Abstract
Bakgrunn
Bevis innblandet diagnostisk betydning microRNAs i hele urin /urinsedimenter i urothelial carcinoma av blæren (UCB). Men de forurensede blodceller hos pasienter med haematouria vesentlig endret uttrykket profiler av urin mikroRNA, påvirke testen nøyaktighet.
Metoder
mikroRNA profiler av urin supernatanter av UCB pasienter og kontroller uten malignitet og profiler av ondartede og tilsvarende normal slimhinne vev fra pasienter ble bestemt av mikroRNA microarray og i forhold til å identifisere forskjellig uttrykt microRNAs. Differensial uttrykket ble bekreftet i vev av en uavhengig pasient kohort av RT-qPCR. Den diagnostiske betydning av utvalgte microRNAs som biomarkører i urin supernatanten ble undersøkt i de utvidede kohorter.
Resultater
mikroRNA-99a og mikroRNA-125b ble nedregulert i urinen supernatantene av UCB pasienter . Graden av nedregulering var assosiert med tumoren karakter. En diagnostisk modell ble utviklet ved bruk av en kombinert indeks av nivåene av mikroRNA-99a og mikroRNA-125b i urinen supernatanten med en følsomhet på 86,7%, en spesifisitet på 81,1% og en positiv forutsagt verdi (PPV) på 91,8%. Diskriminere mellom høy- og lav grad av UCB, modellen ved hjelp av nivået av mikroRNA-125b alene viste en sensitivitet på 81,4%, en spesifisitet på 87,0% og en PPV på 93,4%.
Konklusjoner
resultatene viste et unikt mikroRNA uttrykk signatur i urinen supernatantene til UCB pasienter for utviklingen av molekylære diagnostiske tester. En effektiv cellefrie urin mikroRNA-baserte modellen ble utviklet ved hjelp av en kombinert indeks over nivåene av mikroRNA-99a og mikroRNA-125b å oppdage UCB med god diskriminerende effekt, høy følsomhet og høy spesifisitet
Citation. Zhang DZ, Lau KM, Chan ESY, Wang G, Szeto CC, Wong K, et al. (2014) Cell-Free Urin mikroRNA-99a og mikroRNA-125b Er diagnostiske markører for ikke-invasiv Screening av blærekreft. PLoS ONE 9 (7): e100793. doi: 10,1371 /journal.pone.0100793
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA
mottatt: 11 februar 2014; Godkjent: 29 mai 2014; Publisert: 11.07.2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den direkte Grant for forskning (2009.1.096), det kinesiske universitetet i Hong Kong. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
urothelial carcinoma av blæren (UCB) er den nest vanligste kreftformen i urinveiene [1]. På grunn av sin høye forekomsten og hyppige tilbakefall, effektive diagnostiske og sykdom overvåking verktøy er avgjørende for den kliniske behandlingen av pasienter. Cystoskopi er i dag standard klinisk test for diagnose og kreft overvåking. Imidlertid er fremgangsmåten invasiv og ubehagelig, og har flere praktiske begrensninger. For eksempel kan det ikke være i stand til å oppdage små og /eller flate svulster som carcinoma
in situ
. Derfor er en alternativ ikke-invasiv metode som utviser høy spesifisitet og sensitivitet som kreves. Selv om mange blod- og urinbaserte biomarkører er identifisert og evaluert i litteraturen, har ingen vært ideelt og kraftig nok til å erstatte cystoskopi [2].
microRNAs, som er små ikke-kodende RNA, har nylig demonstrerte betydelig diagnostisk og prognostisk verdi i ulike typer av kreft [3] – [5]. MicroRNAs oppviser høy stabilitet og lett detekterbarhet selv ved lave nivåer i forskjellige typer av kliniske prøver [6] – [8]. Det er ansett som et utmerket sykdom biomarkør for påvisning og overvåking. En studie viste at et antall microRNAs ble avvikende uttrykt i UCB tumorvev, og at disse avvikene kan være engasjert i diagnose og oppsetningen av blærekreft biopsier [9]. I tillegg er vurderingen av nivåene av disse avvikende uttrykt microRNAs som viser unike signatur i hel urin eller urin ekspandert celler enda mer lovende for diagnose og overvåking av sykdom UCB [10] – [11]. Men resultatene er ofte upålitelige når studere pasienter med hematuri, i hvem forurensede blodceller signifikant påvirker urin mikroRNA profiler og dermed maskere signaturer. Faktisk er 85% av pasientene oppviser varierende grader av hematuri [12] – [13]. Som et resultat, er en alternativ metode for å måle microRNAs nødvendig. Bevis har antydet at frie nukleinsyrer, slik som DNA biomarkører i urin supernatanter, gi en høyere deteksjonshastighet og høyere følsomhet enn de i sedimentet for UCB diagnose [14] – [16]. Derfor, vurdering av innholdet av microRNAs i urinen supernatant kunne forbedre bruken av microRNAs som diagnostiske markører for deteksjon av UCB, spesielt hos pasienter med hematuri. I denne studien ble muligheten for å bruke cellefrie urin microRNAs for diagnostisering UCB ble bestemt og modeller for diagnostisering UCB og diskriminerende tumor karakterer utviklet.
Metoder
Pasient og prøver
En oversikt over denne studien er vist i figur S1. Med skriftlig samtykke fra giverne og godkjenning av Joint kinesiske universitetet i Hong Kong – New Territories East Cluster Klinisk forskningsetiske komité, vev og urinprøver ble samlet i Urologi Unit, Kirurgisk avdeling, Prince of Wales Hospital, Hong Kong . Mid-stream urin ble samlet inn fra blærekreftpasienter før operasjonen. Både tumorvev og normal slimhinne blære plassert 3 cm fra kanten tumor ble oppnådd ved systoskopi. 1973 WHO diagnose og karaktersystem for blærekreft [17] ble brukt for diagnostisering. For den vanlige kontrollene, ble urinprøver innsamlet fra pasienter som hadde normale cystoskopisk funn, fravær av malignitet med a 6 måneders oppfølging og hematuri. Alle urinprøver ble sentrifugert ved 2500 r.c.f. i 20 minutter og urin supernatantene ble samlet.
mikroRNA microarray
Den totale RNA av urin supernatantene og frosset vev ble ekstrahert med MirVanaPARIS Kit (Ambion) i samsvar med produsentens anbefalte protokoller . Agilent menneskelige miRNA microarray Chip (Slipp 13,0, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), som omfatter 866 menneskelige microRNAs og 89 virus microRNAs, ble brukt til å profilere uttrykk for disse microRNAs i urinen supernatantene og kreft og kontroll vev. Datasettet ble avsatt til ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) og tiltredelse tallet er E-mtab-2573. Signalstyrken for hver flekk var median-normalisert og ytterligere normalisert ved lineær regresjon.
Revers transkripsjon-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR)
Første kjede-cDNA ble syntetisert fra den totale RNA av urin supernatantene og vevsprøver ved hjelp av en universell cDNA syntese kit (Exiqon, Vedbæk, Danmark) i samsvar med produsentens anbefalte protokoll. Det resulterende cDNA ble underkastet kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) med SYBR grønn konsentrat-blanding og mikroRNA LNA PCR-primer (Exiqon) som spesifikt gjenkjennes målrettet mikroRNA i en ABI 7900HT hurtig RT-qPCR maskin (Applied Biosystem /Life Technologies, Grand Island , NY, USA). RNU6B ble anvendt som referansekontrollen. Alle prøvene ble testet i duplikat. Den relative nivået av mikroRNA ble bestemt ved hjelp av ΔΔC
q metode.
Statistiske metoder
De microarray data ble analysert ved hjelp av Gene Spring 11,0 programvare (Agilent) for å normalisere og identifisere forskjellig uttrykt microRNAs. ABI SDS 2.3 programvare (ABI /Life Technologies) ble brukt til å analysere RT-qPCR data. De kvantitative data ble utsatt for en Mann-Whitney U-test og en Wilcoxon signed-rank test ved hjelp av SPSS 16.0 programvaren (IBM Co, Armonk, NY, USA). I påfølgende post-hoc analyse, ble en bivariat logistisk regresjonsanalyse utført for å bestemme Kombinert Index (CI) for kombinasjonen av to microRNAs uttrykk nivåer. En mottaker som opererer karakteristikk (ROC) kurve analyse ble utført ved anvendelse av SPSS 16,0 programvare. Følsomhet, spesifisitet, positiv og negativ prediktiv verdi, og positive og negative sannsynligheten forhold ble beregnet.
Resultater
Identifikasjon av forskjellig uttrykt microRNAs mellom urin supernatantene av UCB pasienter og kontroller, og mellom kreft og normalt vev av mikroRNA microarray
Urin supernatanter fra seks UCB pasienter og tre normale kontroller sammen med fire par UCB vev og deres tilsvarende normal blæreslimhinnevevet ble utsatt for mikroRNA microarray analyse. Pasientkarakteristikker er vist i tabell 1. For å bestemme nærvær og fravær av microRNAs i prøvene, ble en terskelsignal definert som den gjennomsnittlige bakgrunn pluss tre standardavvik. Signaler over denne terskelen ble betraktet som en «nærvær» og signaler under terskelen ble ansett som en «fravær.» Etter at den globale normalisering, 117 ± 63,8 med 866 humane microRNAs ble påvist i urinen supernatantene og 314 ± 83,4 microRNAs ble detektert i blæren vev. Det var ingen signifikant forskjell i det totale antall microRNAs detektert mellom urin supernatantene fra kreftpasienter og kontroller og mellom kreft og kontroll vev. Sammenligning profilene i urinen supernatantene av UCB pasienter med de av de vanlige kontrollene, 39 microRNAs viste differensial uttrykk (Mann-Whitney test, p 0,05; fold forskjeller 1,60). Det var 78 forskjellig uttrykt microRNAs mellom kreft og normalt vev (parret Mann-Whitney test, p 0,05; fold forskjeller 2,0). Ti microRNAs ble allment dysregulerte i begge urin supernatantene og vevsprøver (Figur 1 og Figur S1). Av disse nivåene av mikroRNA-en, mikroRNA-99a, mikroRNA-125b, mikroRNA-133a, mikroRNA-133b, mikroRNA-143 og mikroRNA-1207-5p betydelig redusert og de av mikroRNA-16, mikroRNA-96 og microRNA- 183 økte i UCB prøvene (figur 1).
(A) Varme kart over nivåene av 10 utvalgte microRNAs i ni urin supernatantprøver og fire par av vevsprøver. Den totale RNA ble ekstrahert og utsatt for mikroRNA microarray analyse ved hjelp av en Agilent Menneskelig mikroRNA Microarray Chip. Signalstyrken for hver flekk var median-normalisert og ytterligere normalisert ved lineær regresjon. De normaliserte signalintensitetene for hver mikroRNA i urinen supernatanten og prøver av UCB pasienter og kontroller vev er presentert. (B) Scatter plott av de normaliserte signal følsomhet for de 10 utvalgte microRNAs. A Mann-Whitney U-test ble utført for å sammenligne nivåene av microRNAs i urinen supernatanten fra UCB pasienter (TU) (n = 6) og betjeningsorganer (NU) (n = 3), og en sammenkoblet Mann-Whitney U-testen ble utført å sammenligne tumorer (TT) (n = 4) og deres tilsvarende normal slimhinne vev (NT) (n = 4) i UCB pasientene. En signifikansnivå på 0,01 ble brukt for alle sammenligninger. Stjerne (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,01).
Validering av 10 utvalgte microRNAs i selvstendige årskull av vev og urin supernatantprøver
For å validere microarray resultater, nivåene av de 10 utvalgte microRNAs ble kvantifisert ved RT-qPCR i ytterligere 18 par av blærekreft og tilsvarende normal slimhinne vev (tabell 1). Av disse differensial uttrykk for seks microRNAs mellom kreft og normalt vev ble validert (Wilcoxon signed-rank to-relaterte-samples test, p 0,05) (figur 2). MikroRNA-en ble nedregulert i alle 18 parene av kreft vev (p 0,01) og 17 av 18 par viste nedregulering (p 0,01) i de resterende fem microRNAs (mikroRNA-99A, mikroRNA-125b, microRNA- 133a, mikroRNA-133b og mikroRNA-143). MikroRNA-en, mikroRNA-99a, mikroRNA-125b, mikroRNA-133a, mikroRNA-133b og mikroRNA-143 ble nedregulert 266,87 ± 2.06, 130,69 ± 2,30, 49,52 ± 3,39, 263,20 ± 1.99, 261,38 ± 2,11 og 67,18 ± 1,83 ganger i kreftvev, henholdsvis.
Det totale RNA ble ekstrahert fra 18 par blærekreft vev og deres tilsvarende normale tilstøtende mucosa vev. Nivåene av disse microRNAs ble kvantifisert ved RT-qPCR i duplikat. De relative ekspresjonsnivåer (2-ΔCq) er presentert. En paret Mann-Whitney U-test ble utført for å sammenligne tumorer og deres tilsvarende normal slimhinne vev i UCB pasienter. Søyler, Midler; Barer, S.D .; n = 18. ** betyr p. 0,001
diskriminering kraft av de seks validerte microRNAs i urinen supernatantene ble deretter vurdert ved hjelp av 71 urin supernatantprøver, inkludert 50 prøver fra pasienter med blærekreft (15 tilfeller av lav grad av kreft og 35 tilfeller av høy klasse kreft) og 21 prøver fra kontroller (tabell 1). I denne utvidet sett av prøver, urin supernatantene av UCB pasienter besatt lavere nivåer av mikroRNA-99a (p 0,01), mikroRNA-125b (p 0,01), mikroRNA-133b (p 0,05) og mikroRNA-143 (p . 0,01) enn for kontrollene (figur 3a), men ikke av mikroRNA-133a og mikroRNA-en
Utvikling av cellefrie urin mikroRNA modeller for påvisning av UCB og diskriminering av tumor karakterer
ROC kurven var fast bestemt på å evaluere den diagnostiske styrken på disse microRNAs i å oppdage UCB. Høy areal under kurven (AUC) verdier ble funnet for mikroRNA-99a (0,800, som strekker seg 0,715 til 0,886) og mikroRNA-125b (0,813, som strekker seg 0,729 til 0,897) (figur 3B), mens mikroRNA-133b og mikroRNA-143 utstilt lav diagnostisk styrke med AUC-verdier rundt 0,6. For ytterligere å bestemme den diagnostiske betydning av mikroRNA-99a og mikroRNA-125b, ble knyttet loddepunkter bestemmes fra ROC-kurver basert på Youden-indeksen regelen. De loddepunktene for normaliserte uttrykk nivåer av mikroRNA-99a og mikroRNA-125b var 2
2,18 og 2
4,1, henholdsvis. En pasient med en urin supernatant som mikroRNA nivået var lavere enn eller lik cut-off point ble betraktet som en kreft saken, og anses normalt hvis nivået var høyere enn cut-off point. Ifølge dette systemet, sensitivitet, spesifisitet, positiv prediksjon verdi (PPV), negativ prediksjon verdi (NPV), positiv sannsynlighet (LR +) og negative sannsynlighet (LR-) for mikroRNA-99a var 78,0%, 85,7%, 92,7%, 61,0%, 5,46 og 0,26, henholdsvis, og for mikroRNA-125b var 84,8%, 76,2%, 89,3%, 68,1%, 3,57 og 0,20, henholdsvis (tabell 2). For å oppnå bedre diagnostiske resultater, ble en kombinasjon av de uttrykk for mikroRNA-99a og mikroRNA-125b kastet en bivariat logistisk regresjon. CI gjorde det bedre enn bruk av hver mikroRNA alene. AUC-verdien økte til 0,876. CI formelen var CI = 1 /{1 + exp [- (2,332 + 0,425 xΔCq
mikroRNA-125b + 0,069 xΔCq
mikroRNA-99a)]}. Når cut-off point ble satt til 0,6244 basert på Youden-indeksen regel prediksjon systemet forbedres med økt følsomhet (86,7%) og NPV (71,4%) og en redusert LR- (0,16), med sammenlignbare verdier for spesifisitet, PPV og LR + (tabell 2).
Den kliniske relevansen av de fire microRNAs valgte å diskriminere lavgradig fra høyverdig kreft ble også vurdert. Nivåene av urin mikroRNA-99a og mikroRNA-125b var signifikant lavere hos pasienter med høy grad av kreft (G2 og G3) enn hos dem med lav grad av kreft (G1) (Mann-Whitney U-test, p 0,01). Nivåene av mikroRNA-133b og mikroRNA-143 viste ingen svulst klasse diskriminering verdi (figur 3A). AUC-verdiene skille mellom høy og lav grad av kreft for mikroRNA-99a og mikroRNA-125b var 0,819 og 0,791, henholdsvis (figur 3B). De loddepunktene av normaliserte nivåer av mikroRNA-99a og mikroRNA-125b for svulst gradering var 2
1,71 og 2
0,91, henholdsvis. Basert på disse cut-off poeng, systemet med nivået av mikroRNA-99a viste en sensitivitet på 74,2%, en spesifisitet på 83,3%, en PPV på 91,5%, en nåverdi på 58,1%, en LR + på 4,46 og en LR- på 0,31. I tilfelle av mikroRNA-125b, disse verdiene var 81,4%, 87,0%, 93,4%, 67,0%, 6,11 og 0,21, henholdsvis, for skjeltumor karakterer (tabell 2). Når man kombinerer nivåene av mikroRNA-99a og mikroRNA-125b i systemet, ble CI formelen CI = 1 /{1 + exp [- (1,742 + 0.0295xΔCq
mikroRNA-125b + 0.496xΔCq
mikroRNA-99a )]}, med 0,7398 som cut-off point. Følsomhet, spesifisitet, PPV, NPV, LR + og LR- var 79,4%, 88,0%, 94,7%, 61,1%, 6,61 og 0,23, henholdsvis (tabell 2). Alle disse verdiene var enten sammenlignbare med eller lavere enn for de systemer som bruker enten mikroRNA-99a eller mikroRNA-125b alene. Tatt helt, systemet med mikroRNA-125b alene gjorde det bedre på å skille mellom høy og lav grad av UCB.
Sammenheng mellom uttrykk av mikroRNA-99a og mikroRNA-125b i urin supernatanter og blærekreft og kontroll vev
Via en Pearson korrelasjonsanalyse, de mikroRNA-99A og mikroRNA-125b nivåer i både vev og urin supernatanter av pasienter og kontroller var sterkt korrelert (R = 0,896, p 0,001 for vevsprøver, R = 0,982, p 0,001 for urin supernatantprøver) (figur 3C), noe som tyder på at deres uttrykk kan ha vært co-regulert. Faktisk ble disse genene gruppert på q21.1 regionen av kromosom 21 (figur 3D).
Restaurering av mikroRNA-99A og mikroRNA-125b uttrykk i postoperative pasienter
For å demonstrere den avgjørende koblingen mellom blærekreft status og redusert mikroRNA-99a og mikroRNA-125b nivåer i urinen supernatantene ble disse to microRNAs kvantifisert i urinen supernatantene av pre-operative og postoperative pasienter. Tjue pasienter ble rekruttert (tabell 1). Postoperativ urin ble samlet 4 uker etter en transuretral reseksjon. Etter reseksjon, pasientene var i stand til å gjenopprette mikroRNA-99A og mikroRNA-125b nivåer i urinen supernatanten (Wilcoxon signed-rank to-relaterte-samples test, p 0,01) (figur 4) til nivåer sammenlignbare med de av normale kontrollprøver (figur S2).
Den totale RNA ble ekstrahert fra urin supernatantene av UCB pasienter med lavgradig (n = 15) (skyggelagt bar) eller høy grad av kreft (n = 35) ( svart strek) og normale kontroller (n = 21) (hvit strek). Nivåene av seks microRNAs i prøvene ble kvantifisert ved RT-qPCR i duplikat. (A) De relative nivåene (2-ΔCq) av mikroRNA-133a, microRNA99a, mikroRNA-1, mikroRNA-143, mikroRNA-133b og mikroRNA-125b i urinen supernatantprøver er presentert. A Mann-Whitney U-test ble utført for å sammenligne UCB pasienter og normale kontroller. Søyler, Midler; Barer, S.D .; ** Betyr p 0,01; * Betyr p 0,05. (B) ROC kurver av mikroRNA-99a alene (blå linje), mikroRNA-125b alene (rød linje) og mikroRNA-99a og mikroRNA-125b i kombinasjon (sort linje) for diagnostisering av UCB (til venstre) og diskriminering mellom lav- og høy grad av svulster (til høyre). De loddepunktene ble satt og AUC-verdiene fastsettes basert på Youden-indeksen. (C) Resultater av en Pearson korrelasjonsanalyse av nivåene av mikroRNA-99a og mikroRNA-125b i vev og urin supernatantprøvene. Spredningsplott av de relative nivåer av disse to microRNAs i prøvene er presentert. Pearsons korrelasjonskoeffisient R ble beregnet ved hjelp av en Pearson korrelasjonsanalyse og p-verdien ble fastsatt. (D) Kromosom regioner av genene (
HSA-MIR-99a Hotell og
HSA-MIR-125b-2
). Human Genome Reference Consortium GRCh37 Patch Slipp 12 forsamlingen ble brukt.
Hsa-MIR-99a
ligger på kromosom 21: 17,909,409-17,913,489, og
HSA-MIR-125b-2
ligger på kromosom 21. 17,960,557-17,964,645
Urinprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble samlet inn fra 20 UCB pasienter før (pre-operative) og etter (postoperativ) transurethial reseksjon. Det totale RNA ble ekstrahert fra urinen supernatantene og underkastet RT-qPCR for å kvantifisere nivåene av mikroRNA-99a (til venstre) og mikroRNA-125b (til høyre). En Wilcoxon signed-rank to-relaterte-samples test ble utført for å sammenligne nivået av mikroRNA-99a og mikroRNA-125b mellom pre- og postoperative prøver. * Angir p. 0,01
Diskusjoner
Denne studien utviklet en effektiv cellefrie urin mikroRNA-basert modell for å avdekke UCB med god diskriminerende effekt (AUC = 0,876) og høy følsomhet (86,7%) og spesifisitet (81,1%). Muligheten for å bruke urin microRNAs som blærekreft diagnostiske biomarkører ble tidligere undersøkt. Forholdet mellom mikroRNA-126 til mikroRNA-152 i urinen ble undersøkt for å påvise UCB ved en sensitivitet på 82% og en spesifisitet på 72%, med en AUC verdi på 0,768 [7]. Ved å studere uttrykket nivåer av mikroRNA-96 og mikroRNA-183 i urin sediment, tester ved hjelp av disse to mikroRNA biomarkører uavhengig viste sensitivitet av 71% og 74%, spesifisitet av 89% og 77% og AUC-verdier på 0,8331 og 0,817, henholdsvis [ ,,,0],18]. Ved hjelp av KI på den mikroRNA-99a og mikroRNA-125b nivåer i urin supernatanten her betydelig forbedret effektiviteten av diagnostisk test for påvisning UCB. Videre er diagnostiske resultatene var bedre enn det kommersielt tilgjengelige urinbaserte biomarkører (tabell S1).
I motsetning til mRNA, som er utsatt for miljø RNase, microRNAs er relativt stabile i kliniske prøver. MicroRNAs forbli intakt selv under ugunstige forhold, for eksempel høye temperaturer, ekstreme pH-verdier og 10 fryse-tine sykluser [6]. Videre er de lett påvist i humant plasma eller serum ved hjelp av RT-qPCR, selv ved meget lave nivåer [7] – [8]. Tumorassosierte endringer i mikroRNA ekspresjonsprofiler i sirkulasjonssystemet har gitt en ny tilnærming for kreftdiagnose og prognose. I 2008 Lawrie et al. [19] rapporterte at en forhøyet mikroRNA-21 serumnivå var assosiert med tilbakefall overlevelse av pasienter med diffuse store B-celle lymfom. Ng et al. [20] viste den diagnostiske betydning av plasma microRNAs i kolorektal kreft screening. Disse studiene indikerte potensialet av sirkulerende microRNAs i serum /plasma som biomarkører for kreft gjenkjenning. I tillegg til serum /plasma, microRNAs er meget stabile i urin [17] – [18], og således påvisning av intakte microRNAs i urinen er lovende. Wang et al. [21] identifisert cellefrie urin mikroRNA-146a og mikroRNA-155 som effektive diagnostiske biomarkører for systemisk lupus erythematosus, implicating den kliniske betydningen av cellefrie urin microRNAs i sykdom diagnose og eventuelt prognose. Selv om utbyttet av microRNAs fra urin supernatanten relativt lavt sammenlignet med de fra hele urin eller urin sediment, er urin stående anses det beste valget som en biomarkør for sykdom diagnose og prognose [21]. Sammenligning nytten av urin DNA i supernatanten og sediment for UCB deteksjon, Szarvas et al. [11] samtidig analysert urin DNA i supernatanter og sediment i pasienter og sammenlignet dem med kontrollene. Resultatene indikerte at urin supernatantene ga høyere sensitivitet enn sedimentet [11]. Dette har trolig sammenheng med forurensning av blodceller i urinen prøver av hematuri pasienter. De forurensede blodceller kan ha endret urin mikroRNA /DNA-profiler i prøvene, og dermed forstyrret kreft påvisning klassifisering. I motsetning til dette, selv urin supernatanter fra pasienter med brutto hematuri var forholdsvis mer homogent uten forstyrrelser på grunn av de forurensede blodcellene i mikroRNA profilene. Derfor kan urin supernatanter gi mer praktisk, pålitelig prøver for kreftdiagnose og sykdomsovervåkning.
Urin mikroRNA profiler underkastes forskjellige modifikasjoner, slik som den direkte frigjøring av microRNAs fra cancervev, immunresponser mot kreft og blodcellene fra hematuri pasienter. En mulighetsstudie involverer en kandidat mikroRNA tilnærming ved qPCR ble gjennomført for å undersøke et lite panel av microRNAs i urinen supernatantene av blærekreftpasienter [22]. Her ble omfattende mikroRNA profiler oppnådd med mikroRNA mikromatriser av cellefrie supernatanter fra urin UCB pasienter og kontroller som ble bekreftet å ha noen cystological misdannelser eller andre samtidige maligniteter, og ble sammenlignet for å identifisere differensielt uttrykte cellefrie urin microRNAs for UCB. De microRNAs ble gjort et fokus på grunn av deres direkte utslipp fra kreftvev og nivåene av disse kandidater i kreftvev og deres normale motstykker ble sammenlignet for å validere vev. De microRNAs identifisert er sannsynligvis funksjonelt involvert i UCB utvikling og /eller sykdomsprogresjon. De kan brukes som biomarkører for påvisning og sykdom overvåking. De mikroRNA microarray Analyseresultatene indikerte tilstedeværelse av mer enn 100 microRNAs i urinen supernatantene. Blant disse var det flere nedregulert microRNAs enn oppregulert microRNAs i kreft pasientenes urin supernatanter. Dette funn var lik en tidligere funn at flertallet av differensielt uttrykte microRNAs i blærecancer vev ble nedregulert [23]. Disse nedregulert microRNAs kan spille kreft undertrykkende roller i kreftutvikling [24]. Den endrede ekspresjon av seks mikroRNA kandidater identifisert ved sammenligninger av urincellefrie mikroRNA profiler av UCB pasienter og kontroller ble også observert i blæretumorvevet i. Ved hjelp av et uavhengig sett av urinprøver ble nedregulert uttrykk for fire microRNAs bekreftet . Som tumorvev kan direkte utskiller microRNAs inn i pasientens plasma [25], er det sannsynlig at urin microRNAs er opprinnelig utskilles av blærekreft vev og /eller frigjort fra den nekrotiske /apoptotiske maligne og til og med ikke-maligne epitelceller, forme mikroRNA profilene av urin supernatanter. Således kunne de uttrykk mønstre av forskjellige microRNAs i blærecancerceller bli reflektert av deres urin supernatant profiler. Imidlertid kan ikke alle av de differensielt uttrykte microRNAs i kreftvev brukes som urin diagnostiske biomarkører for UCB. Uttrykk for mikroRNA-en og mikroRNA-133a ble tidligere rapportert å være nedregulert i blærekreft vev og viste funksjonell betydning i kreftutvikling via targeting TAGLN2 i kreftcellene [26]. I den foreliggende undersøkelse, ble deres nivå i urinen supernatant undersøkt, men ingen statistisk signifikant forskjell ble vist mellom kreftpasienter og kontroller. Dette kan innebære andre konfunderende faktorer som frigjøring av microRNAs fra normale urin epitelceller og immunceller forme mikroRNA profil i urinen supernatants å maskere differensial uttrykk for noen kreftrelaterte microRNAs.
Av de fire microRNAs , mikroRNA-99a og mikroRNA-125b hadde de største AUC-verdiene i ROC kurver for deteksjon og kunne fungere som diagnostiske biomarkører for blærekreft. De ble også funnet å være mer signifikant nedregulert i høyverdig UCB enn i lavgradig UCB. Etter en fullstendig transuretral reseksjon av svulstene, nivåene av tidligere nedregulert mikroRNA-99a og mikroRNA-125b i urinen supernatantene økt, impliserer en sterk sammenheng mellom deres nivåer og pasientenes tumor statuser. Dette støtter ytterligere sine potensielle roller som diagnostiske biomarkører for UCB og overvåking biomarkører for overvåking tumorresidiv. Basert på disse modellene, når en pasient har en positiv urin supernatant testresultat med en CI større enn cut-off (0,6244), har han eller hun sannsynligvis blærekreft, med en nøyaktighet på 91,8%. Dersom det normaliserte ekspresjonsnivået av mikroRNA-125b er lavere enn 2
1,71, det er en 93,4% sjanse for at pasienten har høy grad av kreft. Men fordi den negative forutsi verdien var 71,4% i denne studien, negative resultater kan ikke brukes til å utelukke muligheten for blærekreft hos pasienter.
Denne studien viste at nivåene av mikroRNA-99a og microRNA- 125b i urinen supernatanten fra UCB pasienter og kontroller ble sterkt korrelert med de i vevene. Faktisk, de to gener (
HSA-MIR-99a Hotell og
HSA-MIR-125b-2
) ligger i intron 6 av den lange intergeniske ikke-proteinkodende RNA 478 (
LINC00478
) i kromosom 21. Deres uttrykk er sannsynligvis co-regulert av arrangøren som styrer transkripsjon av
LINC00478
genet. Den underliggende mekanisme for nedregulering av disse to microRNAs i UCB kan være relatert til den ofte observerte tap av genomisk 21q i UCB. Tzai et al. [27] rapporterte et hyppig allelisk tap på 36,6% i den lange arm av kromosom 21, hvor de to gener befinner seg, i UCB. I tillegg har pasienter med Downs syndrom viste en redusert risiko for å dø av urologiske svulster, noe som tyder på tilstedeværelsen av gener i kromosom 21 undertrykke urologiske kreftsvulster [28].
mikroRNA-99a og mikroRNA-125b har vist seg å ha tumorundertrykkende roller i forskjellige humane cancere [29] – [34]. I prostata cancer, undertrykker mikroRNA-99a ekspresjonen av prostata-spesifikke antigener og prostatacancer celleproliferasjon ved å interferere med ekspresjonen av to kromatin remodeling faktorer, SMARCA5 (SWI /SNF-relatert matriks-assosiert aktin-avhengige regulator av kromatin underfamilie Et medlem 5) og SMARCD1 (SWI /SNF-relatert matriks-assosiert aktin-avhengige regulator av kromatin underfamilien D medlem 1), og vekstregulerende kinase mTOR (mammalian target rapamycin) [29]. Faktisk ble en høy ekspresjon av fosforylert mTOR funnet i 74% av muskel-invasiv urothelical karsinomer, i assosiasjon med økt sykdomsstadier og redusert sykdomsrelatert overlevelse [30]. Hemming av mTOR ble funnet å redusere
in vitro Hotell og
in vivo
blærekreft cellevekst [30]. Som mikroRNA-99a rettet mot mTOR i prostatakreftceller [29], den nedregulering av dette mikroRNA i UCB demonstrert i denne studien kan avskaffe tumorfremmende effekter av mTOR i cellene, noe som resulterer i kreftutvikling. Imidlertid er ytterligere demonstrasjon av reguleringen av mTOR av mikroRNA-99a i blæren kreftceller nødvendig.
