter at disse klonene ikke vokste
in vivo
, disse klonene utgjorde bare 1% av den totale samlede antall celler innenfor den merkede cellepopulasjon identifisert av HTS i den resulterende tumoren. På den annen side, 6% av de injiserte cellene var i stand til å dele mer enn fem ganger for å generere kloner med minst 64 celler (Fig 2B -. Blå søylene merket 6%). Bemerkelsesverdig, disse klonene utgjorde 95% av det totale samlede antall celler i den merkede cellepopulasjon (Fig 2B -. Oransje linjer markert 95%), noe som viser meget sterk vekst heterogenitet
in vivo
, hvor de to mest klink gjenvunnet kloner alene (av anslagsvis 10.000) gjennomgikk 14 populasjonsdoblinger og genererte en forbløffende 7,5% av de totale celle tagger utvinnes av HTS i xenografter. (fig 2B -. kloner og celler i kategorien «16384-32767»)
Vi kaller dette fenomenet «klonal dominans», der en liten brøkdel av cellene implantert
in vivo
dele langt mer enn de aller fleste andre kloner og bidra overveldende til kommer cellepopulasjon. Legg merke til at tidligere studier konkluderte med at HCT-116 cellelinjen ikke inneholder en stamcelle eller tumor-initiere sub-populasjon (se diskusjon).
Eksklusiv en effekt av den kodede shRNA
in vitro
og
in vivo
shRNA kodet i lentiviruses er klonet nedstrøms U6-TET promoter og er regulert av en Tet-repressor kodet i lentivirus, for å sikre undertrykkelse av shRNA hårnål uttrykk i fravær av Doxycycline. Således, for formålet med dette forsøk, innholdet av lentivirale vektorer ble bare brukt som en bar-kodesystem av de infiserte cellene og er ikke forutsies å interferere med cellevekst. For å sikre at det kodede shRNA ble ikke påvirker cellevekst, vokste vi cellene i et medium inneholdende Tet-system godkjent FBS, som er utformet for å minimalisere de-undertrykkelse av promotorene i fravær av doxycycline. Imidlertid, for å bekrefte eksperimentelt at uforutsett shRNA induksjon ikke påvirker strekkoden fordelingen i fravær av doxycycline, vi også sammenlignet fordelingen av strekkoder som finnes i den KE-U6-TET bibliotek følgende HCT-116 transduksjon ved dag 0 og dag 15 etter infeksjon. For dette eksperimentet, omformet vi HCT-116 celler med KE-U6-TET lentiviral biblioteket på en MOI på 0,3 og innsamlede cellene rett etter infeksjon (dag 0) og etter 15 dager
in vitro
vekst i fravær av doxycycline (dag 15) (fig. 3A). Vi har observert en meget tett korrelasjon (r = 0,99) mellom antall lesninger oppnådd for hver shRNA strekkode på dag 0 og dag 15 (fig. 3B). Deretter evalueres om de to shRNA fordelingene ved dag 0 (fig. S1A), og dag 15 (fig. S1B) var signifikant forskjellige fra hverandre ved hjelp av en ikke-parametrisk Kruskal-Wallis Rank Sum Test og oppnådde en P-verdi på 0,972, indikerer ingen statistisk forskjell mellom rang rekkefølgen av forskjellig shRNA i shRNA befolkningen på dag 0 og dag 15 (fig. S1D). Likeledes var det ingen endring i den totale fordeling av shRNA mellom de to tidspunktene, som etablert av en t-test p-verdi på 0,99 (Fig. S1D). Disse resultatene tyder på at i fravær av doxycycline ble U6-TET-drevet shRNA hårnåler ikke påvirke veksten og fordelinger av strekkoder i den transduserte HCT-116 cellepopulasjon
in vitro
, og var derfor ikke å påvirke fordelingen i xenografter, forutsatt at hårnåler forble ikke-indusert
in vivo
.
(A) en lentiviral bibliotek som inneholder 27.500 unike strekkoder ble brukt til å omsette HCT-116 celler ved en MOI på 0,3 . Etter 72 timer av puromycin utvalg, cellene ble kontinuerlig passert i 15 dager i fravær av doxycycline. Dag 0 og dag 15 celle aliquoter ble erholdt og total DNA fra begge tidspunkter ble underkastet strekkoden high-throughput sekvense gjenfinning prosedyre. (B) Korrelasjon tomt for Day 15 måling mot Dag 0. shRNA strekkode leser for alle prøver fra alle tidspunkter ble først normalisert til 2 × 10
7 leser. Verdier for triplikate prøver ble i gjennomsnitt. På dag 15, er sterk undertrykkelse av shRNA uttrykk i fravær av Doxycycline tydelig i korrelasjon med Dag 0 referanse. Plot av log10 bety normalisert leser for Dag 0 mot Dag 15 (Pearson korrelasjon: R = 0,99).
For å modellere hva som ville skje hvis de hårnåler ble de-undertrykt i en kreftcelle befolkning, vi også sammenlignet shRNA strekkode fordelingen i omsatte HCT-116 celler på dag 0 og på dag 15 etter
in vitro
vekst i nærvær av Doxycycline (dag 15 – Dox – fig. S1C). Under disse betingelser, mens den totale shRNA populasjonen fordeling ikke ble signifikant påvirket (p-verdi av en t-test mellom de to populasjonene var 0,99), ble rang-rekkefølgen for de forskjellige shRNA strekkoder sterkt påvirket (p-verdien for et ikke -parametric Kruskal-Wallis rang-orden test var 1,75 × 10
-8 – fig. S1D). Vi deretter analysert fordelingen av strekkoder mest rikelig identifisert i tre
in vivo
xenograft gjentak (identifisert som en del av de øverste 6% av kloner som bidrar til 95% av de hentede koder -. Se figur 2) for å fjerne to mulige, men trivielle forklaringer på klonal dominans vi observert: (i) som av en innledende strekkode representasjon skjevhet og (ii) den mulige effekten av utette hårnåler som ville ha dratt noen kloner over andre
in vivo
. Først må vi ikke observere en strekkode distribusjon skjevhet som ville ha favorisert klonene som ble hentet
in vivo
. De 4.109 rikeste shRNA strekkoder hentet i tre
in vivo
replikater ble distribuert over hele shRNA befolkningen distribusjon og kan ikke gjøre rede for klonal dominans effekten vi observerer (fig. 4A). For det andre, hvis lekk uttrykk for shRNA hårnåler
in vivo
var en faktor i klonal dominans, ville vi forvente at de kloner som ble valgt
in vivo
ville kode shRNA hårnåler som favoriserer HCT-116 vekst, eller i det minste, er ikke giftig for HCT-116. Dette var ikke tilfelle: et stort antall av de mest tallrike strekkoder som ble gjenopprettet
in vivo plakater (farget i rødt i figur 4B) faktisk kode shRNA hårnåler som er giftige for HCT-116
in vitro
, da de faktisk klynge på venstre side av shRNA fordelingskurve, noe som indikerer en veksthemmende virkning, etter at
in vitro
induksjon av doksycyklin i 15 dager (fig. 4B), sterkt tyder på at disse shRNA hårnåler ble ikke de-undertrykket i løpet av veksten av svulsten innpodet. Hadde disse giftige shRNA hårnåler vært lekk eller de-undertrykt, ville de ha hindret veksten av kloner som kodet dem og deres strekkode ville trolig ikke har vært blant de mest tallrike shRNA strekkoder hentet
in vivo
.
(A) fordeling av 4.109 unike strekkoder hentet mest rikelig fra de tre xenografttumorer (markert med røde vertikale linjer) over hele shRNA befolkningen fordeling i shRNA biblioteket. (B) Påvisning av en stor andel av de mest tallrike strekkoder fra de tre xenografttumorer (markert med rødt) i shRNA befolkningen mest giftig for HCT-116 på Doxycycline induksjon
in vitro
i 15 dager (målt ved en negativ log2 forholdet mellom middel lese teller individuelle shRNA på dag 15 etter Doxycycline å bety lese tellinger på dag 0).
Klonal dominans er observert i andre xenograft modeller, og i en annen mus Host
for ytterligere å validere våre observasjoner med flere cellelinjer og med en annen vert belastning, vi omformet 3 × 10
6 HCT-116, MDA-MB-468 og A2780
cis celler i to eksemplarer i en MOI av
