Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en dødelig sykdom, og nye terapeutiske mål er sterkt behov. Vi har tidligere identifisert DNA forsterkning på 7q21-q22 i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Nå, etter høy oppløsning genomisk profilering av menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og humane tumorer (innpodet i immunodeficient mus for å berike kreft epitel fraksjon), definerer vi en 325 Kb minimal amplicon spenner
SMURF1
, en E3 ubiquitin ligase og kjente negativ regulator av transformerende vekstfaktor β (TGFp) veksthemmende signalering.
SMURF1
forsterkning ble bekreftet i primære humane bukspyttkjertel kreft ved fluorescens
in situ
hybridisering (FISH), hvor 4 av 95 tilfeller (4,2%) viste forsterkning. Ved RNA interferens (RNAi), knockdown av SMURF1 i en human bukspyttkjertelkreft tråd med fokus forsterkning (ASPC-1) endret ikke cellevekst, men førte til redusert celle invasjon og forankringsuavhengig vekst. Interessant nok denne effekten ble ikke formidlet gjennom endret TGFfi signalering, undersøkt ved transkripsjonen reporter. Til slutt, overekspresjon av SMURF1 (men ikke en katalytisk mutant) førte til tap av kontakt-inhibering i NIH-3T3-mus embryo fibroblast celler. Sammen utgjør disse funnene identifisere
SMURF1
som en forsterket onkogen kjører flere tumorigene fenotyper i kreft i bukspyttkjertelen, og gi en ny druggable mål for molekylært rettet terapi
Citation. Kwei KA, Shain AH, Bair R, Montgomery K, Karikari CA, van de Rijn M, et al. (2011)
SMURF1
Amplification Fremmer Invasivitet i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 6 (8): e23924. doi: 10,1371 /journal.pone.0023924
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 14 desember 2010; Godkjent: 01.08.2011; Publisert: 22 august 2011
Copyright: © 2011 Kwei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH: CA112016 (JRP), CA09151 (KAK), GI Cancer SPORE CA62924 (AM); NIH /NCRR CTSA gi UL1 RR025744 til Stanford Spectrum; og Lustgarten Foundation (J.R.P.). M.D.B. ble støttet delvis av en Biotechnology utlandet associateship fra Institutt for bioteknologi, Ministry of Science and Technology, Government of India. Forfatterne også takke familien til Margaret Lee og Sol Goldman kreft i bukspyttkjertelen Research Center for å støtte xenografting innsats ved Johns Hopkins. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
bukspyttkjertel~~POS=TRUNC duktalt adenokarsinom (heretter, kreft i bukspyttkjertelen) er nesten alltid dødelig, med en fem års overlevelse mindre enn 5% [1]. Det er ofte spres ved diagnose, og kan metastasere mye. Tidlig oppdagelse kan forbedre overlevelse, men kirurgisk fjerning er sjelden kurativ [2]. Kreft i bukspyttkjertelen er også i stor grad motstandsdyktig mot konvensjonell kjemoterapi. Derfor er nye behandlingsformer presserende behov. I spesielt, vil det være viktig å oppdage og validere nye mål for molekylært styrt terapi.
De molekylærgenetikk av kreft i bukspyttkjertelen er delvis kjent [3], [4]. Somatiske aktive mutasjoner av
KRAS plakater (noen ganger oppstår med genamplifisering) finnes i 90% av bukspyttkjertel kreft. Også vanlige er å inaktivere mutasjoner /sletting av tumor suppressors
CDKN2A plakater ( 95% av kreft),
TP53 product: (50-75%), og
SMAD4 plakater (også kjent som
DPC4
) (55%), en effektor av TGFp-mediert veksthemming. Andre genmutasjoner, hver forekommer i mindre enn 5% av kreft, støt disse og andre kjernekreftsignalveier [5].
Genomisk profilering undersøkelser, etter matrisebaserte komparativ genomisk hybridisering (matrise CGH), har begynt å katalogisere DNA presiseringer og slettinger, påpeke og avslørende roman kreft i bukspyttkjertelen gener (f.eks [6], [7]). Blant endret loci, vi og andre tidligere identifisert 7q21-q22 som et område recurrently forsterkes i bukspyttkjertelkreft [8] – [13]. Her begrense vi at locus, og karakteriserer SMURF1 som et onkogen produkt fremme celle invasjon og forankringsuavhengig vekst.
Resultater
SMURF1
er fokalt forsterkes i bukspyttkjertelkreft
Vi har tidligere identifisert gående forsterkning på 7q21-q22 i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, ved hjelp av CGH på cDNA mikromatriser [12]. For ytterligere å avgrense fragment, og finne bosatt onkogen (e), har vi nå gjennomført ytterligere genomisk profilering av en samling av 22 bukspyttkjertelkreft cellelinjer og 58 tidlig-passasje kreft i bukspyttkjertelen xenografter, med høy oppløsning 244K Agilent CGH arrays. Den 7q21-q22 locus ble fokalt amplifisert (svulst /normalforhold 3-fold) i en av 22 (4,5%) cellelinjer (ASPC-1), og i en av 58 (2%) xenografter. Inkludert lavere nivå gevinster (forholdstall 1,3 ganger)., Gevinst /forsterkning spenner 7q21-q22 ble funnet i seks av 22 (27%) cellelinjer, og i 19 av 58 (33%) xenografter
fire prøver (cellelinjen ASPC-1, og tre xenoimplantater) hadde genomiske profiler som var spesielt informative i avgrensning amplikonet grensene innenfor 7q21-q22 (fig. 1A). Den minste felles region av gevinst strakte bare 325 Kb innen cytoband 7q22.1, og inneholdt bare to RefSeq [14] gener,
SMURF1 plakater (SMAD bestemt E3 ubiquitin protein ligase) og
KPNA7 product: ( karyopherin alpha 7). SMURF1 er en kjent hemmer av TGFB signalering (ved å fremme nedbrytning av dens reseptor TGFβRI, og signaliserte mekler SMAD4 [15], [16]), en sti ofte forstyrret i bukspyttkjertelkreft. Gitt en åpenbar tilknytning til bukspyttkjertelen kreftutvikling, fokuserte vi derfor påfølgende innsats på
SMURF1
.
(A) En minimal amplicon er definert av fire kreft i bukspyttkjertelen prøver (ASPC-en og tre xenografter). Starter fra bunnen: chr 7 ideogram; Heatmap av DNA kopiantall (rød indikerer gevinst) for de fire prøvene over 7q21-q22 region (91-101 Mb); Spredningsplott av DNA-kopi nummer log
2 forholdstall over 7q21.3-q22.1 (96-100 Mb), kledde med cghFLasso [34] heter forhold (rød linje); Skjermbilde av den tilsvarende locus fra UCSC genom nettleser. De stiplede linjene brakett 325 Kb minimal fragment, som spenner
SMURF1
. (B)
SMURF1
er overuttrykt når tjente /forsterket. Boksplott viser
th 25, 50
th (median) og 75
th persentil transkripsjonsnivåer (analysert ved Agilent 44K matrisen) for prøver med (rød) eller uten (grå) 7q21-q22 gevinst, for
SMURF1 Hotell og sine nærmeste genet naboer. Note,
KPNA7
var ikke representert på tabellen. *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0,001 (Mann-Whitney U-test). (C) FISH avslører
SMURF1
forsterkning i grunnskolen bukspyttkjertel kreft. Vist er to bukspyttkjertel kreft med
SMURF1
forsterkning (
senter
, og
høyre
), sammen med en ikke-forsterket kontroll (BxPC3 celler,
venstre
).
SMURF1
locus probe (rød); kontroll chr 7 cent (CRP7) probe (grønn).
I samsvar med et onkogen rolle,
SMURF1
transkripsjon (målt ved mikromatriser) var signifikant forhøyet i cellelinjer /xenografter med 7q22 0,1 gevinst /forsterkning (som var flere co-forsterket nabo gener) (fig. 1B). For å evaluere
SMURF1
forsterkning i grunnskolen pankreastumorer, gjennomførte vi også fisk på en vev microarray som inneholder 105 bukspyttkjertelkreft. Fire av 95 (4,2%) evaluerbare tilfeller utstilt
SMURF1
forsterkning (locus /cent ratio 2,5) (figur 1C.), Kan sammenlignes med våre CGH funn for tidlig-passasje xenografter. Vi klarte ikke å finne en passende antistoff og farging forhold til å evaluere SMURF1 uttrykk ved immunhistokjemi.
SMURF1
forsterkning fremmer celle invasjon og forankringsuavhengig vekst
For å vurdere mulig onkogene funksjoner av SMURF1 vi først brukt RNAi til knockdown SMURF1 uttrykk i relevant sammenheng med genamplifisering, ved hjelp ASPC-1 celler. Transfeksjon av fire forskjellige små interfererende RNA (siRNAs), eller en pool av de fire sammen, hvert ført til reduserte SMURF1 protein nivåer (ved Western blot), sammenlignet med en ikke-måls siRNA basseng (Fig. 2A). Knockdown av SMURF1 endret ikke celleproliferasjon, målt ved hjelp av WST-1-analysen (fig. 2B, C), og ved BrdU-inkorporering (fig. 2D), men førte til signifikant redusert celle invasjon gjennom Matrigel, målt etter Boyden kammer assay (fig . 2E). Redusert invasjonen ble sett med hver av de fire siRNAs rettet mot forskjellige
SMURF1
sekvenser, mens veksten av cellene forble uforandret i løpet av (Fig. 2C) samme tidsperiode, en sterk støtte for den spesifikke rollen SMURF1 i invasivitet fenotype.
(A) fire forskjellige sirnas målretting
SMURF1
, og en pool av alle fire, føre til redusert SMURF1 nivåer (ved Western blot) sammenlignet med en ikke-måls kontroll siRNA basseng ). Rest SMURF1 nivåer, her normalisert til GAPDH, er indikert. (B) SMURF1 knockdown (ved hjelp av siRNA pool), reduserer ikke celleproliferasjon /levedyktighet, målt ved WST1 analysen, og gjort i tre eksemplarer (gjennomsnittlig +/- 1SD vist). (C) SMURF1 knockdown ved hjelp av fire ulike sirnas ikke vesentlig endre celleproliferasjon /levedyktighet, målt tre dager etter transfeksjon. Ferdig i tre eksemplarer (gjennomsnitt +/- 1SD vist). (D) SMURF1 knockdown reduserer ikke cellesyklusprogresjon (S-fase), målt ved hjelp av BrdU-inkorporering (1,5 timer og 4 timer puls merking), gjort i triplikat (gjennomsnitt +/- 1 SD vist). (E) SMURF1 knockdown (ved hjelp av siRNA basseng og individuell sirnas) hemmer celle invasjon gjennom Matrigel. Boyden kammer analysen utført i triplikat og høstet tre dager etter transfeksjon (middel +/- 1SD vist); *,
P
0,05 (t-test). (F) SMURF1 knockdown ikke forbedre TGFp sti-mediert transkripsjon. ASPC-1 celler ble ko-transfektert med sirnas og p3TP-Lux reporter, gjort i tre eksemplarer, og firefly /Renilla luciferase forholdstall vist (gjennomsnitt +/- 1SD vist). Panc1 celler (med villtype
SMAD4
) +/- TGFB tjene som en positiv kontroll.
Gitt sin kjente, antagonistiske funksjon i TGFfi vei, vi også søkt å evaluere effekten av SMURF1 knockdown på TGFfi signalering, ved hjelp av en TGFfi responsive transkripsjonen reporter (p3TP-Lux) [17]. Knockdown av SMURF1 ikke forbedre TGFp sti-mediert transkripsjon i ASPC-1-celler (fig. 2F). Av notatet, men ASPC-1 celler (som de fleste bukspyttkjertel kreft) havn en mutert
SMAD4
, her SMAD4 (R100T) [18], karakterisert som skal inaktivere [19], [20]. Derfor ASPC-1 celler er trolig ute av stand til en TGFB sti transkripsjonen respons. Mer generelt, disse funnene tyder på at den viktigste effekten (e) av
SMURF1
forsterkning /overekspresjon er sannsynligvis mediert gjennom trasé forskjellige fra TGFB signalering.
For å vurdere mer langsiktige fenotyper, vi også stabilt transfektert en kort hårnål RNA (shRNA) målretting
SMURF1
. Stabil knockdown av SMURF1 i ASPC-1-celler, bekreftet ved Western blot (Fig. 3A), signifikant redusert forankringsuavhengig vekst (soft-agar-kolonier), sammenlignet med en ikke-målsøkende shRNA kontroll (Fig. 3B).
(A) en stabilt omformet shRNA targeting SMURF1 fører til redusert SMURF1 nivåer (ved hjelp av Western blot) sammenlignet med en ikke-måls kontroll shRNA. Rest SMURF1 nivåer, her normalisert til GAPDH, er indikert. (B) Stabil SMURF1 knockdown reduserer forankringsuavhengig vekst (dvs. myk agar kolonier). Assay utføres i triplikat (gjennomsnitt +/- 1SD vist); *,
P
. 0,05 (t-test)
Vi har også søkt å evaluere effekten av siRNA knockdown i andre bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Vi valgte to cellelinjer, BxPC-3 celler som (som ASPC-1 celler og mest pankreastumorer) har mutert
SMAD4 plakater (her ved homozygot delesjon) [21], og Hs700T celler som er villtype for
SMAD4
og har et intakt TGFp vekst-inhibitorisk veien (fig. S1). Spesielt, ingen av disse linjene havner sentrale forsterkning av
SMURF1 plakater (ASPC-1-celler er de eneste etablerte linje med fokal amplifikasjon), og heller forhøyede SMURF1 proteinnivåer (Fig. 4A). Knockdown av SMURF1 (validert ved Western blot, Fig. 4B) førte til moderat redusert celleproliferasjon i BxPC-3-celler (figur 4C.), Og enda mere i TGFp-veksthemmende sti-intakt Hs700T-celler (figur 4D.). SMURF1 knockdown også resulterte i redusert celle invasjon i BxPC-3-celler (fig. 4E), skjønt ikke vesentlig så. Men gitt at
SMURF1
verken fokalt forsterkes eller overexpressed i disse linjene, en enkel forklaring på de uharmoniske fenotyper (sammenlignet med ASPC-1) er at SMURF1 ikke kunne fungere som en onkogen driver i disse celle sammenhenger.
(A) Western blot analyse av endogene SMURF1 protein nivåer i et panel av bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Merk at SMURF1 er sterkt uttrykt bare i 7q22.1-forsterket ASPC-en cellelinje. To forskjellige eksponeringer av SMURF1 blot er vist; GAPDH tjener som en lasting kontroll. (B) Western blot verifikasjon av SMURF1 knockdown (ved SMURF1 målretting siRNA basseng, sammenlignet med ikke-måls kontroll siRNA pool) i BxPC-3 og Hs700T celler. (C) Celleproliferasjon /levedyktighet analysert (av WST-1) i BxPC-3-celler etter SMURF1 siRNA-mediert knockdown (i forhold til ikke-målsøkende kontroll). Assay utføres i triplikat (gjennomsnitt +/- 1SD vist); *,
P
0,05 (t-test). (D) Celleproliferasjon /levedyktighet analysert i Hs700T-celler, som ovenfor. (E) Celle invasjon analysert (etter Boyden kammer) i BxPC-3-celler etter SMURF1 knockdown (sammenlignet med ikke-målsøkende kontroll). Assay utføres i triplikat (gjennomsnitt +/- 1SD vist). Note, redusert spredning observert med SMURF1 knockdown i Hs700T celler utelukket en analyse av celle invasjon (der invaderte celle tall på 72 timer påvirkes ved å doble ganger).
Til slutt, i komplementære, overekspresjon studier, vi transfektert
SMURF1
cDNA (uttrykt fra en CMV promoter) til NIH-3T3 musefibroblastere. Overekspresjon av SMURF1, bekreftet ved Western blot (Fig. 5A), førte til en betydelig tap av kontakt-inhibering (dvs. øket foci), sammenlignet med en vektor kontroll (Fig. 5B). Spesielt, transfeksjon av en katalytisk-inaktive mutant av SMURF1 (C699A) [22] ikke redusere kontaktinhibering (Fig. 4B), som indikerer at det onkogene aktiviteten er avhengig av E3 ubiquitin protein ligase aktivitet av SMURF1.
(A) Transfeksjon av SMURF1 cDNA, eller en katalytisk mutant av SMURF1 (C699A) (SMURF1
m), fører til overekspresjon (ved Western blot) sammenlignet med tom vektorkontroll. SMURF1 overekspresjon nivåer, normalisert til GAPDH, indikeres. (B) SMURF1 (men ikke SMURF1
m) overekspresjon i NIH-3T3-celler fører til tap av kontakt-inhibering (dvs. øket foci dannelse). Analyser utført in triplo (gjennomsnitt +/- 1SD vist); *,
P
. 0,05 (t-test)
Diskusjoner
Her har vi satt ut for å finne og oppdage onkogen kjøre 7q21-q22 forsterkning i bukspyttkjertelkreft. Høy oppløsning genomisk profilering av bukspyttkjertelkreft cellelinjer og tidlig-passasje xenografter definert en 325 Kb minimal amplicon spenner
SMURF1
. Transkripsjonsnivåer av
SMURF1
ble forhøyet i prøver med gevinst /forsterkning, og ved FISH vi bekreftet
SMURF1
forsterkning i grunnskolen bukspyttkjertel kreft. Ved hjelp av komplementære tilnærminger av knockdown (i fokalt-forsterket ASPC-1 celler) og overekspresjon (i NIH-3T3-celler), fant vi ut at
SMURF1
forsterkning /overekspresjon endrer ikke celleproliferasjon, men fremmer celle invasjon, anker -uavhengig vekst, og tap av kontakt-inhibering, av hvilke i det minste den sistnevnte er avhengig av dens katalytiske aktivitet.
SMURF1 var opprinnelig en interessant kandidat onkogen på grunn av dets kjente forbindelse til TGFp-signalering. Den TGFfi vei, i det minste i begynnelsen av tumorutvikling, er vekst undertrykkende [23]. Normalt, TGFp binder seg til sine reseptorer (TGFβRI, TGFβRII), som fører til fosforylering av signal transdusere SMAD2 /SMAD3, som deretter transport til kjernen og i kompleks med SMAD4 medierer transkripsjon. Nøkkeltranskripsjons reaksjoner inkluderer induksjon av
CDKN2B plakater (p15Ink4b) og
CDKN1A plakater (p21Cip1), og undertrykkelse av
MYC
sammen fører til G
en celle-syklus arrestere. Den TGFB vekst undertrykkende veien er ofte forstyrret i kreft i bukspyttkjertelen, oftest gjennom mutasjon /sletting av
SMAD4
, men også gjennom inaktivering /tap av
TGFβRI Hotell og
TGFβRII product: [ ,,,0],4].
SMURF1 er en hect-domene E3 ubiquitin ligase (E3 ubiquitin ligaser gjennomføre den tredje og substrat-spesifikke trinn i protein ubiquitinering). SMURF1 fremmer kjernefysiske eksport av TGFB pathway inhibitor SMAD7 (øke tilgjengelighet), og ødeleggelsen av TGFβRI og SMAD4 (gjennom ubiquitinering-mediert degradering) [15], [16]. Alle disse aktivitetene skal tjene til å motvirke TGFfi signalering, og sammen gir en sterk begrunnelse for
SMURF1
forsterkning /overekspresjon i bukspyttkjertelkreft. Det var bemerkelsesverdig da at SMURF1 knockdown i ASPC-1 celler ikke forbedre TGFB-pathway transkripsjon (men kanskje ikke overraskende, gitt inaktive mutasjon av
SMAD4
). Derfor må de onkogene aktivitetene til SMURF1 virker i det minste delvis uavhengig av dens funksjoner i TGFp signalering (i det minste på vei nivået av SMAD4). For dette formål har SMURF1 også vist seg å oppløse tett veikryss (ved nedbrytning av RhoA) i løpet av epitelial-mesenkymale overgang [24], og fokal adhesjon (ved degradering av Talin hoder) for å forsterke cellemigrering [25]. Ytterligere studier bør avklare de viktigste SMURF1 underlag knyttet til invasivitet og forankringsuavhengig vekst i bukspyttkjertel kreft med 7q22 forsterkning.
Under utviklingen av dette arbeidet, to andre studier preget 7q21-q22 amplicon i bukspyttkjertelkreft. Suzuki
et al.
[26] av genomisk profilering av cellelinjer identifisert amplicon i ASPC-1 celler, med amplicon topp spenner over 11 gener. Videre innsats fokusert på to gener,
TRRAP Hotell og
SMURF1
, med betydelig forhøyet uttrykk når de forsterkes. Men i motsetning til vår studie rapporterte de at knockdown av SMURF1 inhiberte ASPC-1-celle-proliferasjon. Spesielt, men evaluert de bare en siRNA. Gitt våre resultater at fire uavhengige sirnas slått ned SMURF1 nivåer forhold og redusert invasjon uten å påvirke celledeling, foreslår vi at deres funn kan gjenspeile en uspesifikk eller spesifikke off-target RNAi effekt. Faktisk, er veksthemming en felles ikke-spesifikk effekt, utløst av et type I interferon respons på siRNA [27]. Suzuki
et al.
Gikk på å vise at SMURF1 overekspresjon i to bukspyttkjertelkreft cellelinjer forbedret kolonivekst på vev kultur plast. Likevel, våre funn basert på knockdown i fysiologisk relevant sammenheng med fokus
SMURF1
forsterkning tyder på at den viktigste onkogene funksjon SMURF1 gjelder å fremme celle invasivitet i stedet for spredning.
I en annen fersk undersøkelse , Laurila
et al.
[28] av FISH analyse av cellelinjer avgrenset den 7q21-q22 amplicon til 0,77 Mb spenner 10 gener (inkludert
SMURF1
), men fokusert sin innsats på
ARPC1A Hotell og
ARPC1B
, subenheter av Arp2 /3 kompleks funksjon i aktin polymerisasjon. Ved hjelp av RNAi, fant de at knockdown av enten redusert cellemotilitet, og knockdown av
ARPC1A
også redusert celle invasjon. Selv om vår minimal amplicon ekskludert
ARPC1A Hotell og
ARPC1B
, er det likevel mulig at deres forsterkning bidrar til motilitet /invasjonen i tumorer hvor de er forsterket. Det er ikke uvanlig å finne flere driver onkogener innenfor kreft amplikonene (f.eks ref. [29]). Faktisk gjør våre egne studier ikke avgjøre om
KPNA7
, innenfor vår 325 Kb minimal fragment, kan også ha en onkogen rolle (sammen med
SMURF1
).
For å oppsummere ved genomisk profilering og funksjonsanalyse identifiserte vi
SMURF1
som en forsterket onkogen kjøring celle invasivitet i bukspyttkjertelkreft. Kanskje av størst betydning, som et enzym SMURF1 representerer en medgjørlig medikament mål. Andre E3 ubiquitin-ligaser har vært knyttet til kreft, og på grunn av deres substrat spesifisitet E3 ubiquitin-ligaser er antatt å være attraktive mål for terapi [30]. Faktisk er flere små molekyl hemmere (inkludert mot MDM2, en regulator av TP53) i dag blir evaluert [31]. Våre funn identifisere SMURF1 som et mulig nytt mål for molekylært-rettet terapi mot ødeleggende sykdommen for kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Prøver
bukspyttkjertelkreft cellelinjer, beskrevet tidligere [12], og NIH-3T3-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Kreft i bukspyttkjertelen xenografter, som effektivt berike svulsten epiteliale brøkdel for DNA-analyse, ble generert som beskrevet [32] ved Johns Hopkins Hospital, med godkjenning fra Institutional Review Board (IRB) (protokoll ID 05-04-14-02) og Animal Care og bruk Committee (protokoll ID MO05M466). Kort fortalt, en 1 mm
3 stykke av primærtumor ble dynket i Matrigel (Collaborative Biomedical Research), deretter implantert subkutant i et nu /nu mus. Innpodet tumorer ble høstet når de nådde 1-2 cm i diameter, og tumorcelle anrikning bekreftet ved H 1,3 og 3.0, henholdsvis. CGH data beskrevet i dette dokumentet er tilgjengelig på GEO (GSE19852); en fullstendig beskrivelse av datasettet er under utarbeidelse.
expression profilering
Expression profilering ble gjort ved hjelp av Agilent Katalog 44K Hele menneskelige genom arrays. RNA ble merket med Hurtig Amp Merking kit (Agilent), deretter hybridisert (
vs.
En universell RNA reference pool av 11 kreftcellelinjer [35]) etter produsentens anvisninger. Etter skanning og datauttrekk (som over), ble uttrykket data normalisert (gjennomsnittlig sentrert) av matrise og av genet, og mener sentrerte log
2 prosenter rapportert.
FISH
En vev microarray som inneholder 105 pancreatic ductal adenokarsinom tilfeller (arkivert ved Stanford University, og brukes med IRB godkjennelse) ble tidligere beskrevet [6]. Probe merking og FISH ble utført ved hjelp av Vysis (Downers Grove, Illinois) reagenser i henhold til produsentens protokoller. En locus-spesifikk BAC kartlegging for å
SMURF1
7q22.1 (RP11-62N3; BacPac Resources Centre, Oakland, CA) ble merket med SpectrumOrange, og co-hybridiserte med SpectrumGreen-merket chr 7 cent probe (CEP7 ; Vysis). Lysbilder ble kontra med DAPI, og avbildes med et Olympus BX51 fluorescens mikroskop med Applied Imaging (San Jose, California) Cytovision 3.0-programvaren. Tjuefem tumorceller ble scoret per sak, og forsterkning defineres som et gjennomsnitt
SMURF1 Twitter /CEP7 ratio . 2.5
siRNA transfections
On-TARGETplus sirnas målretting
SMURF1
, sammen med en negativ kontroll siRNA basseng (ON-TARGETplus siCONTROL Non-targeting pool), ble hentet fra Dharmacon (Lafayette, CO). Sekvenser av sirnas er oppført i tabell S1. ASPC-1-celler ble dyrket ved 37 ° C i komplett medium RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% FBS, 50 U /ml penicillin, og 50 U /ml streptomycin. For transfeksjon ble cellene sådd ut 150.000 per seks-brønns plate brønn, og transfektert ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. -Celler ble transfektert med en endelig konsentrasjon på 50 nM siRNA i 6 timer.
Western-blot
celler ble lysert i 1 x RIPA-buffer supplert som beskrevet [6]. Førti ug totalt protein lysat ble elektroforisert på en 4-15% polyakrylamidgel, og deretter overført til PVDF-membran og blokkert i TBST-T med 5% tørrmelk. Antistoffer ble brukt som følger: anti-SMURF1 kanin polyklonale antistoff (H-60; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) på 1:500 fortynning; anti-GAPDH kanin polyklonale antistoff (Santa Cruz Biotechnology) ved 1:5,000 fortynning; HRP-konjugert anti-kanin IgG (Pierce, Rockford, IL) på 1:20,000 fortynning. Påvisning ble gjort ved hjelp av en ECL kit (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey), og intensiteter kvantifisert ved densitometri hjelp Scion Bilde programvare (Scion Corporation, Fredrick, MD).
Cell vekst og invasjon analyser
Celleproliferasjon /levedyktighet ble kvantifisert ved hjelp av kolorimetri basert på den metabolske spaltning av tetrazoliumsaltet WST-1 i levedyktige celler, i henhold til produsentens protokoll (Roche, Indianapolis, iN). BrdU-inkorporering ble bestemt ved kolorimetrisk ELISA under anvendelse av BrdU-celleproliferasjonsanalyse, i henhold til produsentens protokoll (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Invasion ble kvantifisert ved Boyden kammeret analysen (BD Biosciences, San Jose, California). I korthet, 24 timer etter transfeksjon, ble 50.000 celler sådd ut i 24-brønners Matrigel-belagte innsatser med en 0,5% til 10% FBS gradient. Sytti-to timer senere ble cellene fast, farget med krystallfiolett, og celler som krysser membranen telles. Alle analyser ble gjort som tredoble transfections, og alle forsøk ble gjentatt minst én gang med samme resultat.
TGFB transkripsjonen reporter analysen
Celler ble ko-transfektert med 4 mikrogram p3TP-Lux (Addgene, Cambridge, MA), en TGFp responsiv ildflue luciferase reporter inneholdende tre påfølgende TPA responselementer (TRES) og et parti av plasminogen aktivator inhibitor 1 (PAI-1) promoter region [17], sammen med 0,4 ug PRL-TK (Promega, Madison, WI) som uttrykker Renilla luciferase som en intern normalisering kontroll. Luciferase-aktiviteten ble analysert 48 timer etter transfeksjon (ved Lipofectamine 2000) ved anvendelse av den doble luciferase-rapportøranalysesystemet (Promega, Madison, WI). Reporter-aktivitet er uttrykt som forholdet mellom ildflue /Renilla. Analysene ble gjort som tredoble transfections, og gjentatt minst én gang med samme resultat.
Anchorage uavhengig vekst
En pGIPZ shRNAmir konstruksjon målretting
SMURF1 plakater (V2LHS_229724), sammen med en ikke-måls pGIPZ shRNAmir kontroll, ble hentet fra Open Biosystems (Huntsville, AL). Å skape stabilt-omsatte ASPC-1 celle bassenger, ble lentiviral konstruksjoner (sammen med Trans-lentiviral emballasje mix plasmider) transfektert inn 293TN produsent celler (System biovitenskap, Mountain View, CA), og supernatanten pakket virus omformet til ASPC-1 celler etter produsentens instruksjoner (Åpne Biosystems «Trans-lentiviral GIPZ emballasje Protocol). To dager etter infeksjon, ble 1 pg /ml puromycin (Invitrogen) tilsatt til kulturmediet, og celler valgt i 14 dager. Forankringsuavhengig vekst ble analysert ved kolonidannelse i myk agar. Kort sagt ble 10,000 celler innleiret i en 6-brønns plate godt innenfor et toppsjikt av 0,36% agarose i fullstendig media, over et lag av 0,48% agarose i komplett medium. Celler ble dyrket i 14-21 dager, deretter synlige kolonier telles etter farging med 0,015% nøytral rød oppløsning. Analysene ble gjort som tredoble transductions, og gjentatt minst én gang med samme resultat.
NIH-3T3 fokus formasjon analysen
Full-lengde human
SMURF1
cDNA ekspresjonsvektor pcDNA3 0,1-SMURF1 var en slags gave fra Di Chen (University of Rochester Medical Center, Rochester, NY), og den overordnede vektor pcDNA3.1 ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). En katalytisk mutant SMURF1 (C699A) [22] ble utviklet ved hjelp av Quickchange XL II seterettet mutagenese Kit fra Stratagene (La Jolla, CA), med følgende mutagene primere: 5′-CGTGGAGGAGACCGCCGGGTTTGCTGTGG -3 «(degenerert, muterte baser betegnet med fet tekst) og 5»-CCACAGCAAACCCGGCGGTCTCCTCCACG-3 «. Femti tusen celler ble sådd per 60 mm plate, og 8 ug plasmid ble transfektert ved Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. To dager etter transfeksjon ble celler fra hver 60 mm skål ble gjen sådd ut i to 10 cm plater og dyrket til sammenflytning i løpet av 28 dager. Synlige foci ble telt etter metanol fiksering og Giemsa farging. Analysene ble gjort som tredoble transfections, og gjentatt minst én gang med samme resultat.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
siRNA sekvenser målretting SMURF1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0023924.s001 product: (PDF)
Figur S1.
Hs700T celler vise TGFB-indusert veksthemming. Hs700T celler ble sådd ut, og så ble 2 ng /ml TGFp (eller bærerkontroll) tilsatt, og celleproliferasjon /levedyktighet analysert (av WST-1) daglig. Analyser ble utført i triplikat (gjennomsnitt +/- 1SD vist); *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0,001 (t-test). I samsvar med intakt TGFfi veksthemming, ingen slettinger som spenner
SMAD4 plakater (244K Agilent CGH rekke data, ikke vist) og ingen punktmutasjoner av
SMAD4 plakater (Illumina RNAseq analyse, ikke vist) ble identifisert.
doi: 10,1371 /journal.pone.0023924.s002 plakater (EPS)
takk
Vi takker Ilana Galperin (Stanford cytogenetikk Laboratory) for å få hjelp med FISH analyse, og medlemmer av Pollack lab for nyttige diskusjoner.
