Abstract
Bakgrunn
Analyse av tumorprøver for mutasjoner blir stadig viktigere i å drive personlig terapi i kreft. Som mer målrettet terapi er utviklet, opsjoner kartlegge mutasjoner i flere gener i en enkelt svulst prøve vil bli enda mer attraktiv, og forventes å bli bærebjelken i molekylær diagnostikk i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) i fremtiden.
Materialer og metoder
238 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) tumorprøver ble analysert ved hjelp av en egendefinert panel av 82 mutasjonsanalysene over 14 onkogener inkludert
KRAS Hotell og
EGFR
bruker Sequenom iPlex Matrix pasning Laser desorpsjon /Ionisering Time of Flight massespektrometri (MALDI-TOF). Vi har sammenlignet data generert for
KRAS
mutasjoner til de oppdaget av Amplification Ildfast Mutation System (ARMS) basert DxS TheraScreen K-RAS Mutation Kit.
Resultater
De ARMS oppdaget mutasjoner i 46/238 tumorprøver. For prøver med mutasjoner detektert av begge tilnærminger, ble observert 99,1% totalt avtalen. Den MALDI-TOF metode oppdaget ytterligere 6 prøvene som
KRAS
mutasjonspositive og også gitt opplysninger om samtidige mutasjoner inkludert
PIK3CA Hotell og
TP53
.
konklusjoner
Sequenom MALDI-TOF-metoden gir en sensitiv panel basert tilnærming som gjør effektiv bruk av pasient diagnostiske prøver. Denne teknologien kan gi en mulighet til å levere omfattende screening av relevante biomarkører til klinikken tidligere i sykdomshåndtering, uten behov for gjentatt biopsi og gi rom for ytterligere nedstrøms analyse i NSCLC der det er tilgjengelig vev kan ha blitt oppbrukt.
Citation : Sherwood JL, Müller S, Orr MCM, Ratcliffe MJ, Walker J (2014) Panel basert MALDI-TOF Tumor Profilering er en følsom metode for påvisning av mutasjoner i klinisk ikke-småcellet lungekreft tumor. PLoS ONE 9 (6): e100566. doi: 10,1371 /journal.pone.0100566
Redaktør: Anthony WI. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 21 mars 2014; Godkjent: 23 mai 2014; Publisert: 23 juni 2014
Copyright: © 2014 Sherwood et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Data er tilgjengelige i tall i manuskriptet og i tilleggstabellen
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Astrazeneca. Den Funder gitt støtte i form ofmsalaries for forfattere JLS, MCMO, MJR, og JW og Sequenom GmbH for forfatter SM, men har ikke noen rolle i studiedesign, datainnsamling eller analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser: JLS, MCMO, MJR, og JW er ansatte i og eie aksjer i Astrazeneca, der selskapet finansiert denne studien. SM er ansatt i Sequenom GmbH. Patenter vedrørende selumetinib er som følger: patentid patenttitle, US200903005, 8, tosylat-saltet av 6- (4-br0m0-2-chl0r0phenylamin0) -7-fluor-N- (2-hydroksyetoksy) -3-metyl-3H-benzimi-zol – 5 – karboksamid, MEK-inhibitor anvendelige ved behandling av kreft, US200924627, 4 farmasøytisk preparat 271 US201013051, 9 kombinasjonsterapi som omfatter AZD2171 og azd6244 eller MEK-inhibitor. II, US200323286, 9 N3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, us7842816 n3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US7777050 N3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US7576114 N3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US8193229, metode for behandling ved anvendelse n3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US8193230, sammensetninger omfattende n3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer og fremgangsmåter for anvendelse derav, us7235537, N3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US7973170, N3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US8003805, N3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer , US7425637, N3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-hemmere, US8178693, N3 alkylerte benzimidazolderivater som MEK-hemmere. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
NSCLC utgjør ca 85% av alle lungekrefttilfellene [1]. Omtrent 20% av kaukasiere med NSCLC, stiger til over 26% av de med adenokarsinomer (ADC) har aktiverende mutasjoner i
KRAS product: [2]. Asiatiske populasjoner har en
KRAS
mutasjon forekomst på 11% i ADC. Mutasjoner i
EGFR
er til stede i 48% av asiatiske NSCLC ADC versus 19% i kaukasisk ADC.
EML4-ALK
mutasjoner er til stede i 6% av kaukasisk NSCLC ADC og 5% av asiatisk ADC [2]. Molekylær analyse av avvik i
EGFR Hotell og
ALK
er godt etablert og brukes til å identifisere pasienter som er egnet for målrettet terapi slik som EGFR tyrosinkinasehemmere (TKI) gefitinib, erlotinib og afatinib, og
ALK
hemmere som crizotinib [3].
KRAS
er en viktig voksende merke i NSCLC. Den kliniske verdien av å etablere
KRAS
mutasjonsstatus kan øke dersom utviklingen av MEK-hemmere i NSCLC med muterte KRAS levere positive risiko baserte resultater for pasientene. MEK er kjent for å være en nedstrøms effektor av
KRAS
signalering og har vært implisert i cellevekst og tumorvekst. Selumetinib (AZD6244, Arry-142886) er en potent og selektiv, ikke-ATP-konkurrerende MEK1 /2-hemmer [4]. En fersk klinisk fase II studie (NCT00890825) sammenlignet effekten av selumetinib i kombinasjon med docetaxel versus docetaxel alene i pre-behandlede pasienter med
KRAS
mutasjonspositive lokalavansert eller metastatisk ikke-småcellet lungekreft. Median total overlevelse var 9,4 måneder (6.8-13.6) i selumetinib gruppen og 5,2 måneder (95% KI 3,8-ikke-beregne) i placebogruppen (hazard ratio (HR) for døden was0 · 80, 80% CI 0 · 56 1 • 14; ensidig p = 0,21). Median progresjonsfri overlevelse var 5 · 3 måneder (4 · 6-6 · 4) i selumetinib gruppen og 2,1 måneder (95% CI 1.4 til 3.7) i placebogruppen (HR for progresjon 0,58, 80% KI 0,42 til 0,79 ; ensidig p = 0,014) [5]. Effekten av selumetinib i villtype
KRAS
NSCLC er ennå ikke fastslått. Andre MEK-hemmere i utvikling inkluderer cobimetinib (GDC-0973, XL-518) og trametinib. Sistnevnte ble nylig godkjent for bruk av FDA i
BRAF
V600E mutert melanom. Demonstrasjon av en klar klinisk fordel i en
KRAS
mutasjonspositive NSCLC befolkningen fører til narkotika godkjenning ville kjøre behovet for å identifisere relevante
KRAS
mutasjoner i NSCLC pasienter ved diagnose, i tillegg til
EGFR Hotell og
ALK
avvik, for å informere behandlingsbeslutninger.
i NCT00890825 rettssaken armene basert DxS TheraScreen K-RAS Mutation Kit ble brukt til prospektivt identifisere
KRAS
mutasjon-positive pasienter med behov for randomisering og behandling. ARMS metodikk ble valgt som det gir overlegen sensitivitet og spesifisitet i formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) materiale i forhold til direkte sekvense [6], [7]. I den kliniske studien å sette dette qPCR basert metoden kan utføres med en rask tur rundt tid på små pasient tall som prøvene ble mottatt.
I en annen fersk studie av selumetinib i kutant melanom, NCT00936221 [8], prøver ble analysert ved hjelp av en kombinasjon av våpen og sekvense metoder for å teste for
BRAF
mutasjoner i kodon V600.
Sequenom iPlex Pro MALDI-TOF teknologi gjør at flere mutasjoner i FFPE-prøver som skal analyseres i et enkelt undersøkelse ved hjelp multipleks PCR reaksjoner [9]. Teknologien benytter små (~80 basepar) PCR-produkt amplifisering som er optimal for amplifisering av fragmenterte DNA-templater som de som er utvunnet fra FFPE-tumorprøver. Etter amplifikasjon blir et enkelt basepar forlengelsestrinn utføres på stedet av det muterte basen av interesse med en masse modifisert ddNTP avslutning blanding. Fordelen med denne fremgangsmåten er evnen til å løse de fire baser på spektrene. Det resulterende fragment, med modifiserte base på stedet av mutasjonen blir deretter analysert ved hjelp av Sequenom MassARRAY massespektrometer som er utviklet og optimalisert for nukleinsyre-deteksjon. En klar fordel med dette systemet er evnen til å identifisere en hvilken som helst mutant utgangspunkt i en gitt posisjon vil si én analyse dekker alle tre mulige baseforandringer uten behov for en separat analyse for hver potensiell mutasjon. For eksempel Gly12Cys mutasjon i
KRAS
er forårsaket av en G T transversjon i posisjon 34. Sequenom iPlex Pro vil oppdage eventuelle mutasjon på denne basen posisjon inkludert Gly12Arg og Gly12Ser mutasjoner forårsaket av G C overgang og G En tranversion hhv. Dette reduserer malen DNA kravet, og derfor reduserer vev etterspørsel.
Her er vi rapportere hvordan MALDI-TOF metode sammen til ARMS som en metode for å påvise
KRAS Hotell og
BRAF
mutasjoner i kliniske prøver og hvordan bruken av et multiplex panel tillatt oss å kartlegge omfanget av mindre vanlige mutasjoner i vårt NSCLC kohort.
Materialer og metoder
Tumor Sample Analysis
de 238 NSCLC pasientprøver kom fra NCT00890825 studien [5].
177 melanom prøver fra NCT00936221 studien [8] det ble også samlet inn og behandlet som beskrevet i Robert et al [8].
alle prosedyrer ble utført i henhold til Helsinki-deklarasjonen (1964, endret i 1975, 1983, 1989, 1996 og 2000) av World Medical Association og alle pasientprøver som sendes inn til analyse ble gjort med fullt informert samtykke fra pasienter
patologi
pasienter i denne NSCLC kohort ga en tumorprøve som daterer seg fra mellom mai 2007 og mai 2010. Prøvene ble bekreftet histologisk eller cytologisk som stadium IIIB-IV NSCLC etter H . E farging av en kvalifisert histopathologist på LabCorp Senter for molekylærbiologi og patologi (CMBP), Research Triangle Park, NC, USA.
Nucleic Acid utvinning
Nukleinsyre ekstraksjon ble utført ved LabCorp CMBP, Research Triangle Park, NC, USA, fra 4 × 5 mikrometer FFPE- seksjoner, med fjerning av parafin ved smelting.
DNA ekstraksjon ble utført ved hjelp av Qiagen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland), i henhold til settet innsatsen. Eluering var i 100 mL vann.
DNA ble kvantifisert ved bruk av TaqMan RNase P Detection reagenser kit og TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems, Carlsbad, California USA) for å etablere forsterkende yield.
KRAS
Mutation status Analyse
Tumorprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble prospektivt vurdert for
KRAS
mutasjonsstatus ved hjelp av TheraScreen K-RAS ARMS Mutation Kit (Qiagen Manchester [tidligere DxS Ltd], Manchester, UK).
Kvantitativ Polymerase Chain Reaction (qPCR) ble utført ved hjelp av en ABI Prism 7900 qPCR system (Applied Biosystems).
KRAS
mutasjonsanalyse ble utført av LabCorp CMBP, Research Triangle Park, NC, USA.
en porsjon av den gjenværende DNA ble levert til Sequenom GmbH, Hamburg for analyse ved hjelp Sequenom iPlex kjemi og MALDI-TOF.
Sequenom iPlex Pro-analyse design
Tabell 1 viser den tilpassede panel av mutasjonsanalysene som er designet for mutasjoner i 14 onkogener nemlig
BRAF, CDNK2A, CTNNB1, EGFR, erbB2, FGFR, HRAS, KRAS, STK11, MET, NRAS, TP53, PIK3CA Hotell og
PTEN
. Mutasjoner ble valgt basert på kjent frekvens i NSCLC eller melanom, biologisk betydning eller tilstedeværelse av eventuelle vesentlige «hotspots» utlån seg til målrettede analyser [2], [10] – [13].
Mutasjonen analysen ble utført ved Sequenom GmbH (Hamburg) og besto av 10 signalpakker som inneholder 82 metoder for å detektere over 160 forskjellige mutasjoner. Produsentens standardprotokoll ble fulgt [9]. Kort sagt, ble 2 ul av templat genomisk DNA amplifisert ved multipleks PCR for å forlenge villtype (WT) og mutant-DNA, etterfulgt av en reke-alkalisk fosfatase-behandling for å fjerne overskudd nukleotider. Deretter ble en primer-forlengelsesreaksjon (iPLEX Pro) utført med masse-modifisert terminator nukleotider, og produktene ble flekket på en SpectroCHIP (Sequenom). De forskjellige masser ble bestemt av MALDI-TOF massespektrometri. Data ble analysert ved hjelp MassARRAY Typer Analyser programvare (Sequenom) [9].
Resultater
Analyse Suksess priser
DNA utbytte varierte fra -10 genomiske kopier per mL til ~30,000 kopier per mL med et gjennomsnitt på 1837 eksemplarer per ul (5,9 ng /mL). Elleve prøver med svært lavt antall kopier (eller under 10 kopier per mL) mislyktes analyse ved hjelp av ARMS kit. Alle prøvene ble vellykket analysert ved hjelp av MALDI-TOF panel.
Sammenligning mellom MALDI-TOF Panel og ARMS Kit for
KRAS
i NSCLC
238 prøver ble analysert ved hjelp av ARMS kit som er designet for å påvise følgende syv
KRAS
mutasjoner: G12C /R /S /V /A /D og G13D. 46/238 (19%) av pasientprøver ble klassifisert som
KRAS
mutant positive ved ARMS test. Den MALDI-TOF metode dekker G12C /R /S /V /A /D, G13D /V /A /E og Q61L /R /P /E /K /H. 53/238 (22%) prøver ble klassifisert som
KRAS
positive ved MALDI-TOF, med en pasient som har to separate mutasjoner, en i kodon 12 og en i kodon 61.
A
KRAS
A146 mutasjonsanalyse ble inkludert på MALDI-TOF panel og ingen mutasjoner ble oppdaget, i samsvar med tidligere rapporter som tyder på denne mutasjonen, men relevant i tykktarmskreft, er ikke viktig i NSCLC [12], [14] .
Concordance av MALDI-TOF metode med ARMS Kit
samsvar mellom de to plattformene ble bestemt ved hjelp av data fra prøver som ble evaluert av begge metoder (dvs. vi utelatt de 11 prøvene som mislyktes ved ARMS metode). Den MALDI-TOF metode oppdaget 6 (13%) mer
KRAS
mutasjoner totalt, delvis på grunn av bredere dekning (tabell 2 3). For disse mutasjoner detekterbare ved begge plattformene den positive prosent avtalen (PPA) mellom armene fremgangsmåte og MALDI-TOF-metoden var 97,8% (tabell 4), og den samlede prosentvise avtalen (OPA) var 99,1%. Spesifisiteten av Sequenom plattformen i prøver etablert som villtype ved ARMS var 98,3% (negativ prosentavtalen).
De to uharmoniske prøvene tatt en prøve hvor MALDI-TOF oppdaget en G12D mutasjon med armene analysen resultat som overstiger de kriteriene som er beskrevet i settet innsats for et positivt resultat. I den andre prøven, MALDI-TOF genererte ingen påviselig signal mens ARMS oppdaget en G12C. Den mest sannsynlige forklaring på dette er at den høye andelen av villtype DNA kan ha overskredet den analytiske sensitiviteten av standard iPlex Pro kjemi. Det er blitt vist ved denne gruppen (data ikke publisert) at dette panelet var i stand til å påvise mutasjoner robust ned til 5% (grense på vår analyse) under anvendelse av cellelinje tilsetninger.
Derfor utfører Sequenom MassARRAY plattformen minst like godt i (OPA = 99,1%) vurderer
KRAS
mutasjonsstatus i klinisk tilgjengelige NSCLC FFPE-prøver som ARMS plattformen (tabell 4), med forbedret analytisk følsomhet (tabell 3).
Utbredelse av andre mutasjoner i NCT00890825 NSCLC Cohort
MALDI-TOF data ble generert på flere mutasjoner inkludert kodon 12, 13 og 61 i
HRAS Hotell og
NRAS Hotell og kodon 600
BRAF
. 107 av de 238 prøver (45%) var positive for minst én mutasjon (se tabell S1). 52/238 (22%) av pasientene hadde mutasjoner i
KRAS
, i samsvar med forventet prevalens i NSCLC [2] (tabell 5).
NRAS
mutasjoner ble oppdaget hos 5 pasienter (2,1%), inkludert 3 Q61 mutasjoner, et G12 og et G13 mutasjon. Det var 3
BRAF
V600E mutante prøver og 2
HRAS
mutante prøver i kodon Q61 og G12.
En rekke kjente
TP53
mutasjoner ble undersøkt og funnet å være til stede i 23/238 (10%) av pasientene. Det bør bemerkes at MALDI-TOF analyse bare avhørt 10/480 (2%) av erstatninger som har blitt rapportert i lungene ved systematiske skjermer i COSMIC databasen [13], selv om de var de 10 mest vanlige muterte basene rapportert deri ( Tabell 5).
EGFR
mutasjoner ble oppdaget i 20/238 (8,8%) av våre prøver. Dette er litt lavere enn forventet fra tidligere rapporter som tyder på
EGFR
mutasjoner er tilstede fra 10% til 15% i kaukasiere med NSCLC [15]. En rekke faktorer kan ha bidratt til den lave forekomsten av
EGFR
mutasjoner i vår studie. Først 9% av våre prøvene var plateepitelkarsinom, som har mye lavere forekomst av
EGFR
mutasjoner enn ADC. Dernest, vi kan ikke utelukke lokale forhåndsvalg av pasienter for vår studie, på grunn av kjennskap til
KRAS
positiv status etter lokal testing,
EGFR
positive pasienter blir viderekoblet mot TKI terapi eller økt andel for pasienter med røykehistorie, som ville være mindre sannsynlighet for å ha
EGFR
mutasjoner [2], [12].
concomitance av mutasjoner i NSCLC
10/52 (19%) av pasientene med
KRAS
mutasjoner hadde ledsagende mutasjoner, den vanligste av disse var
TP53
,
PIK3CA Hotell og
CDNK2A
. Figur 1a. viser concomitance av mutasjoner i hver tumorprøve som inneholdt minst en mutasjon, n = 107.
B).
KRAS
muterte prøver i NCT00890825 med samtidige mutasjoner.
Figur 1b. viser de 10 prøvene som var
KRAS
positive og hadde ledsagende mutasjoner. Fire prøver hadde
TP53
mutasjoner som enten var i
TP53
R282 eller R175 DNA-bindende domene mutasjoner. Begge disse mutasjonene er i topp seks hyppigste
TP53
mutasjoner funnet i kreft og er skadelig for TP53 funksjon [16].
To prøver hadde en
KRAS
G12D mutasjon co-forekommende med en aktive
PIK3CA
mutasjon. Concomitance av disse mutasjoner er blitt observert tidligere [12]. En prøve inneholdt en R248C mutasjon i
FGFR
ekstra-cellulære domene som var tilfeldig med
KRAS
G12C.
FGFR3
mutasjoner er til stede på rundt 3% i lungekreft [17] og R248C mutasjon er kjent for å drive tumordannelse i xenograft modeller som ble hemmet av multi-kinase inhibitor ponatinib.
En prøven med en
KRAS
mutasjon viste en samtidig mutasjon med en
EGFR
T790M mutasjon.
KRAS Hotell og
EGFR
aktiverende mutasjoner er generelt ansett for å være gjensidig utelukkende [18] men de har blitt observert ved svært lave frekvenser [19], [20]. Den T790M mutasjonen er kjent for å gi resistens mot
EGFR
TKI-tallet. Uvanlig, denne prøven inneholdt også en dobbel
KRAS
mutasjon og en
PTEN
mutasjon. Det bør bemerkes at konsentrasjonen av DNA var ekstremt lav i denne prøven og ytterligere bekreftelse ved sekvensering var ikke mulig.
Utførelse av MALDI-TOF-MS Panel i melanomprøver
Den samme MALDI -TOF MS panel ble også brukt på et sett av 177 melanom prøver fra kliniske forsøk NCT00936221 som vurderte effekten av selumetinib i kombinasjon med dacarbazine sammenlignet med dacarbazine alene førstelinjepasienter med
BRAF
mutasjonspositiv avansert kutan eller ukjent primært melanom [8]. 69/177 (39%) prøvene var
BRAF
V600E positiv hjelp MALDI-TOF. Dette sammenlignet med svært godt med resultatene fra NCT00936221, som ble utført ved hjelp av en kombinasjon av to forskjellige ARMS baserte tester og Sanger-sekvensering, som oppdaget BRAF V600E mutasjoner i 69/177 prøver. De aller fleste av prøvene ble undersøkt ved hjelp av ARMS tester. To prøver ble
BRAF
mutasjon positive ved MALDI-TOF og negativ med Sanger-sekvensering. De MALDI-TOF spektrografer indikerte at disse mutasjonene var tilstede under den nominelle følsomheten av Sanger-sekvensering som kan være så høyt som 20% mutant-DNA i villtype bakgrunn. To prøver var negative ved MALDI-TOF men positive ved en ARMS basert test. Armene test hadde en 2% følsomhet, noe som er bedre enn 5% sensitivitet vi etablert for den MALDI-TOF panel (data ikke vist). Totalt 21/177 (12%) av melanom prøvene sviktet analyse ved hjelp av enten en ARMS test eller Sanger-sekvensering, mens MALDI-TOF-metoden var vellykket i alle tilfeller.
NRAS
mutasjoner ble også funnet hos 38/177 (22%) melanom prøver ved hjelp av MALDI-TOF panel. Som en direkte sammenligning mot data generert av ARMS og ved sekvense kollektivt MALDI-TOF den samlede prosent avtalen var 97% (152/156).
Diskusjoner
I denne studien har vi undersøkt nytten av Sequenom MassARRAY MALDI-TOF-plattformen i mutasjonsdeteksjon i NSCLC og føflekkreft, sammenlignet med ARMS teknologi som har vist overlegen følsomhet enn direkte sekvensering i FFPE-prøver. Den MALDI-TOF-metoden hadde en høyere analyse suksessrate i prøver med lav DNA yield, mest sannsynlig på grunn av mindre fragment størrelse (~80 bp), godt under gjennomsnittet fragment størrelsen på DNA oppnåelig fra FFPE prøver (rundt 200 bp). Tidligere studier har etablert den analytiske sensitiviteten av Sequenom s massespektrometri teknologi som 1-10% [21]. Disse data viser at Sequenom s MALDI-TOF teknologi er av tilstrekkelig sensitivitet og spesifisitet som skal brukes til direkte terapi for
KRAS
mutasjonspositive pasienter, i NSCLC.
Viktigheten av testing for mutasjoner i 3 kodoner (G12, G13 og Q61) i
KRAS
ofte mutert i NSCLC ble demonstrert ved påvisning av 13% mer
KRAS
positive pasienter i denne kliniske kohort. En fase III studie, SELECT-en, (NCT01933932) er for tiden i gang for å vurdere effekt og sikkerhet av selumetinib i kombinasjon med docetaxel i
KRAS
mutasjonspositive NSCLC pasienter som får andre behandling. I denne studien er pasienter som blir valgt ved hjelp av Cobas
KRAS
Mutation Test (CE /IVD) som er utviklet for å oppdage 19 mutasjoner i kodon 12, 13 og 61 [22].
Annet mutasjoner i
HRAS
,
NRAS Hotell og
BRAF
ble også påvist. Siden disse mutasjonene har vært knyttet til MEK aktivering, kan pasientene bærer disse mutasjonene også være kandidater for behandling med en MEK hemmer selv om betydningen av disse mutasjoner i NSCLC er ukjent [23] – [25]. For eksempel lungekreft cellelinjer som inneholder
NRAS
mutasjoner har vist seg å være følsom for MEK hemmer selumetinib [26].
Data generert for
BRAF
V600E mutasjoner i melanom prøvene viste også samstemmighet i 152/156 (97%) av prøvene med armer eller Sanger-sekvensering som viser nøyaktigheten av MALDI-TOF MS metode i
BRAF
V600E mutasjoner. Kutane melanomprøver ofte inneholder høye konsentrasjoner av melanin som inhiberer PCR. Den vellykkede analyse av prøver som sviktet ved hjelp ARMS demonstrert evnen til MALDI-TOF-MS-metode for å kunne gi data i melanomprøver.
En fremtidig utfordring i klinikken er sannsynligheten for redusert vev tilgjengeligheten på grunn av økt etterspørsel for testing. Sekvensiell refleks testing av genetiske avvik kan medføre behov for ytterligere invasive biopsi prosedyrer som kan unngås i noen tilfeller ved å teste for alle informative markører parallelt når pasienten første presenterer med NSCLC.
Verdien av Sequenom plattform var at det brukes mindre prøve enn andre metoder; 2 ganger mindre DNA ble brukt til å genotype 27 ganger så mange loci (82 vs 3) på tvers av 14 gener, enn det som ble anvendt for armene test som bare så på et enkelt gen. Tenkes 2 x 5 um seksjoner eluert i 50 ul ville ha tilstrekkelig materiale for den molekylære karakterisering av prøvene i denne kohort. Dataene i studien ble generert i en arbeidsdag som angir tractability i klinikken i betraktning av sving rundt krav.
Vi oppdaget mutasjoner samtidige med
KRAS
i 10/52 (19%) av tilfellene. To prøver viste samtidige
PIK3CA
mutasjoner med
KRAS
.
PIK3CA
mutasjoner i kombinasjon med
KRAS
har vist seg å gi resistens mot MEK-hemmere
in vivo product: [27]. Evnen til å oppdage samtidige mutasjoner kan gi ytterligere klinisk nytte og potensielt gi et innblikk i passende kombinasjon tilnærminger til terapi. Pasienten Tallene i NCT00890825 med samtidige mutasjoner var for liten til å observere noen link til respons.
Våre data viser potensialet nytten av Sequenom MALDI-TOF panel i kliniske NSCLC prøvene.
En potensiell begrensende faktor for bruken av paneltester slik som Sequenom i den diagnostiske innstillingen er kravet av regulatoriske myndigheter for utstrakt kontroll av hver påvisbart variant som ikke alltid er rett frem på grunn av tilgjengelighet av prøver for validering.
det bør det bemerkes at bruken av denne teknologien for å påvise mutasjoner i tumorsuppressorgener slik som
TP53
og
CDNK2A
ville være en upraktisk og ineffektiv bruk av vev på grunn av det antall baser som ville trenge for å bli avhørt.
Next Generation Sequencing (NGS) teknologi kan også dekke flere gener. NGS er spesielt fordelaktig når screening gener som har ulike mutasjonsmønstre som
TP53
, og kan oppdage nye mutasjoner, noe mindre lett oppnås på MALDI-TOF-plattformen. NGS paneler generelt krever en høyere DNA-inngang enn dette systemet for å muliggjøre generering av brukbare sekvense biblioteker, og følsomheter kan begrenses til omkring 5%, avhengig av les dybdebehov og sekvens sammenheng. NGS presenterer også sine egne utfordringer i snu tid og kostnader for analyse, konservering og data management.
I en diagnostisk setting der noen mutasjoner er av kjent relevans for målrettet terapi, for eksempel i NSCLC, Sequenom MALDI-TOF har en klar fordel over direkte sekvenseringsmetoder på grunn av sin bevist nytte i FFPE avledet DNA, rask tur rundt tid, beskjedne data lagringsbehov og minimale brukeranalyse kravet.
i konklusjonen, Sequenom MALDI-TOF tilnærming til mutasjon profilering~~POS=HEADCOMP er en effektiv og informativ bruk av pasientprøver. Det viser sammenlign følsomhet og god samsvar med et godt etablert ekstremt følsom
KRAS
ARMS test når det brukes i NSCLC prøvene, med evnen til å identifisere et bredere spekter av mutasjoner, bruke mindre vev. Samtidige mutasjon profiler i NSCLC FFPE-prøver kan informere behandlingsstrategi som klinikere bruker på individuell basis.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Alle mutasjoner oppdaget av den tilpassede MALDI-TOF panel, av prøven
doi:. 10,1371 /journal.pone.0100566.s001 plakater (XLSX)
