Abstract
fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) er viktig i tidlig utvikling og reparasjon av vev. FGFR4 uttrykk nivåer er svært begrenset i voksen vev, unntatt i flere solide tumorer inkludert tykktarmskreft, som viste overekspresjon av FGFR4. Her FGFR4 mutasjon analyse forkastet nærvær av aktiverende mutasjoner, annet enn Arg
388, i forskjellige tykktarmskreft cellelinjer og tumorprøver. Stabil shRNA FGFR4-stanse i SW480 og SW48 cellelinjer førte til en signifikant reduksjon i celleformering, adhesjon, cellemigrering og invasjon. Denne reduksjonen i tumorigen og invasive egenskapene til kolorektal kreft celler ble ledsaget av en nedgang på sneglen, Twist og TGFfi genuttrykk nivåer og en økning av E-cadherin, forårsaker en tilbakevending til en mer epitelial fenotype, i tre forskjellige cellelinjer. I tillegg, FGFR4-signale aktivert onkogene SRC, ERK1 /2 og AKT baner i kolon kreftceller og fremmet en økning i celleoverlevelse. Relevansen av FGFR4 i tumorvekst ble støttet av to ulike strategier. Kinase hemmere avskaffet FGFR4 relaterte cellevekst og signalveier på samme utstrekning enn FGFR4-forstummet celler. Spesifikke FGFR4 målretting bruker antistoffer provosert en tilsvarende reduksjon i cellevekst. Videre FGFR4 knock-down cellene viste en redusert kapasitet for
in vivo
tumordannelse og angiogenese i nakne mus. Samlet våre data støtte en avgjørende rolle for FGFR4 i tumorigenesis, invasjon og overlevelse i tykk- og endetarmskreft. I tillegg FGFR4 målretting demonstrert sin anvendbarhet for kolorektal kreft terapi
Citation. Peláez-García A, Barderas R, Torres S, Hernández-Varas P, Teixido J, Bonilla F et al. (2013) FGFR4 Rolle i epithelial-Mesenchymale Overgang og terapeutisk verdi i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (5): e63695. doi: 10,1371 /journal.pone.0063695
Redaktør: Qian Tao, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 09.11.2012; Godkjent: 06.04.2013; Publisert: May 16, 2013
Copyright: © 2013 Peláez-García et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av tilskuddet BIO2009-08818 fra det spanske departementet for vitenskap og innovasjon, gi til etablerte forskningsgrupper (AECC) og gi S2011 /BMD-2344 /Colomics2 fra Comunidad de Madrid. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
fibroblast vekstfaktorer (FGF) har vært innblandet i flere biologiske prosesser i løpet av embryo utvikling, sårheling, hematopoiese og angiogenese [1]. De binder til fire FGF-reseptorer (FGFR) betegnet FGFR1-4 [2]. Den FGFRs Strukturen omfatter en ligand-bindende domene som inneholder tre forskjellige immunoglobulin-lignende domener (kalt Ig I, II og Ig Ig III). Liganden domene blir fulgt av et enkelt transmembrandomene og et intracellulært cytoplasmatisk tyrosinkinase domene. FGFR4 viser den begrensede mønster av uttrykket til embryoutvikling og vev reparasjon [3], [4] i forhold til de andre tre FGFRs, og dens uttrykk nivåer avta etter fødselen. Hos voksne er FGFR4 uttrykt i muskel myofibroblasts under regenerering etter skade, men ikke i modne skjelettmuskulatur [5]. FGF-reseptorer dysregulering har vist seg å spille en viktig rolle i kreftutvikling og progresjon. Disse endringene har vært foreslått å skje gjennom overekspresjon, genamplifikasjon eller mutasjon [6].
Tidligere vår gruppe identifisert FGFR4 som et autoantistoff mål i kolorektal cancer (CRC) ved hjelp av protein-mikromatriser [7]. I tillegg observerte vi en klar overekspresjon av FGFR4 i kolorektal kreft cellelinjer (særlig i to av fire svært metastatisk kolorektal kreft cellelinjer) med en potensiell sammenslutning av FGFR4 utfoldelse til sene stadier tykktarmskreft [8]. FGFR4 har blitt rapportert å være overuttrykt i humane bryst, prostata, kolon, rhabdomyosarkom, mave, bukspyttkjertel, hepatocellulære og hypofyse adenokarsinomer [4], [9], [10], [11], [12], [13] , [14], [15], hvor den kan bidra til tumorprogresjon ved flere mekanismer, [4], [9]. Videre ble FGFR4 uttrykk nivåer assosiert med metastatisk sykdom og dårlig overlevelse i mage, lunge, bryst adenokarsinom og rabdomyosakrom [16], [17], [18]. FGFR4 somatiske mutasjoner er sjeldne i kreft [11], [19], [20], [21]; Arg
388 er den vanligste enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) i FGFR4, som provoserer forbedret stabilitet og forlenget aktivering av reseptoren. Det har vært assosiert med dårlig prognose for positive node brystkreft, Bløtvevskreft høy klasse, hode og nakke og lunge plateepitelkarsinom [9], [16], [18], [22], [23].
Blant de 18 FGF ligander, binder FGF19 fortrinnsvis FGFR4 [24], selv om det også binder FGFR1. Binding skjer i et kompleks som består av heparin, FGFR4 og to FGF-molekyler, som utløser FGFR dimerisering, som fører til autofosforylering av flere tyrosinrester i det intracellulære tyrosinkinase-domene [3], [25]. FGF19-FGFR4 blitt foreslått å spille en rolle i induksjon av hepatocytter proliferasjon og karsinogenese [26]. Antistoffer rettet mot FGF19 har vist terapeutisk løftet i forskjellige tumorxenotransplantater [27]. Men blokkering av FGF19 kan opptre på forskjellige FGF-reseptorer [28].
Vi har brukt forskjellige tykktarmskreft prøver og cellelinjer (SW480, SW620, SW48, KM12C og KM12SM) [29], [30], [31] for å undersøke tilstedeværelse av SNPs eller aktiverende mutasjoner i FGFR4 og å karakterisere sin biologiske relevans som onkogen og terapeutisk mål i tykk- og endetarmskreft. KM12C og KM12SM epitelceller har samme genetiske bakgrunn, ulik i sine metastatiske egenskaper [31]. SW480 og SW620 er to isogene kolorektal kreft cellelinjer. SW480 ble isolert fra en primær Dukes B tumor av tykktarmskreft, mens SW620 cellelinje ble isolert fra en metastatisk lymfeknute fra den samme pasient [30]. SW48 kolorektal kreft celler ble avledet fra en svulst på Dukes C scenen [30]. Disse fem cellelinjer som skiller seg også i FGFR4 protein ekspresjonsnivåer [8]. I vår studie ble ingen nye SNPs eller aktiverende mutasjoner funnet i FGFR4. Men tap-av-funksjon eksperimenter avslørte en stor rolle for FGFR4 i tumorigene egenskaper kolorektal kreft celler, siden dens uttømming avskaffet spredning, adhesjon, migrasjon og invasjon. FGFR4-stanse forårsaket en oppregulering av E-cadherin uttrykk og nedregulering av sneglen og andre epiteliale-mesenchymale overgangs (EMT) meklere. Til slutt, vi demonstrert at FGFR4 målretting var i stand til å blokkere tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Etisk komité i Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, Spania) godkjente protokoller brukes til eksperimentelt arbeid med mus.
cellelinjer, RNA Utvinning, Antistoffer og hemmere
kolorektal kreft cellelinjer KM12C og KM12SM [31], [32] ble oppnådd fra Dr I. Fidler (MD Anderson). SW480, SW48 og HEK293 cellelinjer var fra ATCC. Celler ble dyrket i henhold til etablerte protokoller [7]. RNA ble ekstrahert fra cellelinjer og 20 sammenkoblet normal /tumoral vev fra kreftpasienter med RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc.) i henhold til produsentens protokoll. Den ekstraherte RNA ble kvantifisert med en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies Inc.).
I alt 15 forskjellige antistoffer ble brukt, inkludert proteiner knyttet til FGFR4 signalveien og kontroll proteiner. Source, klonalitet, og vilkårene for bruk for hvert tilfelle og teknikk er spesifisert i tabell S1. FGFR4-spesifikt polyklonalt antistoff (sc-124, Santa Cruz Biotechnology) og kontroll GST-spesifikt polyklonalt antistoff fra GE Healthcare ble anvendt for FGFR4-målretting eksperimenter. FGFR-inhibitorer ble PD173074 (Sigma) og TKI-258 (Novartis). PD173074 er en pan-FGFR inhibitor som induserer apoptose [33]. TKI-258 er en klinisk relevant, multi-kinase inhibitor, inkludert VEGFR og PDGFR kinaser blant annet [34]. Andre hemmere var: PP2 (Sigma) for SRC, JNK Inhibitor II og UO126 (Calbiochem) for MEK1 /2. De ble brukt på 3 mikrometer og 15 mikrometer som tidligere rapportert [35].
vektorer, shRNAs, sirnas og transfections
PRS vektorer som inneholder spesifikke shRNAs (TI378641, TI378642, TI378643 og TI378644) for FGFR4 (NM_022963) og en kontrollgruppe shRNA ikke-effektiv mot alle menneskelige sekvens (TR30003) var fra Origene. Stabilt-transfekterte celler ble oppnådd ved retroviral infeksjon. Kort fortalt ble HEK293FT celler transfektert med PRS vektorer og pNGVL-gag-pol og pNGVL-VSVG emballasje vektorer ved hjelp jetPRIME Transfeksjon Reagens (Polyplus). Etter inkubering av cellene i 12-15 h i serumfritt medium, ble mediet erstattet med DMEM inneholdende 10% FBS og penicillin /streptomycin. Dagen etter, medier som inneholder lentiviral partikler ble sentrifugert, fortynnet 1:02 til 1:10 i DMEM inneholder 10% FBS og antibiotika og direkte lagt til SW480 og SW48 tykktarmskreftceller. Etter tre dagers inkubasjon, infisert SW480 og SW48 kolorektal kreft celler ble selektert ved anvendelse av 1 ug /ml puromycin (Sigma) i 2-3 uker. Deretter ble cellene dyrket med 0,5 ug /ml puromycin.
FGFR4 sirnas og kontroller ble innkjøpt fra Sigma. For transfeksjoner siRNA, 5 x 10
5-celler ble sådd ut på kulturplater og holdt i DMEM med 10% føtalt kalveserum ved 37 ° C i 5% CO
2 i 24 timer. -Celler ble transfektert med 55 pmol siRNA ved bruk av 2 ul JetPrime Transfeksjon-reagens i 200 pl JetPrime buffer. Så, 48 timer etter transfeksjon ble cellene analysert ved western blot og semi-kvantitativ PCR [35].
Sekvensanalyse, Semi-kvantitativ og Real-time kvantitativ PCR
cDNA ble syntetisert ved hjelp den Hevet III First Strand Synthesis sett (Invitrogen). Primerne anvendt for å få den FGFR4 sekvensen ble tidligere beskrevet [36]. I korte trekk ble fire par av primere (A, B, C og D) som brukes til å få hele molekylet ved hjelp av PCR i fragmenter med omtrent 1000 bp ved hjelp av Advantage 2-polymerase (Clontech). Eksonuklease I (USB) og reke alkalisk fosfatase (USB) ble tilsatt til PCR-produktene. De ble sekvensert direkte i en ABI7002 sequencer (Applied Biosystems).
cDNA ble syntetisert som før og anvendt direkte for semi-kvantitativ PCR-analyse av TGF-ß1 og GAPDH mRNA-nivåer i kolorektale cancercellelinjer. PCR-reaksjoner ble utført ved å bruke de følgende primere; human TGF-β1, ane 5′-ACCGGCCTTTCCTGCTTCTCA-3 «, antisense-5′-CGCCCGGGTTATGCTGGTTGT-3′; human GAPDH, følelse, 5»-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3 «, antisense-5′-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3». Spesifikke primere for FGFR1-3 brukes til å teste spesifisiteten av shRNAs og sirnas rettet mot FGFR4 ble: FGFR1, avføle 5′-CACAAGCCACGGCGGACT-3 «, antisense-5′-TGATGCTCCAGGTGGCAT-3′; FGFR2, fornemme 5»-CGTTGCCATTCAAGTGACTG-3 «, anti 5’GACAAAATCTTCCGCACCATC-3»; og FGFR3, følelse 5’CAGTTGGTCTTCGGCAGC-3 «, anti 5′-TGCTGCCAAACTTGTTCT-3».
For QRT-PCR, ble reaksjonene utført ved hjelp av tidligere beskrevne EMT markør primere [37] og SYBR-Grønn Master PCR mix (Applied Biosystems), in triplo. PCR og datainnsamling ble utført på IQ5 (BioRad). Alle quantitations ble normalisert ved hjelp av menneskelig GAPDH. For semi-kvantitativ PCR, ble D primerpar benyttet for å bestemme mengden av FGFR4 cDNA, ved hjelp av GAPDH-amplifikasjon med spesifikke primere, idet styre [36].
Western Blot analyse
Protein ekstrakter fra kolorektal kreft celler ble utarbeidet og kvantifisert med 2D-Quant kit (GE Healthcare) i henhold til tidligere publiserte protokoller [7]. Deretter, 25 ug av hvert proteinekstrakt ble kjørt i parallell ved bruk av 10% SDS-PAGE. For immunoblotting ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner (Hybond-C ekstra) ved hjelp av en halvtørr utstyr (Bio-Rad). Etter blokkering, ble membranene inkubert med spesifikke mono- eller polyklonale antistoffer mot de utvalgte proteiner. Membranene ble inkubert ved optimaliserte fortynninger med primære antistoffer etterfulgt av inkubasjon med enten HRP-anti-mus IgG (Pierce) ved 1:5000 fortynning eller HRP-anti-kanin-IgG (Sigma) ved 1:5000 fortynning. Spesifikke reaktive proteiner ble visualisert med SuperSignal West Pico maksimal følsomhet substrat (Pierce). Overflod av proteiner i Western blot analyser ble bestemt ved densitometri hjelp Antall En 1D Analysis Software v4.6 (Bio-Rad Laboratories).
celle adhesjon, Invasion, apoptose Detection, spredning, og Wound Healing Analyser
For celle adhesjon analyser, ble 96-brønners plater belagt med Matrigel (0,4 pg /mm
2) (BD Biosciences) i belegningsbuffer (0,1 M NaHCO
3 pH: 8,8) over natten ved 4 ° C og, deretter, inkubert med adhesjon medium (0,5% bovint serumalbumin i serumfritt DMEM) i 2 timer ved 37 ° C for å blokkere uspesifikk binding. Cellene ble sultet uten serum i 5 timer og merket med BCECF-AM (Molecular Probes) i løpet av 30 minutter ved 37 ° C, frittliggende med 2 mM EDTA i PBS og resuspendert i adhesjon medium. Deretter ble 10
5-celler tilsatt i triplikat til platene og inkubert i 30 min. For å fjerne ikke-adherente celler ble platene vasket to ganger med DMEM. Bundet cellene ble lysert ved hjelp av 1% SDS i PBS og fluorescens kvantifisert i en Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Scientific). For Matrigel invasjons assays, 8 x 10
5 SW480 eller SW48-celler ble resuspendert i invasjon medium (serumfritt DMEM inneholdende 0,5% BSA) og applisert på 8 pm pore-størrelse filtre belagt med 35-50 pl av 1 :3 fortynning av Matrigel (BD Biosciences) i Transwells (Costar). De lavere avdelinger av invasjons kamre ble fylt med medium som inneholdt 10% FBS (Gibco). Etter 22 timers inkubering ved 37 ° C, ble ikke-invaderende celler fjernes fra den øvre overflaten av filteret, og cellene som migrerte gjennom filteret ble fiksert med 4% paraformaldehyd (Sigma), farget med krystallfiolett og invaderende celler tellet under et mikroskop. For sårheling, ble SW480 og SW48-celler sådd ut i triplikat ved en tetthet på 10
6-celler per brønn i 24-brønners plater. Etter festing, ble en 1 mm bred sår produsert i cellemonolaget ble vekstmediet erstattet og et bilde ble tatt (dag 0) i et Olympus CK40 mikroskop utstyrt med et Olympus DP12 kamera ved 40 x forstørrelse. Bilder av det samme feltet ble tatt hver 24 timer.
For apoptose deteksjon analyser ble cellene inkubert med 1 mM H
2o
2 i 16 timer uten serum. Deretter ble cellene frittliggende og inkubert med FITC-merket-Annexin V (Miltenyi Biotec Inc.) og propidiumjodid- i henhold til produsentens anvisninger, og analysert ved cytofluorometri (Coulter Epics XL). For celleproliferasjonsprosesser analyser, ble eksperimenter utført følgende etablerte prosedyrer [38], [39]. I korthet, ble vekstmediet forandret 24 timer etter utsåing (dag 0), og cellene ble videre inkubert i løpet av tre dager. Deretter ble mediet fjernet og cellene ble farget med 100 ul av det kromogene fargestoff-3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (Sigma) ved en sluttkonsentrasjon på 1 mg /ml i DMEM . Cellene ble så inkubert i 1 time ved 37 ° C og 5% CO
2. Deretter medium ble forsiktig aspirert, og 100 ul av DMSO (Sigma) ble tilsatt til hver brønn for å forstyrre cellene. Absorbans ble avlest ved 570 nm. Alle forsøkene ble utført tre ganger in duplo. For reduksjon av proliferasjon ble cellelevedyktigheten representert å sammenligne effekten av anti-FGFR4 eller anti-GST (som kontroll) antistoffer eller spesifikke inhibitorer sammenlignet med ubehandlede celler (100% av proliferasjon) inkubert under de samme betingelser [39].
konfokalmikroskopi
Celler ble fiksert med 1% paraformaldehyd og permeabilised med PBS-0,5% Triton X-100 før inkubasjonen med FGFR4 spesifikke antistoff eller TRITC-phalloidin i 1 time ved 37 ° C . FGFR4 eller E-cadherin antistoffer ble detektert med AlexaFluor 488-merket anti-kanin IgG antistoff. Celler ble observert med en konfokal mikroskop (TCS-SP5-AOBS-UV, Leica-Microsystems) etter kjernen kontra med DAPI. Bilder ble kjøpt med en 63 × oljeneddyppingsobjektivet bruker Leica Confocal Software. Viste bilder ble tatt på samme delene i de ulike prøvene.
In vivo
tumorxenotransplantater
Swiss hårløse mus (Charles River) ble brukt for metastase og tumor xenograft studier . Etisk komité i Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, Spania) godkjent protokollene som brukes for eksperimentelt arbeid med mus.
For tumorxenotransplantater, ble musene injisert subkutant i høyre flanke ved hjelp av 1 x 10
7 SW48 stabilt transfektert med kolorektal kreft celler i 0,2 ml PBS i Matrigel fortynnet 1:03. Tumor størrelser ble overvåket minst to ganger i uken, og hvert dyr ble avlivet ved hjelp av en CO
2 kammer i henhold til de retningslinjer for menneske endepunkter for Animal bruk i biomedisinsk forskning.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser, mindre annet er angitt, ble gjort med Microsoft Excel. Data er presentert som median ± standardavvik. For vurdering av statistisk signifikans sammenlignes mellom grupper alle
p
verdier ble avledet fra en to-tailed statistisk test med 95% konfidensintervall.
p
verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
FGFR4 mutasjonsstatus i tykktarmskreft cellelinjer og vevsprøver
undersøkt FGFR4 mutasjoner. i kolorektal kreft cellelinjer og kreftprøver som kan bidra til antistoff anerkjennelse ved overekspresjon eller aktivering. Totalt RNA ble isolert og cDNA syntetisert ved retrotranscription. cDNA ble anvendt som templat for å bestemme tilstedeværelsen av mutasjoner.
I alt fant vi 3 SNP’er i FGFR4 cDNA i 4 kolorektal kreft-cellelinjer og 20 cancerprøver (tabell 1 og fig S1). Vi observerte tre mutasjoner i ekstracellulære og transmembrane domene av FGFR4 i pasientprøver. I tillegg til godt karakterisert Arg
388 SNP [9], [15], har vi funnet V10L lokalisert i signal-peptidet og P136L mellom immunoglobulin-domener 1 og 2 (figur S1). Disse to SNPs har tidligere blitt rapportert uten sammenheng til patologiske manifestasjoner [40], [41]. I KM12C og KM12SM tykktarmskreftceller, observerte vi nærvær av det Arg
388 SNP, mens SW480 og SW48 ikke inneholdt dette SNP. I 20 kolorektal kreft prøver, 60% av pasientene polymorfismen Arg
388, mens forekomsten av de to andre mutasjoner var 55% for P136L og 15% for V10L. Disse dataene er i samsvar med tidligere publiserte data, der 50% av tumorer presentere Arg
388 SNP, 53% av polymorfisme P136L og 30% av svulstene inneholder V10L [9].
Vi fant ikke noen aktivering mutasjon i FGFR4 eller nukleotid endring av tidligere rapportert for FGFR4. Deretter er disse data tyder på at økt uttrykk av FGFR4 kunne være ansvarlig for autoantistoff induksjon i CRC pasienter og høyere invasjon og metastasering i tykktarm kreft.
FGFR4 knockdown redusert heft, migrasjon og invasjon av tykktarmskreft celler
for å studere rollen til FGFR4 overekspresjon i tumorigenesis og metastaser, studerte vi effekten av FGFR4 uttrykk i SW48, SW480 og SW620 tykktarmskreft cellelinjer, som ikke inneholdt den Arg
388 polymorfisme. SW480 og SW48 celler ble stabilt transfektert med fire shRNAs rettet mot FGFR4 pluss en kontroll egge shRNA. SW620 celler ble transient stilnet med siRNA. shRNA # 41 viste den høyeste reduksjon i FGFR4 proteinekspresjon (figur 1A) og mRNA-nivåer (figur 1B) i begge celletyper. shRNA # 44 var også effektiv i å redusere proteinekspresjon, særlig i SW48-celler. Liknende reduksjonsnivåer ble oppnådd med forbigående siRNA stanse i SW620 celler. For å studere effekten av FGFR4 stanse på andre familiemedlemmer, gjennomførte vi RT-PCR. mRNA nivåer for FGFR1, FGFR2, og FGFR3 forble uendret etter FGFR4- stanse, bekrefter spesifisitet for FGFR4 (Fig. 1B). Immunofluorescens-analyse viste at FGFR4 ekspresjon ble betydelig redusert i SW480 og SW48 etter transfeksjon med shRNA 41 vektorer, selv om noe rest farging ble observert i kjernen av SW48-celler (figur S2).
Fire shRNAs rettet mot forskjellige eksoner av FGFR4 og en egge shRNA ble brukt for å få stabilt transfekterte kolorektal kreftceller etter valget med puromycin. I tillegg ble forbigående siRNA FGFR4-stanse utført i SW620 kolorektal kreftceller. A. Western blot-analyse av FGFR4 ekspresjon i stabilt transfekterte SW480 og SW48 cellelinjer, og transient transfektert SW620-celler. Tubulin ble brukt som lasting kontroll. B. Semi-kvantitativ PCR-analyse av FGFR1, FGFR2, FGFR3, og FGFR4 uttrykk å bruke spesifikke primere i tre forskjellige cellelinjer. GAPDH ble anvendt som kontroll. C. Proliferasjon ble bestemt ved MTT-analyser etter 24 timer i kultur. Optisk tetthet ble betydelig redusert med FGFR4 knockdown (*, p 0,01; **, p 0,001). D. Egge og forstummet cellene ble dyrket fram til samløpet og deres trekkende evner ble analysert i en sårhelende analysen hver 24. time inntil samløpet. Representative bilder av sårhelende analyse er vist. Migrasjon hastighet (im /h) av egge og FGFR4-forstummet celler ble beregnet som avstanden dekket i 96 timer. E. Cell vedheft til Matrigel av FGFR4-forstummet eller egge celler, etter sultne celler i 5 timer i medium alene. F. SW480 og SW48 egge celler viste ca 2 ganger høyere invasjon enn shRNA # 41 FGFR4 stabilt-transfekterte celler. Data for alle forsøkene representerer gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter.
p
verdier av alle forsøkene er vist.
Å vurdere tumorigene egenskaper, bestemt vi cellevekst, adhesjon, migrasjon og invasjon av FGFR4-forstummet celler. Ved hjelp av MTT-analyser, FGFR4-forstummet SW480 eller SW48 celler viste en redusert spredning hastighet i forhold til egge celler (figur 1C). For å undersøke effekten av FGFR4 om migrasjon, FGFR4-forstummet SW480 og SW48 cellelinjer ble sådd i 24-brønners plater og analysert ved sårheling analyser. FGFR4-silenced cellene ikke var i stand til å lukke såret selv etter 96 timer (figur 1D). Den tilbakestående migrasjon var viktigere for SW48 (3 ganger) enn SW480 celler (2 ganger). Disse resultatene er lik de som tidligere er rapportert ved bruk av to forskjellige CRC-cellelinjer, HCT116 og HT29, og forskjellige analyser [15].
I tillegg, ved bruk av Matrigel-analyser, var det en viktig reduksjon i adhesjon og invasjon kapasitet av FGFR4-forstummet celler i begge cellelinjene. SW480 celler redusert deres adhesjon kapasitet i 2,5 ganger, mens SW48 celler viste nesten fire ganger reduksjon i forhold til egge celler (figur 1E). Invasion ble ca. 2 ganger redusert med FGFR4 knockdown i begge cellelinjer (figur 1F). Sammen er disse dataene støtter en viktig rolle FGFR4 i tumorigenesis og invasjon av tykktarmskreft, som er mer relevant for metastatiske SW48 celler.
FGFR4 Dempe Redusert uttrykk for Inducere av Mesenchymale Phenotype
Siden celle adhesjon, migrasjon og invasiv kapasitet på epitelceller er knyttet til den epiteliale-mesenchymale overgang (EMT), bestemte vi oss for å undersøke endringer i EMT indusere. Etter FGFR4 stanse, studerte vi endringer i mRNA uttrykk nivåer av Snail1 (SNA1), TWIST1, ZEB1, og E-cadherin (CDH1) ved real-time PCR eller semi-kvantitativ PCR (TGFβ1). I SW480 og SW620, FGFR4 knockdown forårsaket en betydelig nedgang i EMT indusere TGFβ1, SNA1 og TWIST ledsaget av en stor økning i epitel markør CDH1 (figur 2A, B). SW48 celler viste en større reduksjon i SNA1, TGFβ1 og TWIST1and en mindre økning i CDH1. ZEB1 nedgangen var større betydning i SW480 enn i de metastatisk cellelinjer SW620 og SW48. Epiteliale og mesenkymale markører ble analysert på proteinnivået ved western blot. Snail og E-cadherin bekreftet mRNA resultater. Vimentin, en mesenchymale markør, ble redusert etter FGFR4 stanse i de tre cellelinjer (figur 2C). Kun mindre endringer i MT1-MMP uttrykk ble påvist i SW480 og SW48 celler etter FGFR4-demping. Imidlertid observerte vi en stor økning av MT1-MMP ekspresjon i SW620-celler, som er en parallell til uttrykket nivåer av E-cadherin som indikerer en reduksjon av mesenchymale fenotype.
A. cDNA syntetisert fra total RNA fra stabilt og forbigående-forstummet og kontrollceller ble utsatt for QRT-PCR med spesifikke primere for EMT indusere SNAI1, TWIST1, ZEB1 og CDH1, bruker GAPDH for normalisering. Data representerer median ± SD av to eksperimenter. B. Samme cDNA ble underkastet semikvantitativ RT-PCR-analyse for å forsterke TGFβ1, ved hjelp av GAPDH som kontroll. C. SW480 og SW48 kryptert og FGFR4-silenced cellene ble lysert og utsatt for WB analyse ved hjelp av spesifikke antistoffer mot de indikerte proteiner og EMT markører. Den mengde av hvert protein ble kvantifisert ved densitometri. Tubulin ble brukt som lasting kontroll. D. Immunofluorescensanalyse av E-cadherin i egge og forstummet SW480 og SW48 celler. DAPI ble brukt for kontra av kjernen i blått. E-cadherin farging var i grønt.
Økningen i E-cadherin uttrykk, etter FGFR4 knockdown, i adherens kryss og celle-celle kontakter ble bekreftet av immunfluorescens (figur 2D). Forskjellene i E-cadherin ekspresjon var mer tydelig i cellemembranen, noe som tyder på at FGFR4 stanse lettes ekspresjon av funksjonell E-cadherin på celleoverflaten og tilbakeføring til en epitelial fenotype. Sammen er disse data ved hjelp av tre ulike kolorektal kreft cellelinjer bekrefte at FGFR4 er en viktig effektor i EMT. FGFR4 knock-down provoserer en reduksjon i sneglen og en økning i E-cadherin med påfølgende effekt på adhesjon, migrasjon og invasjon.
Signale Analyse i FGFR4-forstummet Cells. Rollen til FGFR4 i Cell Survival
For å bestemme effekten av FGFR4 aktivitet på nedstrøms signalering, analyserte vi effekten av FGFR4-lyddemping på signalveier etter aktivering med FGF19 ± heparin sammenlignet med serumfritt medium. Etter FGFR4 knockdown, aktivering av phosphoSRC, phosphoERK1 /2 og phosphoAKT var betydelig lavere i SW480 og SW48 (figur 3A). ERK1 spesielt viste en nesten fullstendig reduksjon. Angå AKT, foreslår denne effekten en effekt mediert av FGFR4 gjennom AKT på EMT og celle overlevelse. For å teste effekten av FGFR4 på overlevelse ble cellene utsatt for apoptose fremkalt av hydrogenperoksyd. FGFR4-stilnet celler viste en signifikant reduksjon på 20-30% i overlevelse sammenlignet med egge celler etter hydrogenperoksidbehandling (figur 3B). Uten behandling, egge og FGFR4-forstummet SW480 og SW48 kolorektal kreft celler viste tilsvarende nivåer av apoptose. Dette FGFR4 effekt på celle apoptose som svar på oksidativt stress kan spille en rolle i avansert kolorektal kreft, tilrettelegging overlevelsen av metastatisk kolorektal kreft celler.
A. Eggerøre og FGFR4-forstummet SW480 og SW48 celler ble sultet, og inkubert med FGF19, heparin, eller FGF19 pluss heparin i 30 min i DMEM. Deretter ble cellene lysert og underkastet WB analyse ved bruk av spesifikke antistoffer mot fosforylert og total AKT, ERK1 /2 og SRC. Tubulin ble brukt som lasting kontroll. B. Celler ble inkubert i DMEM supplert med 10% FBS og antibiotika i nærvær eller fravær av H
2o
2 til 16 timer, og underkastet apoptose deteksjons analyser. Unt., Ubehandlede celler. Dataene viste resultatene for en representativ eksperiment ut av tre. C. invasjon over Matrigel av egge og forstummet celler behandlet med inhibitorer mot MEK1 /2 (UO126), JNK, og SRC (PP2) som angitt. Data representerer gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter.
For å studere en synergistisk effekt å forbedre FGFR4 hemming på signalveier i celle invasjon, brukte vi spesifikke hemmere på målrettede og egge celler. UO126 (a MEK1 /2 inhibitor oppstrøms av ERK1 /2) og PP2 (SRC-inhibitor) redusert invasjonen kapasitet av SW480 og SW48 celler. Denne reduksjonen var mye mer uttalt i egge enn i forstummet celler (Figur 3C). Den JNK inhibitor forårsaket bare en mindre effekt på invasjonen kapasitet på egge og forstummet SW480 og SW48 celler. Samlet indikerer disse resultater at FGFR4-knockdown forårsaket en signifikant reduksjon av SRC og MEK1 /2-ERK1 /2-mediert invasjon i SW480 og SW48 celler, ligner den som er forårsaket av spesifikke inhibitorer for eggecellene.
FGFR4 som terapeutisk mål i tykktarmskreft
Vi fulgte to ulike strategier for å bevise den terapeutiske verdien av FGFR4 i tykk- og endetarmskreft. Først testet vi to kinase hemmere PD173074 og TKI-258. Deretter brukte vi FGFR4-forstummet celler for å studere avhengighet FGFR4 for tumorvekst i mus xenografter. Metastatisk cellelinjer (SW48 og KM12SM), som uttrykker mer FGFR4, var mer følsomme for kjemiske hemmere enn dårlig eller ikke-metastaserende cellelinjer (KM12C, SW480) (Figur 4A). Multi-kinase inhibitor TKI var mer effektiv enn pan-FGFR hemmer PD for å redusere tykktarmskreft spredning på en doseavhengig måte (
p
verdi 0,001), særlig i metastatisk cellelinjer. Ved 80 nM konsentrasjon, inhibisjon var høyere hos pasienter med metastatisk kolorektal kreft cellelinjer (20% i SW48 og 60% i KM12SM) enn i ikke-metastatiske celler eller kontrollceller. I KM12-celler, TKI hemning var effektiv opp til 1 nM konsentrasjon. Referansecellelinje HEK293, som uttrykker lave nivåer av FGFR4, ble inhibert ved en lavere grad. Hemming av cellevekst ble forbundet med hemming av samme nedstrøms regulatorer berørt av FGFR4-signalveier (figur 4B). De største effektene ble oppnådd med TKI-258. Vi har observert en stor reduksjon (mer enn 90%) i SRC aktivering, en signifikant reduksjon (50-80%) i phosphoERK1 /2 og en svak reduksjon i phosphoAKT i begge cellelinjer (figur 4B). Nedgangen i aktivering av FGFR4-signalveier var lik den som er observert etter FGFR4-stanse, bekrefter implikasjon av FGFR4. For å bekrefte FGFR4 spesifisitet, brukte vi kommersielle anti-FGFR4 antistoffer på SW480 og SW48 tykktarmskreftceller. Vi har observert en signifikant inhibering av proliferasjon, doseavhengig, sammenlignet med kontroll-celler (
p
verdi 0,01) (figur S3).
