Abstract
Bakgrunn
Foreningen av xenotropisk murine leukemi virus-relatert virus (XMRV) med prostatakreft fortsetter å motta økt oppmerksomhet som studier rapporterer avvik XMRV forekomst strekker seg fra null til 23%. Det er uklart om forskjeller i diagnostisk testing, sykdommens alvorlighetsgrad, geografi eller andre faktorer står for de uharmoniske resultater. Vi rapporterer her utbredelsen av XMRV i en befolkning med veldefinerte prostatakreft og RNase L polymorfisme. Vi brukte stort sett reaktive PCR og Western blot (WB) analyser for å påvise infeksjon med XMRV og relaterte murine leukemi virus (MLV).
metodikk /hovedfunnene
Vi studerte prøver fra 162 amerikanske pasienter diagnostisert med prostatakreft med en middels til avansert stadium (Gleason score på 5-10, moderat (46%) dårlig differensierte tumorer (54%)). Prostatavevet DNA ble testet av PCR-analyser som gjenkjenner XMRV og MLV varianter. For å utelukke forurensning med musen DNA, har vi også utviklet og brukt en mus-spesifikke DNA PCR-test. Detaljert fylogenetisk analyse ble brukt for å antyde evolusjonære relasjonene. RNase L typing viste at 9,3% var homozygot (QQ) for R462Q RNase L mutasjon, mens 45,6% og 45,1% var homozygote eller heterozygote, henholdsvis. Serologisk testing ble utført ved en WB test. Tre av 162 (1,9%) prostatavevet DNA var PCR-positive for XMRV og hadde undetectable mus DNA. Ingen var homozygot for QQ mutasjon. Plasma fra alle tre personer var negativ for viral RNA ved RT-PCR. Alle de 162 pasientene var WB negative. Fylogenetisk analyse utledes en tydelig XMRV.
Konklusjoner og deres betydning
Vi fant en svært lav forekomst av XMRV i pasienter med prostatakreft. Infeksjon ble bekreftet ved fylogenetisk analyse og fravær av forurensende mus DNA. Funn av ikke målbare antistoffer og viremi i alle tre pasienter kan reflektere latent infeksjon. Våre resultater støtter ikke en sammenslutning av XMRV eller MLV-varianter med prostatakreft
Citation. Switzer WM, Jia H, Zheng H, Tang S, Heneine W (2011) Ingen Association of xenotropisk Murine Leukemia Virus-Related virus med prostatakreft. PLoS ONE 6 (5): e19065. doi: 10,1371 /journal.pone.0019065
Redaktør: Paul Dent, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 03.02.2011; Godkjent: 15 mars 2011; Publisert: 04.05.2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Midler til studien ble gitt av Centers for Disease Control and Prevention per årlige bevilgninger fra myndighetene i USA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de hyppigste, langsom vekst, noncutaneous malignitet av menn i den tredje verden [1]. For eksempel er det anslått at over 192 000 mennesker i USA, hovedsakelig av afrikansk-amerikansk avstamning, vil bli diagnostisert med prostatakreft i år [2], [3]. Selv om naturhistorie av prostatakreft er foreløpig ukjent, har flere årsaker vært en teori, inkludert genetiske defekter [4], [5], [6]. I 2006, ved hjelp av microarray og RT-PCR-analyse xenotropisk murine leukemivirus (MLV) -relaterte virus (XMRV) ble først identifisert i ca 40% av familiær prostata kreftpasienter som inneholder R462Q mutasjon i RNase L-genet, en komponent av den antivirale medfødt immunitet [7]. MLV er endogene gammaretroviruses som har integrert inn i musegenomet og kan forårsake kreft, nevrologiske sykdommer, og immunsviktsykdommer hos mus og er klassifisert i tre grupper basert på deres verts tropisme [8]. Xenotropisk MLV (XMLV) replikere kun i ikke-museceller. I kontrast, ekotropisk MLV (EMLV) replikere bare hos mus, mens polytropisk MLV (PMLV) har en bredere tropisme og kan gjenskape i mus og ikke-mus verter [8]. XMRV aksjer ca 93% og 89% nucleotide identitet med XMLV og PMLV over genomet [7]. Identifisering av et mulig viral årsak til prostata kreft er svært viktig fordi det kan lette behandling og forebygging av denne ødeleggende sykdommen.
Tilleggs bevis for XMRV infeksjon personer med prostatakreft har blitt rapportert i en amerikansk studie som viser en høyere Forekomsten av XMRV DNA-påvisning ved PCR (6%) og virale proteiner ved immunhistokjemi (IHC) (23%) i prostata-vev fra 334 prostatakreftpasienter, sammenlignet med 101 godartede kontroller (1,9% ved PCR og 3,9% av IHC) [9] . Denne studien rapporterte også finne XMRV hyppigere hos pasienter med en høyere prostata svulst klasse som tyder på en årsakssammenheng mellom virus og sykdom. En lignende trend ble rapportert i en annen studie som rapporterte en 22% XMRV prevalens i prostatakreftpasienter fra Texas, men fant virus i både tumor og ikke-tumorvev [9], [10]. XMRV nøytraliserende antistoffer identifisert nylig i 11 av 40 (27,5%) US prostatakreftpasienter og XMRV sekvenser ble bekreftet i fem av disse 11 personer ved hjelp nestet DNA PCR og fluorescens in situ hybridisering (FISH) [11].
i motsetning til dette studier i Europa og to fra amerikanske rapportert liten eller ingen XMRV infeksjon [12], [13], [14], [15], [16]. En studie av tyske prostata kreftpasienter og en i Nederland funnet en mye lavere XMRV prevalens (1/87, 1,2% og 3/74 = 4%, henholdsvis) under anvendelse av bare RT-PCR og XMRV-spesifikke primere [12]. Et andre større studie i Tyskland ved hjelp av en kombinasjon av DNA og RNA PCR fant ingen tegn på XMRV infeksjon hos 589 pasienter [14]. I tillegg sera fra ytterligere 146 pasienter med prostatakreft var alle negative ved å teste med en ELISA innlemme rekombinant XMRV konvolutt (konvolutt) og Gag proteiner og ved indirekte immunfluorescens analyser uttrykker XMRV [14]. XMRV ble heller ikke funnet i DNA fra vev fra 161 og 200 pasienter med prostatakreft fra to amerikanske populasjoner, henholdsvis [13], [15]. Studien av Aloia
et al.
Heller ikke påvise XMRV proteiner i vev fra 596 prostata adenokarsinomer og 452 eksemplarer godartet prostatavevet ved hjelp av IHC [13].
Årsakene til de incongruent XMRV resultater er ikke kjent, men kan være relatert til tekniske forskjeller i XMRV testing eller til forhold knyttet til pasientgrupper, blant annet stadium av sykdommen, genetiske faktorer, eller geografisk gruppering. Lignende uoverensstemmende resultater har også blitt rapportert nylig for XMRV hos personer med kronisk tretthetssyndrom (CFS) [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], blant annet en studie av Lo
et. al
rapportering PMLV-lignende sekvenser blant amerikanske pasienter med CFS [24]. Flertallet av prostatakreft-studiene benyttet PCR med XMRV-spesifikke primere som kan være meget følsomme for andre MLV-lignende varianter [7], [9], [10], [11], [12], [15], [16]. I tillegg gjorde de fleste studier ikke utføre serologisk testing for antistoffer som er kjennetegn på retrovirusinfeksjoner, og kan dermed gi ytterligere bevis på infeksjon som ikke er vev-spesifikk.
Vi rapporterer her XMRV testing av en godt karakterisert kohort av 162 pasienter med prostatakreft fra USA ved hjelp av en kombinasjon av serologiske og PCR-analyser som kan påvise XMRV og PMLV. Vi målte også fordelingen av RNase L QQ mutasjon å vurdere sammenslutning av XMRV med denne mutant allel [7]. Vi har også brukt en sensitiv PCR test for å oppdage forurensning med muse-DNA og inkluderer falske positive PCR resultater. Våre funn viser at XMRV er sjeldne i denne pasientgruppen, og støtter ikke en sammenslutning av dette viruset med prostatakreft.
Resultater
Sjeldne XMRV sekvenser i tumorvev fra prostatakreftpasienter
SS-aktin sekvenser ble påvist ved PCR i DNA-ekstrakter fra alle prostata vev som bekrefter deres integritet for PCR-testing. DNA fra bare to (5956 og 6203) av 162 pasienter (1,23%) testet positivt for XMRV sekvenser i den innledende screening (fig. 1, tabell 1). Av de 77 DNA-prøvene som ble i tillegg testet i tre eksemplarer av
pol
PCR-analyse, ble bare én pasient (5935) (1,3%) funnet positive. Dette eksemplaret var positiv i bare én av tre gjentak. Dermed blir samlet PCR utbredelsen var 3/162 eller 1,85%. Pasient 5956 var positiv for
gag Hotell og
pol
sekvenser i 3/5 og 4/6 gjentatte tester, henholdsvis, og
env
sekvenser ble også påvist i 1/3 gjentatte tester (tabell 2). Prøve 5956 var også positiv i alle tre replikere
pol
PCR tester. Bare XMRV
pol Hotell og
env
sekvenser ble funnet i pasient 6203 prostatavevet DNA i 1/4 og 1/1 gjentatte tester, henholdsvis. Ytterligere testing av DNA ekstrahert fra en annen prostatavev i 6203 var gjentatte ganger negative, som sannsynligvis gjenspeiler en ujevn fordeling av lavt kopi XMRV i dette vev. DNA fra alle tre pasienter gjentatte ganger testet negativt for murin mtDNA demonstrerer fraværet av forurensende DNA-molekyler mus. For å teste for viremi vi analysert RNA ekstrakter fra plasmaprøver fra alle tre pasientene. Alle prøvene hadde ikke målbare sekvenser ved QRT-PCR og nRT-PCR tester.
Representant nestet
pol
PCR resultater ved hjelp av prostata svulst DNA. Lanes 1-24, prostatakreft pasienter, inkludert pasienter 5956 (kjørefelt 8) og 6203 (kolonne 19); lane 25, negativ menneskelig PBMC DNA kontroll; baner 26 og 27, vann styrer bare for grunnskolen og nestet PCR tester, henholdsvis; baner 28 og 29, analyse sensitivitet kontroller bestående av 10 og 10
3 eksemplarer av XMRV VP62 plasmid DNA fortynnet i en bakgrunn av en ug av menneskelig PBMC DNA, henholdsvis.
Identifikasjon av XMRV mangfold i prostatakreftpasienter
Sekvensanalyse analyse~~POS=HEADCOMP viste at pasienter 5935, 5956 og 6203 er infisert med varianten XMRV stammer. Den 168-bp
pol
sekvenser fra alle tre pasienter viste 90,5 til 100% nucleotide identitet til hverandre, 94-100% til XMRV, 91,7 til 98,8% til XMLV, 94-100% til PMLV, og 91 -100% til ekotropisk MLV (EMLV) i denne korte regionen. 164-bp
env
sekvenser fra personer, 5956 og 6203 var identiske med hverandre og delt høyeste nukleotid-identitet (94,9 til 100%) for å XMRV og andre xenotropisk MLV-stammer henholdsvis [25].
env
sekvenser fra begge personene var svært avvikende fra EMLVs deler bare ca 46% nukleotid identitet. 413-bp
gag
sekvenser ble bare forsterket fra prostatavevet DNA fra person 5956 og hadde ca 98% nukleotid identitet til XMRV, men var identisk med en xenotropisk Merv funnet på mus kromosom 8 (GenBank tiltredelse # AC127575).
fylogenetisk analyse av
env
-sekvenser utledet tre forskjellige klynger med sterk bootstrap bærer basert på Virustropisme som forventet, ettersom denne regionen inneholder en del av den virale overflatemembran som er involvert i cellulær tropisme (fig . 2a).
env
sekvenser fra både pasienter gruppert med XMLV sekvenser, men var forskjellig fra tidligere rapportert XMRV og proto PMLV (Fig. 2a). I motsetning til de utledede fylogenetiske relasjoner til
pol
sekvenser fra alle MLV grupper viste at denne regionen ikke klynge av vertsområde (fig. 2b). De tre
pol
sekvenser fra prostatakreftpasienter dannet et godt støttet avstamning som inneholder en neuropathogenic Moloney MLV rekombinant (strekk ts-1-92b, GenBank tiltredelse # AF462057) (fig. 2b). XMRV
pol
sekvenser fra tidligere rapporterte prostatakreftpasienter (kodet med VP), med unntak av to (VP29 og VP184, vennlig levert av Joe DeRisi), gruppert med de fra personer med CFS (kodet med WPI) med sterk bootstrap støtte. VP29 og VP184
pol
sekvensene var identiske med hverandre, men 1,2% avvikende fra tidligere XMRV og det dannet seg en svakt understøttet klynge inneholdende en blanding av EMLV og PMLV (fig. 2b). Disse resultatene viser et bredere mangfold av XMRV i dette område enn tidligere sett, men er i overensstemmelse med rekombinasjon med Moloney MLV som nylig rapportert [7], [25]. VP29, VP79, VP86, VP88, VP90, og VP184 er prostatakreftpasienter rapportert i Urismann
et al.
Papir, men der XMRV
pol
sekvenser er ennå ikke tilgjengelig på GenBank [ ,,,0],7]. Nylig rapporterte
gag Hotell og
pol
sekvenser funnet i humane tumorcellelinje DNA ble plassert utenfor regionene brukes i vår studie, og dermed ble ikke inkludert i analysene [25].
A. konvolutten (
env
), B. polymerase (
pol
), og C.
gag
. Stabilitet av treet topologi ble testet ved hjelp av 1000 bootstrap replikerer i både nabo bli (NJ) og maximum likelihood (ML) metoder. Bootstrap verdier 60 er vist på store noder (NJ /ML). Nye sekvenser fra denne studien er innrammet. Deponeringsnummer for prototypiske MLV sekvenser tilgjengelig på GenBank er XMRV VP35 = DQ241301, XMRV VP62 = DQ399707, XMRV VP42 = DQ241302, XMRV WPI-1106 = GQ497344, XMRV WPI-1178 = GC497343, XMRV PCA1-PCA17 = GU812341-GU812357, MLV DG -75 = AF221065, MLV MTCR = NC_001702, MLV AKV = J01998, MLV BM5eco = AY252102.1, Moloney MLV = J02255, Moloney neuropthogenic MLV variant ts1-92b = AF462057, Rauscher MLV = NC_001819, Friend MLV = X02794, Merv Chr 7 = AC167978, Merv Chr 7 = AC127565, Merv Chr 8 = AC127575, Merv Chr 12 = AC153658, Merv Chr 9 = AC121813, Merv Chr 4 = AL627077, Merv Chr 1 = AC083892), XMLV A2780 = FR670594, XMLV BHY = FR670595, XMLV Daudi = FR670596, XMLV EKVX = FR670597, XMLV IMR-5 = FR670598, XMLV Mutz-1 = FR670599, XMLV S-117 = FR670600, XMLV TYK-nu = FR670601. Sekvenser betegnet RAW er fra polytropisk MLV isolert i HeLa-celler brukes til å utvikle in-house WB test. Sekvenser kodet som XMRV VP og PCA og WPI er fra prostatakreft og CFS-pasienter, henholdsvis. Tilleggs prostatakreft pasient VP
gag Hotell og
pol
sekvensene ble vennlig levert av legene. Robert Silverman og Joe Derisi. Virustropisme, som bestemmes ved analyse av
env
sekvenser, er angitt med blå (xenotropisk), lilla (polytropisk) og gule (ekotropisk) kuler.
gag
sekvens fra pasient 5956 gruppert med XMRV sekvenser fra en prostata kreft pasient (VP88), en xenotropisk Merv funnet på mus kromosom 8, og en PMLV sekvens identifisert i en blodgiver (BD-28) ved Lo
et al.
(fig. 2c) [24]. Dette avstamning var mellom subtypene som inneholder XMRV fra prostatakreft og CFS-pasienter og de fleste PMLVs og de resterende MLV funnet i Lo
et al.
Studere [24]. En proto PMLV (MCF1233) gruppert med alle EMLVs og to XMRVs, noe som tyder på det er et rekombinant i denne regionen (Fig. 2c).
Disse fylogenetiske Resultatene tyder også på den korte delen av
env
målrettet av vår nye PCR-analyse er nyttig for å bestemme Virustropisme for å skrive de MLV-relaterte sekvenser. Denne informasjonen kan være nyttig for å forstå opprinnelsen av sekvensene identifisert i PCR-positive mennesker. I kontrast til
gag Hotell og
pol
regioner viste mindre gruppering av tropisme indikerer viral rekombinasjon i disse regionene. For eksempel
gag
sekvenser av prototypiske XMLVs (MTCR), EMLVs (AKV, BM5eco), og PMLVs (MCF1233) gruppert sammen med svært signifikant bootstrap støtte (Fig. 2a).
nesten identiske fylogenetisk tre topologier for hvert gen region ble oppnådd med både NJ og ML metoder. XMRV sekvenser fra begge prostatakreftpasienter var også forskjellig fra PMLV sekvensene amplifisert fra den murine cellelinje (RAW) som brukes for fremstilling av WB antigener som viser videre at disse ikke laboratorie forurensninger (fig. 2). Disse resultatene bekrefter tilstedeværelsen av XMRV i både pasienter og viser at XMRV mangfoldet er større enn i dag verdsatt.
XMRV sekvensene presenteres i dagens papir er tilgjengelig på GenBank med deponeringsnummer HM003608-HM003612, og HQ116790. Sekvenser fra andre studier med XMRV-positive pasienter med prostatakreft var ikke tilgjengelig på GenBank for inkludering i våre analyser [9], [11], [12], [16].
Fravær av antistoffer i plasma fra prostata kreftpasienter
Alle 162 prostatakreft pasient plasmaprøver ble funnet å være negative for antistoffer mot XMRV /MLV i WB test, inkludert plasma fra personer 5935, 5956 og 6203 (fig. 3). I de fleste plasmaprøver viss grad av ikke-spesifikk reaktivitet ble observert til infisert antigenet, men uten tegn på spesifikk reaktivitet overfor gag og /eller Env-proteiner i infiserte antigen blot (Fig. 3).
Molekylvektmarkører (kD ) er anordnet på venstre side av WBS i de øvre paneler. Forventet størrelser av viral Gag (p30, kapsid (CA)), pr65, og konvolutt (konvolutt gp69 /71) proteiner er gitt i hvert WB i øvre paneler. Representative WB resultater for elleve prostatakreftpasienter, inkludert pasienter 5956 og 6203 (markert med stjerne). Bestemmelse av MLV spesifikk reaktivitet bestemmes ved sammenligning av seroreactivity til xenotropisk MLV-infiserte HeLa-antigenene og ikke-infiserte HeLa antigener i øvre og nedre paneler, henholdsvis. Ra, Rauscher MLV hele virus geitepolyklonalt sera; Fr, Friend MLV konvolutt (gp69 /71) geitepolyklonalt sera; pre-immune, geit sera før immunisering.
RNase L R462Q allel fordelingen i studiepopulasjonen og kliniske karakteristika av de tre XMRV-infiserte personer
15 av 162 personer ( 9,3%) ble bestemt til å være homozygot (QQ) for R462Q RNase L-mutasjon, 74 (45,6%) hadde den homozygot RR allel, og 73 (45,1%) var heterozygote (RQ) for mutasjonen (tabell 1).
pasient~~POS=TRUNC 5935 er heterozygot RQ RNase L genotype. Han har en dårlig differensiert adenokarsinom med en Gleason score på 6, T2C patologisk stadium, PSA-nivå på 4,6 ng /ml. Pasient 5956 er villtype homozygot RR RNase L genotype. Han hadde en dårlig differensiert adenokarsinom med en Gleason score på 7, T3A patologisk stadium, en 12,4 ng /ml PSA-nivå. Pasient 6203 er heterozygot RQ RNase L genotype, og hadde en moderat differensiert adenokarsinom med en Gleason score på 6, T2C patologisk stadium, og en 7,1 ng /ml PSA-nivå. Dermed var vi i stand til å bekrefte en sammenslutning av XMRV infeksjon med homozygot QQ RNase L-allelet. Gitt den lave XMRV prevalens, vi har ikke det statistisk styrke til å finne ut om det er en sammenslutning av XMRV med svulst klasse.
Diskusjoner
Vi brukte PCR og serologisk testing for å studere utbredelsen av XMRV i 162 godt karakteriserte nordamerikanske pasienter med prostatakreft. Vi undersøkte kreft med middels til avanserte stadier, og benyttet flere PCR-analyser, inkludert tester med konserverte primere for å tillate påvisning av diverse XMRV og MLV-relaterte sekvenser. Nesten halvparten av prøvene ble også testet i triplikat for å maksimere deteksjonsfølsomheten for lave kopisekvenser. Vi brukte en bredt reaktiv WB analyse for å teste alle pasienter for antistoffer. Våre funn dokumentere en svært lav prevalens (1,9%) av XMRV sekvenser i prostatavevet DNA og fravær av antistoff positivitet i alle prøver. Kombinert disse dataene støtter ikke en sammenslutning av XMRV eller relaterte MLV med prostatakreft.
Den overveiende negative PCR-resultater ble observert til tross for bruk av en ug av DNA som er 4-10 x høyere enn input DNA brukes i tidligere studier som rapporterte XMRV testing [7], [9], [14], [16]. Likeledes kan den observerte lave forekomsten av XMRV ikke forklares ved et redusert PCR assay følsomhet ettersom vi undersøkt prøver med den samme test som benyttes opprinnelig av Urisman
et al.
[7]. I de tre prøvene med påvisbare sekvenser, bemerket vi at kopiantallet var veldig lavt som nestet PCR og replikere testing ble ofte nødvendig for gjenkjenning. Viktigere, i alle tre prøver var vi ute av stand til å detektere mus mtDNA til tross for bruk av en meget følsom analyse, noe som antyder at kilden til XMRV er lite trolig resultatet av forurensning med mus-DNA. Disse resultatene er viktige fordi mus DNA-kontaminering ble rapportert å være kilden til XMRV i en fersk undersøkelse av prostata kreft vev [26]. Forfatterne av denne studien brukte en PCR-analyse for musen intracisternal En partikkel (IAP) som de rapportert å være mer sensitiv enn en mus-spesifikke D-loop mtDNA-baserte analysen [26]. Selv om DNA-prøvene ikke var tilgjengelige for testing i IAP testen, har vi funnet at IAP analysen er like følsomme for vår COX2 sanntid mtDNA-analyse (data ikke vist), og dermed ytterligere unntatt mus DNA-kontaminering som en kilde for vår positive PCR resultater. I tillegg ble DNA-prøvene fremstilt ved FCCC hvor bare humane biologiske prøver, og ikke cellelinjer, blir behandlet, noe som reduserer ytterligere muligheten for murine forurensning.
Sekvensanalyse av de PCR-positive prøvene var svært informativ fordi det bekreftet at alle tre prøvene var XMRV-relatert. Dessuten er funn av en viral belastning i tre prostatakreftpasienter som er forskjellig fra XMRV sett i tidligere studier betydelig og demonstrerer en bredere viral mangfold [7], [9], [14], [16]. Dette ville være en forventet resultat i samsvar med virus evolusjon under spredning og utholdenhet. Fraværet av antistoffer og plasma viremi i disse tre pasientene er bemerkelsesverdig fordi det kan reflektere sequestered eller latente infeksjoner. Tap av antistoff i løpet av en latent infeksjon, atypisk mens de fleste av retrovirale infeksjoner, er blitt beskrevet tidligere for naturlig smitte av aper med simian Type D retrovirus (SRV) [27]. SRV hos aper er assosiert med utbrudd av alvorlig immunsvikt i Primate kolonier og latent SRV infeksjon i disse antistoff negative dyr er bekreftet med større følsomhet ved bruk av PCR-analyse [27]. Våre resultater er også i samsvar med de sett nylig i makaker eksperimentelt infisert med XMRV i hvilke vev ved obduksjon er PCR-positive, men viremi og påvisning av provirus i PBMC forsvinner raskt, etterfulgt av tap av antistoffpåvisning [28], [29]. Selv om en studie rapporterte oppdagelse av XMRV nøytraliserende antistoff i 11 pasienter med prostatakreft, ble disse data ikke er bekreftet med mer følsomme metoder som WB, eller ved PCR-testing i alle tilfeller, og kan således representere spesifikk reaktivitet [11], [17 ]. Longitudinelle studier kan bedre definere verts svar på XMRV infeksjon.
Våre studiepopulasjonen finnes 15 personer med mutasjonen QQ RNase L-allelet. Men ingen var XMRV-positive, noe som står i kontrast til de opprinnelige funn av Urismann
et al.
[7]. XMRV-infiserte personer i vår studie hadde enten homozygot villtype (RR) eller heterozygot (RQ) RNase L R462Q alleler. Våre resultater er konsistente med andre amerikanske og europeiske studier som også identifisert høyere frekvenser av homozygot QQ mutant allel i XMRV-negative personer [9], [10], [16]. Kombinert, disse resultatene tyder på at XMRV infeksjon ikke er knyttet til denne allel form av RNase L.
Selv om våre data ikke støtter en sammenslutning av prostatakreft med XMRV, er det viktig å forstå om XMRV har noen kausal rolle i prostata kreft når den er sjelden oppdaget. Generelt gammaretroviruses som XMRV indusere malign transformasjon av insertional mutagenese, slik at ondartede celler i en tumor er alle klonalt infisert. Denne mekanismen for karsinogenese er blitt funnet i dyr så vel som hos barn utsatt for MLV-avledede vektorer i gen-terapiforsøk [30], [31]. Derfor lavfrekvente av XMRV-infiserte celler som finnes i alle tre pasienter er i strid med en direkte rolle for XMRV i prostata kreftutvikling hos disse pasientene. Tidligere har en human prostatakreft cellelinje, 22Rv1, vist seg å uttrykke høye nivåer av XMRV, et funn som støtter en rolle XMRV i prostatakreft tumorigenesis [32]. Imidlertid ble det nylig rapportert at XMRV uttrykt ved 22Rv1 ikke kan være av human opprinnelse, men mest sannsynlig oppstått via rekombinasjon av to overlappende XMRV lignende genomer under passasje av prostata svulst på innavlet mus (T. Paprotka
m.fl. .
18
th Conference on Retrovirus og opportunistiske infeksjoner). Videre har andre vist at XMRV integrasjonssider klonet fra prostata vev av to av ni pasienter kan ha vært et resultat av forurensning med DNA fra eksperimentelt infiserte DU145 celler [33], mens andre XMRV integrasjons nettstedene er ikke i nærheten tumorsuppressorgener eller proto- onkogener [34]. Kombinert, disse resultatene reiser spørsmål om hvilken rolle XRMV i prostatakreft. Likevel, er mer arbeid for å bedre forstå utbredelsen av XMRV og MLV i mennesker og deres rolle i menneskelig sykdom.
Materialer og metoder
Study befolkningen
Anonymous, arkivert plasma og prostata vev var tilgjengelig fra 162 amerikanske pasienter med prostatakreft som samles inn av Fox Chase Cancer Center (FCCC) Biosample Repository Kjerne Facility mellom 1997 og 2004. Hele blodprøver ble samlet inn ved tidspunktet for pre-kirurgisk testing eller på operasjonsdagen før anestesi fra samtykkende kreftpasienter som del av en studie godkjent av FCCC av mennesker komiteen. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Den FCCC av mennesker etiske komité godkjente innsamling, lagring og fremtidig testing av prøver samlet fra alle samtykkende deltagerne. En ikke-forskning bestemmelse ble godkjent for testing av anonymiserte prøver ved CDC for XMRV og relaterte virus. Alderen ved diagnose av de 162 deltakerne varierte fra 36 til 71 år med et gjennomsnitt og median på 57 år. 86% kaukasiere, 12% African American, og 1% var asiatisk, ikke registrert, eller andre. Den gjennomsnittlige og median serum-prostata-spesifikt antigen (PSA) nivåer var henholdsvis 7,22 ng /ml og 5,5 ng /ml. Svulsten klasse for 75 av 162 (46%) av deltakerne var moderat differensiert, mens 54% hadde dårlig differensierte svulster. Bruke Gleason system, 42% av studiepopulasjonen hadde klasse 5-6 kreft, 40% hadde klasse 7, og 18% hadde høy klasse adenokarsinom (Gleason score 8-10). Patologisk staging klassifisert prostata tumorer som T1C (0,6%), T2A (9,3%), T2B (3,1%), T2C (61,7%), T3A (17,9%), T3B (5,6%), og T4 (1,8%).
Prøve forberedelse
Plasma ble porsjonert og lagret ved -80 ° C innen 4 timer etter blodprøvetaking. Plasmaprøver ble porsjonert igjen på CDC etter tining for serologisk testing; de gjenværende prøver ble frosset ved -80 ° C. DNA-prøver ble fremstilt ved fenol-kloroform-ekstraksjon av prostatavevet ved FCCC anvendelse av standardprosedyrer. Bare menneskelig vev behandles ved FCCC. For utvalgte prøver den QIAamp DNA MINIKIT (Qiagen, Carlsbad, California) ble brukt ved CDC. For plasma RT-PCR-testing av et volum på 0,5-1,0 ml ble ultrasentrifugert ved 45 000 opm for å konsentrere viruset. 360 ul til 860 ul plasma Supernatanten ble forsiktig fjernet og pelleten ble resuspendert i 140 ul av plasma sentrifugert igjen i røret, og deretter RNA ble ekstrahert ved bruk av QIAamp Viral RNA MINIKIT (Qiagen, Valencia, CA). Nukleinsyre-konsentrasjoner ble bestemt ved spektrofotometri ved hjelp av Nanodrop instrumentet (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Integriteten av DNA- og RNA-prøvene ble bestemt ved bruk av ß-aktin eller GAPDH PCR, henholdsvis, som beskrevet [35], [36]. All prøven forberedelse, vev kultur, og PCR-testing ble gjort i fysisk isolerte rom for å hindre forurensning.
Molekylær detektering av XMRV
For å oppdage XMRV og andre MLV variantene vi brukte separate PCR-analyser med primere spesifikk for påvisning av XMRV, eller konserverte primere for generisk deteksjon av MLV og XMRV, som tidligere beskrevet [21]. DNA-prøvene ble undersøkt ved hjelp av to nestede PCR-analyser. Den første analysen bruker PCR primere GAGOF, GAGOR, GAGIF, og GAGIR ansatt Urismann
et al.
Og av Lombardi
et al.
Å oppdage 413-bp XMRV
gag
sekvenser i prostatakreftpasienter og hos personer med CFS, henholdsvis [7], [18]. Den andre PCR-analyse oppdager generelt MLV og XMRV polymerase (
pol
) sekvenser om 216-bp i lengde ved hjelp av primere XPOLOF, XPOLOR, XPOLIF, og XPOLOR [21]. Både
gag Hotell og
pol
PCR tester kan påvise 10 eksemplarer av XMRV plasmid DNA fortynnet i en bakgrunn av en ug av humant DNA [21]. Prøver å ha testet positivt for enten
gag
eller
pol
sekvenser ble re-testet med både analyser og ble også testet med en tredje nestet PCR test for XMRV konvolutt (
env
) sekvenser som også er generisk for XMRV /MLV. Den eksterne XENVOF (5 «GGG GAT CTT GGT GAG GGC AGG AGC 3») og XENVOR (5 «CAG AGA GAA CAG GGT CAC CGG GTC 3») og intern primere XENVIF (5 «AGG GCT ACT GTG GCA AAT GGG GAT 3» ) og XENVIR (5 «CCT TTT ACC CGC GTC AGT GAA TTC 3») forsterke en 215-bp
env
sekvens. I tillegg ble en undergruppe av prøver (n = 77) hvor det er tilstrekkelig DNA var tilgjengelig testet tre ganger ved hjelp av nestede
pol
PCR-analyse for å forbedre deteksjon av lavt kopi XMRV /MLV.
PCR ble utført ved anvendelse av 1 ug av prostatavev DNA i et 100 pl reaksjonsvolum ved anvendelse av standardbetingelser ved 94 ° C i 30 sek, 50 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 45 sekunder i 40 sykluser på en ABI 9700 thermalcycler ( Foster City, California). PCR-produkter ble visualisert ved elektroforese i en etidiumbromid-farget 1,8% agarosegel. For å øke sensitiviteten og spesifisiteten av analysene, forsterket
gag
,
pol
, og
env
sekvensene ble bekreftet ved Southern blot-analyse ved hjelp av biotinylerte oligoprober XGAGP2 (5 « ACC TTG CAG CAC TGG GGA GAT GTC 3 «), XPOLP (5» TTG ATG AGG CAC TGC ACA GAG ACC 3 «), og XENVP (5» TGG GCT CCG GTA GCA TCC AGG GTG 3 «) og kjemiluminescens deteksjon. I likhet med XMRV
gag Hotell og
pol
PCR-analyser [21], den nye XMRV
env
PCR testen var også i stand til å oppdage 10 eksemplarer av XMRV plasmid i en bakgrunn av 1 ug humant DNA (30/32, 93,8%). Vi gjorde ikke oppdage eventuelle XMRV /MLV sekvenser i PBMC DNA fra 41 amerikanske blodgivere med hvert av de tre nestede PCR tester [21].
Kvantitativ XMRV RNA RT-PCR
Plasmaprøver fra personer med positive XMRV PCR-resultater i prostatavevet DNA ble testet ytterligere for viral RNA ved anvendelse av to RT-PCR-tester. Den første analysen, referert til som q
pro
bruker MLV /XMRV generiske protease (
pro
) TaqMan primere Pro-UNV-F1 (5 «CCT GAA CCC AGG ATA ACC CT 3») og Pro-UNV-R1 (5 «GTG GTC CAG CGA TAC CGC T 3») og sonder Pro-UNV-P1C (FAM5 «AGA TAC TGG GGC CCA ACA CTC CGT GCT GAC 3’BHQ1) og Pro-UNV-PR1 ( Funnene og konklusjonene i denne rapporten er de av forfatterne, og ikke nødvendigvis representerer synspunktene til Centers for Disease Control and Prevention.
