Abstract
Askorbinsyre (AA) viser betydelig anticancer aktivitet på farmakologiske doser oppnåelig ved parenteral administrasjon som har minimal effekt på normale celler. Således har AA potensielle anvendelser som et kjemoterapeutisk middel alene eller i kombinasjon med andre terapeutiske midler som er spesielt rettet kreftcellemetabolismen. Vi sammenlignet effekten av AA og kombinasjoner av AA med glykolyse inhibitoren 3- (3-pyridinyl) -1- (4-pyridinyl) -2-propen-1-on (3-PO) på levedyktigheten av tre ikke-liten celle lungekreft (NSCLC) cellelinjer til effekter på en udødelig epitelceller lungelinjen. AA-konsentrasjoner på 0,5 til 5 mM forårsaket en fullstendig tap av levedyktighet i alle NSCLC-linjer i forhold til en 10% tap av levedyktighet i epiteliale cellelungelinjen. Kombinasjoner av AA og 3-PO synergistisk øket celledød i alle NSCLC cellelinjer ved konsentrasjoner under IC
50 konsentrasjoner for hver forbindelse alene. En synergistisk interaksjon ble ikke observert i kombinasjonsbehandlinger lunge epitelceller og kombinasjonsbehandlinger som forårsaket en fullstendig tap av levedyktighet i NSCLC-celler som hadde moderat effekt på normal lunge cellelevedyktigheten og reaktive oksygenarter (ROS) nivåer. Kombinasjonsbehandlinger som induseres dramatisk høyere ROS-nivåer sammenlignet med behandling med AA og 3-PO alene NSCLC-celler og kombinasjoner-indusert celledød ble inhibert ved tilsetning av katalase til mediet. Analyser av DNA-fragmentering, poly (ADP-ribose) polymerase-spalting, annexin V-binding, og caspase aktivitet viste at AA-indusert celledød er forårsaket via aktivering av apoptose, og at kombinasjonsbehandlingene som skyldes en synergistisk induksjon av apoptose. Disse resultatene viser effektiviteten av AA mot NSCLC-celler og at kombinasjoner av AA med 3-PO synergistisk indusere apoptose via en ROS-avhengig mekanisme. Disse resultatene støtter videre evaluering av farmakologiske konsentrasjoner av AA som en adjuvant behandling av NSCLC og den kombinasjon av AA med glykolyse inhibitorer kan være en lovende for behandling av NSCLC
relasjon:. Vuyyuri SB, Rinkinen J, Worden E, Shim H, Lee S Davis KR (2013) Ascorbic Acid og en Cytostatika hemmer av glykolyse synergi indusere apoptose i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 8 (6): e67081. doi: 10,1371 /journal.pone.0067081
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 19 november 2012; Godkjent: 15 mai 2013; Publisert: 11 juni 2013
Copyright: © 2013 Vuyyuri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Deler av dette prosjektet ble gjort mulig av en kontrakt som ble tildelt og administrert av US Army Medical Research Forsyningskommando (USAMRMC) og telemedisin Advanced Technology Research Center (TATRC) under kontrakt nummer: W81XWH-09-2-0022. De synspunkter, meninger og /eller funn i denne forskningen er de av forfatterne, og reflekterer ikke nødvendigvis synspunktene til det amerikanske forsvarsdepartementet og skal ikke tolkes som en offisiell DoD /Army posisjon, politikk eller vedtak med mindre dette er utpekt av andre dokumentasjon. Ingen offisiell godkjenning bør gjøres. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En unik egenskap ved mange kreftceller er økt glukoseopptak og forhøyet aerob glykolyse med en samtidig reduksjon i oksidativ fosforylering gjennom trikarboksylsyre (TCA) syklus. Denne bemerkelsesverdige metabolske omprogrammering, kjent som Warburg virkning [1] representerer et potensielt mål for å hemme ukontrollert celleproliferasjon som er et kjennetegn på kreft. Innledende forklaringer på avhengigheten av kreftceller på aerob glykolyse antydet at kreftceller inneholdt defekte mitokondrier og dermed forbedret glykolysen var nødvendig for å generere ATP for å drive celleproliferasjon. Det er imidlertid nå kjent at de fleste kreftceller ha funksjonelle mitokondrier, og at de metabolske endringer knyttet til Warburg virkning er rettet mot å gi biosyntetiske forløpere for aminosyrer, nukleotider og lipider [1], [2]. I tillegg til å drive øket glykolyse, den forbedrede opptaket av glukose karakteristisk for mange kreftceller støtter øket fluks gjennom pentose-fosfat shunt og produksjonen av ribose-5-fosfat til nukleotid biosyntese. Kanskje enda viktigere, øket fluks gjennom pentose-fosfat shunt kan øke mengden av NADPH tilgjengelig for å støtte metabolsk aktivitet, og gi beskyttelse mot oksidativt stress. Ytterligere NADPH og biosyntetiske forløpere fremstilles ved nedbrytningen av glutamin [3]. Dermed krever Warburg effekten den svært koordinert kontroll av glykolyse, den pentosefosfateveien shunt, glutaminolysis og mitokondrie TCA syklus.
Den unike avhengighet av kreftceller på glykolyse gjør dem sårbare for terapeutisk intervensjon med spesifikke glykolyse hemmere. Flere glykolytiske enzymer, inkludert heksokinase II, laktatdehydrogenase A, og glukose-6-fosfat-isomerase, er over uttrykt i tumorceller, og tjener både som tilrettelegger og regulatorer av kreft progresjon [4], [5]. Ulike komponenter av glykolysen har vært målrettet for terapi utvikling, selv om svært få har blitt evaluert i kliniske studier. 2-deoksy-D-glukose (2-DG), har 3-bromopyruvate og lonidamine blitt rapportert å være nyttige glykolytiske inhibitorer som målretter heksokinase, inngangspunkt enzym for glykolyse [5], [6]. 3-Bromopyruvate inhiberer også glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) [6] og en nylig undersøkelse indikerte at 3-bromopyruvate propylester var en mer effektiv inhibitor av GAPDH i forhold til heksokinase i kolorektale carcinom-celler [7]. En annen nøkkel glykolytisk enzym sterkt uttrykt i tumorceller er 6-phosphofructo-2-kinase /fruktose-2,6-bisfosfatase-isozym 3 (PFKFB3), som genererer fruktose-2,6-bisfosfat (Fru-2,6-BP). Fru-2,6-BP avlaster undertrykkelse av styringsrenten begrensende enzym 6-phosphofructo-en-kinase av ATP, og dermed gir høy forekomst av glykolyse i nærvær av høye ATP nivåer [8]. Lavmolekylære inhibitorer av PFKFB3 har blitt identifisert og vist å hemme tumorcellevekst [9], [10]. Disse nye inhibitorer representerer en ny klasse av glykolyse inhibitorer og videre validere glykolyse-inhibitorer som potensielle kreftbehandling, [4], [11].
Til tross for avhengighet av kreftceller på glykolyse for ATP produksjon, inhibering av glykolyse ved hjelp av glykolytiske inhibitorer ofte ikke viser seg å være effektive i å drepe tumorceller som eksemplifisert i en rekke
in vivo eksperimenter
[4], [5], [12] – [18]. Dette tyder på at strategier som tar sikte på å hemme glykolyse kan kreve flere ATP-nedbrytende stoffer med ulike virkningsmekanismer [16] eller at glykolysen hemmere bør være koblet sammen med andre tumorspesifikke metabolisme hemmere. Denne tilnærmingen har vist seg vellykket i en rekke tilfeller [12] -. [15], [17], [18], noe som tyder på at kombinasjonsbehandlinger med glykolytiske hemmere forbundet med andre legemidler mot kreft kan være svært kraftig i klinikken
Askorbinsyre (AA) er blitt vist å ha kreft terapeutisk potensial; Men til dags dato sin terapeutiske verdi forblir kontroversiell [19] – [23]. Ved lavere konsentrasjoner kan AA fungerer primært som en antioksidant og beskytter cellene mot oksidativt stress mens høyere konsentrasjoner AA virker som en pro-oksidant medfører at oksidativt stress og induserer celledød [20], [23] – [27]. Det er sannsynlig at denne konsentrasjonsavhengig tosidige natur AA er grunnlaget for inkonsekvent effekten av AA i kreftterapi, siden bare farmakologiske konsentrasjoner av AA høyere enn de som kan oppnås ved oral levering ville sannsynligvis utøve kreft effekter [28]. AA har vist seg å være selektivt mer toksisk for kreftceller sammenlignet med korresponderende normale celler [29] – [32]. En viktig komponent i denne selektive cytotoksisitet er evnen av farmakologiske konsentrasjoner av AA for å pålegge oksidativt stress på kreftceller ved generering av ROS og hydrogenperoksyd [33] – [35]. Siden kreftceller har generelt høyere nivåer av reaktive oksygenarter, synes det som den ytterligere oksidativt stress pålegges av AA ikke kan bedres ved cellulære responser antioksidant og celledød utløses [36]. Flere studier har vist at kombinasjoner av AA med andre legemidler mot kreft viser ofte forsterket cytotoksisitet [34], [37] – [40]
I denne studien fant vi ut at AA er selektivt giftige for flere ikke-liten. celle lungekreft (NSCLC) cellelinjer, og den kombinasjon av AA og 3- (3-pyridinyl) -1- (4-pyridinyl) -2-propen-1-on (3-PO), en ny inhibitor av PFKFB3 med sterk anticancer aktivitet [9], induserer synergistisk apoptose hos NSCLC celler.
Resultater
AA og 3-PO synergi hindre vekst av NSCLC cellelinjer, men ikke Bronkial Epitelceller
Forrige studier viste at AA selektivt reduserer celleformering i noen cancercellelinjer uten å påvirke normale celler [29] – [32]. Vi innledet undersøkelser for å finne ut om dette virkelig er tilfelle for NSCLC celler og for å avgjøre om kombinasjoner av AA med glycolytic inhibitor 3-PO var mer effektive enn AA alene. Innledende studier ble gjennomført for å bestemme den IC
50 for AA og 3-PO i tre NSCLC-cellelinjer (H1299, H661, og A549) og en immortalisert epitelial celle lunge linje (BEAS-2B) ved hjelp av en trypan blå eksklusjon cellelevedyktighet analyse. Den 24 timers IC
50 konsentrasjoner for AA i de tre NSCLC linjene varierte fra 0,57 to1.71 mM, med H1299 er den mest sensitive (Fig. 1a). Beas-2B celler var mye mer tolerant til AA behandling, med en IC
50 konsentrasjon (Fig. 1C) 20 mm. Disse resultatene viste at NSCLC-celler er betydelig mer følsomme for AA forhold til BEAS-2B lunge epitelceller. Den 24 timers IC
50 konsentrasjoner for 3-PO i de tre NSCLC linjene varierte 25-67 mikrometer, med H1299 igjen å være den mest sensitive (Fig. 1B). IC
50 konsentrasjon for BEAS-2B-celler var 105 uM, noe som viser at udødeliggjorte epitelceller lunge var 1.5 til 4.2 ganger mer resistent overfor 3-PO forhold til NSCLC-celler.
(A) celleviabilitet av NSCLC H1299, H661 og A549-celler som en funksjon av AA-konsentrasjon. (B) Celleviabilitet av NSCLC H1299, H661 og A549 celler som funksjon 3-PO konsentrasjon. (C) Cellenes levedyktighet av NSCLC H1299 celler og BEAS-2B lunge epiteliale celler etter behandling med AA alene og kombinasjoner av AA med 10 mM 3-PO. Cellene ble behandlet i 24 timer, og ble deretter evaluert ved bruk av trypan blå eksklusjon levedyktighet analysen og normalisert til den passende bærer-behandlede kontroll. Data representerer gjennomsnitt ± SEM bestemmes ut fra tre individuelle eksperimenter. IC
50 verdiene vist ble beregnet ved hjelp GraphPad Prism programvare.
Vi neste undersøkte effekten av kombinasjoner av AA og 3-programmer på levedyktigheten av de mest sensitive cellelinje H1299 forhold til BEAS- 2B. For disse forsøk ble celler behandlet med 10 uM 3-PO, og konsentrasjoner av AA som strekker seg fra 0,1 til 20 mM. Kombinasjonsbehandling med AA og 3-PO ikke har en markert effekt på levedyktigheten av de BEAS-2B-celler i de konsentrasjonsområder som ble testet med den maksimale reduksjon i levedyktigheten til 18% ± 1,3 observert i 20 mM AA /10 uM 3- PO behandling (fig. 1C). De Drewinko indeks (DI) verdier for alle de AA og 3-PO-kombinasjoner som ble testet i BEAS-2B varierte 1,0 til 1,1, noe som indikerer at beskjeden levedyktighet endringer ble observert, var på grunn av de additive effekter av 3-PO og AA. I motsetning til dette kombinasjonsbehandling var signifikant mer effektive i å drepe H1299-celler sammenlignet med AA alene (figur 1C.). Behandling med 300 pM eller 500 pM AA alene redusert cellelevedyktighet med 15,3% og 26,3%, respektivt, mens i nærvær av 10 pM 3-PO, 300 uM og 500 uM AA redusert levedyktighet med 84% og 96%, respektivt. Kombinasjonen behandling IC
50 var tre ganger mindre enn IC
50 av AA alene H1299. DI verdier for kombinasjonsbehandlinger som inneholder 300 mikrometer og 500 mikrometer AA var 4,9 og 18,7, henholdsvis, og viser en sterk synergistisk interaksjon mellom AA og 3-PO.
For å finne ut om en lignende synergistisk interaksjon mellom AA og 3-PO skjedde i andre NSCLC linjer, celleviabilitet ble sammenlignet i BEAS-2B, H1299, H661 og A549 celler behandlet med 300 mikrometer AA, 10 um (BEAS-2B, H1299) eller 30 mikrometer 3-PO (H661, A549) , eller en kombinasjon av AA med 3-PO i løpet av en 72 timers periode etter behandling. Som tidligere observert, disse behandlingene hadde moderat effekt på levedyktigheten av BEAS-2B-celler (fig. 2A). Maksimalt tap av levedyktighet i BEAS-2B skjedde ved 72 timer og var 30% med kombinasjonsbehandling. Di verdier for kombinasjonsbehandling i løpet av behandlingsperioden varierte 1,0 til 1,1, noe som bekrefter at det ikke er en synergistisk interaksjon mellom AA og 3-PO in BEAS-2B-celler. I kontrast, kombinasjoner av AA og 3-PO synergi drepte alle tre NSCLC linjer, med signifikant (
P
0,05) synergistisk (DI 1) effekter tydelig over 72 h behandlingsperioden (Fig. 2B-D). Virkningene av kombinasjonsbehandlingen på H1299 og H661 var like, med en nesten fullstendig tap av levedyktighet ved 72 timer. A549-celler var mer følsomme for kombinasjonsbehandling, med en nær fullstendig tap av levedyktighet etter 48 timer. Di verdier for kombinasjonsbehandling i 72 timer varierte 22,2 til 62,6 for de tre NSCLC linjer, noe som indikerer en sterk synergistisk interaksjon. Disse resultater viser at en kombinasjon av AA og 3-PO synergistisk induserer celledød i flere NSCLC-linjer og bekrefter at en lignende interaksjon forekommer ikke i lunge epitelcellelinje BEAS-2B.
Lung epitelceller BEAS- 2B (A) og NSCLC-celler H1299 (B), H661 (C), og A549 (D) ble behandlet med 300 uM AA alene, 10 pM (BEAS-2B, H1299) eller 30 pM (H661, A549) 3-PO alene, eller en kombinasjon av AA og 3-PO. Kontrollceller ble behandlet med bærer alene. Ved 24, 48 og 72 timer etter behandling, ble cellenes levedyktighet bestemt ved anvendelse av trypan blå eksklusjon assay. Data representerer gjennomsnitt ± SEM bestemmes ut fra tre individuelle eksperimenter. en; statistisk signifikant forskjell (
P
0,05) fra kjøretøyet behandlet kontroll. b; statistisk signifikant forskjell (
P
0,05) fra kontroll og individuell AA og 3-PO behandlinger. Drewinko indeks (DI) verdiene ble beregnet ved anvendelse av formelen SF1 x SF2 /SF1 + 2 hvor SF1, SF2 og SF1 + 2 representerer overlevende fraksjon av celler behandlet med AA alene, 3-PO alene, og kombinasjonen av AA og 3- PO, respektivt. DI-dier større, 1 angir en synergistisk effekt, DI = 1 viser en additiv effekt; og DI-verdier mindre enn 1 indikerer en antagonistisk effekt
Etter å ha fastslått at AA og 3-PO føre til en synergistisk induksjon av celledød i NSCLC cellelinjer, vi videre undersøkt interaksjoner av et utvalg av AA. og 3-PO-konsentrasjoner på H1299-celler (fig. 3A). Konsentrasjoner av 1-10 mikrometer 3-PO hadde ikke en signifikant effekt på levedyktigheten til H1299 celler, mens 30 mikrometer 3-PO forårsaket en 60% tap i levedyktighet. Konsentrasjoner av AA 50-500 pM viste en nedgang doseavhengig i levedyktighet, med 500 pM forårsaker et 40% tap i levedyktighet. En signifikant synergistisk respons ble observert i H1299-celler over et bredt spekter av AA og 3-PO-kombinasjon (fig. 3B, tabell 1). Kombinasjoner av 100, 300 og 500 uM AA med konsentrasjoner av 3-PO ≥ 3 uM forårsaket synergistisk induksjon av celledød [Kombinasjonsindeks (CI) 1]. Kombinasjonen behandling med 50 mikrometer med 30 mikrometer 3-PO forårsaket også en betydelig synergieffekt som resulterte i 90% celledød (CI = 0,16). Flere kombinasjonsbehandlinger forårsaket bare additive effekter eller potensielt antagonistiske interaksjoner (KI 1). Men disse sakene ble bare observert i kombinasjoner som inneholder de laveste AA og 3-PO konsentrasjoner testet; Disse konsentrasjoner av 3-PO og AA alene forårsaket mindre enn 5% tap av levedyktighet. Disse resultatene demonstrerer en kombinasjon av AA og 3-PO i konsentrasjoner mer enn 20 ganger mindre enn deres respektive IC
50 resulterte i synergistisk induksjon av celledød og et nesten fullstendig tap av NSCLC H1299 cellelevedyktighet.
(A) Celleviabilitet som en funksjon av 3-PO-konsentrasjon i kombinasjon med AA-konsentrasjoner i området fra 50 til 500 uM. (B) Normalisert isobologram for hver av de tre-PO og AA kombinasjoner testet. H1299-celler ble behandlet med 3-PO (1, 3, 10, 30 uM) alene eller i kombinasjon med forskjellige konsentrasjoner av AA (25, 50, 100, 300 eller 500 um). Cellelevedyktigheten ble vurdert 24 timer etter behandling ved hjelp av trypanblått-utelukkelse levedyktighet assay. Data representerer gjennomsnitt ± SEM bestemmes ut fra tre individuelle eksperimenter. De isobologram data ble samlet ved CalcuSyn programvare ved hjelp av den ikke-konstant forhold metode og dataene er vist i (A). Symboler indikerer verdier oppnådd i kombinasjonsbehandlinger som inneholder Målt konsentrasjon av AA.
Bidrag av ROS og H
2o
2 til Mechanism av celledød Induksjon av Kombinasjoner av AA med 3-PO
Tidligere studier har fastslått at ROS og H
2o
2 stilles ved oksydasjon av AA er en viktig formidler av AA-indusert cytotoksisitet [29], [31], [ ,,,0],33], [41], [42]. Vi vurderte den potensielle betydning av ROS produksjon i følsomheten av NSCLC-celler til kombinasjoner av AA og 3-PO ved behandling BEAS-2B og H1299-celler med en kombinasjon av 10 uM 3-PO med 300 uM AA og måling av cellulær fluorescens av ROS reporter 5- (og 6-) -chloromethyl-2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat, acetyl ester (CM-H
2DCFDA). ROS nivåer ble ikke signifikant påvirket i BEAS-2B-celler ved enten AA eller 3-PO alene i løpet av en 4 timers behandlingsperiode, eller i kombinasjonsbehandlinger i 2 timer eller mindre. Den eneste statistisk signifikant (
P
0,05) effekt observert i BEAS-2B celler skjedde med kombinasjonsbehandling ved 4 h hvor ble det observert en 51% økning i ROS (figur 4A og S1 Fig..). En signifikant (
P
0,05) økning i ROS-nivåer ble observert så tidlig som 15 minutter i H1299 celler behandlet med enten AA eller en kombinasjon av 3-PO og AA, med kombinasjonsbehandling nivå er ca. 2 -gangers høyere enn AA alene (fig. 4B og S1 fig.). ROS-nivåer i AA-behandlede celler fortsatte å stige beskjedent og var fire ganger høyere enn bilen behandlet kontroll på fire timer. 3-PO induseres også lave nivåer av ROS produksjon mellom 1 og 4 timer med behandling som var to ganger høyere enn kontrollen. I motsetning til dette kombinasjonsbehandling induserte mye høyere ROS-nivåer som nådde et maksimum ved 2-4 h; Disse nivåene var 13 ganger høyere enn kontrollen og vesentlig høyere enn summen virkningene av de enkelte AA og 3-PO behandlinger. ROS-nivåer i H1299 celler ved 4 t var 7 ganger høyere enn kombinasjonsbehandlet BEAS-2B celler. Disse resultater viser at en kombinasjon av AA og 3-PO selektivt å indusere høye nivåer av ROS i H1299 i forhold til BEAS-2B og antyder at ROS produksjon er en komponent av den synergistiske kombinasjon induksjon av celledød observert i NSCLC-celler.
BEAS-2B (A) og H1299 (B) celler ble behandlet med enten AA (300 uM), 3-PO (10 uM) eller en kombinasjon av AA og 3-PO i de angitte tidsrom. Cellene ble farget med fem mikrometer CM-H
2DCFDA ved 37 ° C i mørket i 30 min for å oppdage intracellulær ROS. Data representerer middel ± SEM fra to uavhengige eksperimenter, hvor 100-125 celler per prøve ble analysert med hensyn til fluorescensintensitet. en; statistisk signifikant forskjell (P 0,05) fra kjøretøyet behandlet kontrollgruppe. b; statistisk signifikant forskjell (P 0,05). fra kontroll- og individuell AA og 3-PO behandlinger
For å finne ut i hvilken grad H
2o
2 medierte effekten av AA i sensibiliserende NSCLCs til 3-PO, ble H1299-celler behandlet med en kombinasjon av 10 uM 3-PO med 300 uM AA i enten nærvær eller fravær av katalase i kulturmediet. En signifikant (
P
0,05) doseavhengig reversering av den cytotoksiske effekten av AA og 3-PO Kombinasjonen ble observert over et konsentrasjonsområde på 25 til 1500 enheter av katalaseaktivitet (figur 5A.). Redningen av katalase var ikke fullstendig, hemningen av celledød plateaued ved ~80% levedyktighet. Rollen til H
2o
2 i mediering av den synergistiske aktivering av celledød ved en kombinasjon av AA og 3-PO ble ytterligere testet ved pre-inkubering av celler med aminotriazole, et velkjent katalase hemmer, før behandlingen med AA og 3-PO. En signifikant (
P
0,05) doseavhengig økning av celledød i forhold til aminotriazole alene ble observert over en aminotriazole konsentrasjonsområdet fra 30 til 100 uM (figur 5B.). Dette viser at inhibering av endogen katalaseaktivitet forbedrer synergistisk induksjon av celledød ved en kombinasjon av AA og 3-PO. Til sammen viser disse studiene mechanistic betydningen av H
2o
2 i synergis induksjon av celledød i NSCLC celler ved samtidig behandling med AA og 3-PO.
(A) Reduksjon av kombinasjons-indusert celledød ved tilsetning av katalase til kulturmediet. H1299 cellene ble behandlet med enten AA alene (300 uM), 3-PO alene (10 pM), en kombinasjon av AA og 3-PO, katalase alene (25, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 IU), eller kombinasjoner av AA, 3-PO og katalase. (B) Forbedring av kombinasjons-indusert celledød av tilsetning av katalase hemmer aminotriazole (ATA) til kulturmediet. H1299 cellene ble behandlet med enten AA alene (300 uM), 3-PO alene (10 pM), en kombinasjon av AA og 3-PO, ATA alene (30, 50, 100 uM), eller kombinasjoner av AA, 3-PO og ATA. Celler ble undersøkt 24 timer etter behandling ved hjelp av trypanblått-utelukkelse levedyktighet assay. Data representerer gjennomsnitt ± SEM bestemmes ut fra tre individuelle eksperimenter. en; statistisk signifikant forskjell (
P
0,05) fra kjøretøyet behandlet kontroll. b; statistisk signifikant forskjell (
P
0,05) fra kontroll og individuell AA og 3-PO behandlinger. c; statistisk signifikant forskjell (
P
0,05). fra AA og 3-PO kombinasjonsbehandling
Kombinasjon av AA og 3-PO induserer apoptose hos NSCLC Cells
Mikroskopisk undersøkelse av NSCLC-celler ble behandlet med kombinasjoner av AA og 3-PO viste at behandlede celler viste de klassiske morfologiske forandringer assosiert med apoptose, inkludert celle krymping, blebbing og dannelse av apoptotiske legemer. For ytterligere å undersøke om den synergis induksjon av celledød i NSCLC celler ved kombinasjon av tre-PO og AA var faktisk på grunn av apoptose, vurdert vi DNA-fragmentering, et kjennetegn på celler som gjennomgår apoptose. DNA-fragmentering ble først målt ved anvendelse av komet analysen i NSCLC H1299 celler og BEAS-2B lunge epitelceller som ble behandlet med AA eller 3-PO alene og i kombinasjon (fig. 6A og B). Behandling med 10 uM 3-PO alene ikke føre til en betydelig økning i DNA-fragmenteringen i hver cellelinje, mens 300 pM AA skyldes en beskjeden, men signifikant (
P
0,05) økning i både BEAS-2B og H1299 cellene ved 24 timer etter behandling. Kombinasjonen av 3-PO og AA forårsaket ikke signifikant mer DNA-fragmentering i BEAS-2B-celler enn det som ble observert i celler behandlet med AA alene. I motsetning til dette er mengden av DNA-fragmenteringen som observeres i de H1299 cellene var signifikant (
P
0,05) høyere i kombinasjonsbehandling (75,02 ± 2,29) sammenlignet med de individuelle behandlinger og til styre (AA 25,63 ± 2,38, 3-PO 19.63 ± 2.24, kontroll 17.96 ± 1.66) og var signifikant høyere enn summen virkningene av de individuelle AA og 3-PO behandlinger.
(A) Comet analysebilder av BEAS-2B lunge epitelial H1299-celler og celler behandlet med enten AA (300 uM), 3-PO (10 uM), eller en kombinasjon av AA og 3-PO. Cellene ble behandlet 24 timer etter behandling og bærer-behandlede celler ble inkludert som en kontroll. (B) Kvantitering av DNA-fragmentering som detekteres av komet analyse i BEAS-2B lunge epitelceller og H1299 celler behandlet med enten AA, 3-PO, eller en kombinasjon av AA og 3-PO. Cellene ble behandlet 24 timer etter behandling. Bety komet hale lengdedata representerer middel ± SEM bestemt fra tre uavhengige eksperimenter var halen lengde på 150 celler pr behandling ble målt i hvert eksperiment. (C) Kvantifisering av DNA-fragmentering ved TUNEL-analyser. H1299 cellene ble behandlet med enten AA (300 uM), 3-PO (10 uM), eller en kombinasjon av AA og 3-PO i de angitte tidsrom. Tunel positive celler ble identifisert ved hjelp av DeadEndTM Fluorometrisk TUNEL System. Data representerer middel ± SEM fra to uavhengige eksperimenter, hvor et minimum av 100 celler per prøve ble visualisert i hvert forsøk. en; statistisk signifikant forskjell (P 0,05) fra kjøretøyet behandlet kontrollgruppe. b; statistisk signifikant forskjell (P 0,05). fra kjøretøyet behandlet kontroll og individuell AA og 3-PO behandlinger
Flere studier av DNA-fragmentering i H1299 celler ble utført ved anvendelse av en terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP Nick ende merking ( TUNEL) analyse for å vurdere kinetikken av DNA-fragmentering i løpet av de første 24 timer av behandlingen (fig. 6C). Beskjeden, men signifikant (
P
0,05) øker i DNA-fragmentering ble observert i celler behandlet med enten AA eller tre-PO alene starter på 4 og 12 timer, henholdsvis. Etter 24 timers behandling var mengden av DNA-fragmenteringen som observeres i AA-behandlede og 3-PO-behandlede celler var seks ganger og 2,5 ganger høyere, henholdsvis, sammenlignet med den bærer-behandlede kontroll. Kombinasjon av AA og 3-PO induserte signifikant høyere (
P
0,05) nivå av DNA-fragmentering sammenlignet med kontroll og individuelle behandlinger så tidlig som 2 timer etter behandling. DNA-fragmentering i kombinasjon-behandlede celler begynte å platå ved 12 timer etter behandling, og var 20 ganger høyere enn kontrollen ved 24 timer etter behandling. Graden av DNA-fragmenteringen som observeres i kombinasjons-behandlede celler på alle de tidspunkter som ble testet var også signifikant høyere enn summen virkningene av de enkelte AA og 3-PO behandlinger. Disse resultatene er i samsvar med kometanalyse studier og foreslår at induksjon av apoptose er en komponent i kombinasjon-indusert celledød i H1299 celler.
For ytterligere å vurdere om celledød indusert av kombinasjonen av AA og 3- PO var knyttet til induksjon av apoptose, undersøkte vi omfanget av PARP cleavage. PARP er et 116 kDa stressrespons protein involvert i reparasjon av skadet DNA og regulerer kromatinstruktur av poly (ADP-ribosylering) av kjernefysiske proteiner. Proteolytisk spaltning av PARP til 89 kDa og 24 kDa-fragmentene av caspaser er en indikator på apoptose [43]. Nivåene av PARP spaltet ble målt ved immunblot cellelysater 24 timer etter behandling med 300 uM AA, 10 mM 3-PO eller en kombinasjon av AA og 3-PO i 24 timer (fig. 7A og B). Behandling med 3-PO alene ikke føre til en betydelig økning i spaltet PARP (89 kDa-fragment). En økning i akkumuleringen av spaltet PARP ble observert i celler behandlet med AA alene eller en kombinasjon av AA og 3-PO som var signifikant (
P
0,05) høyere enn bærerkontrollen. Omfanget av PARP-spaltning i celler behandlet med en kombinasjon av AA og 3-PO var signifikant (
P
0,05). Høyere enn i celler behandlet med AA alene
(A) H1299 cellene ble behandlet med enten AA (300 uM), 3-PO (10 uM), eller en kombinasjon av AA og 3-PO. Cellene ble høstet 24 timer etter behandling og proteinekstrakter kastet immunoblotanalyse ved hjelp av et PARP-spesifikt antistoff. Duplicate immunoblotter probet med en aktin-spesifikt antistoff fungerte som normalisering kontroller. (B) Kvantifisering av nivåene av kløyvde PARP (Cl PARP) ble gjort ved hjelp av bildeanalyse av immunoblotter bruker Carestream Molecular Imaging Software versjon 5.0. Intensitetsmålinger vist representerer betyr ± SEM bestemmes ut fra tre uavhengige eksperimenter. en; statistisk signifikant forskjell (
P
0,05) fra kjøretøyet behandlet kontroll. b; statistisk signifikant forskjell (
P
0,05). fra kontroll og individuell AA og 3-PO behandlinger
En av de tidlige hendelsene i apoptose involverer translokasjon av fosfatidylserin til overflaten av den celle som kan påvises ved hjelp av analyser basert på annexin V-binding. Følgelig, for ytterligere å vurdere om celledød indusert i H1299 celler ved kombinasjonsbehandlinger AA og 3-PO skyldes apoptose, ble behandlede celler analysert for annexin V-binding og propidiumjodidfarging for å måle tidlig apoptotisk (annexin V + /propidiumiodid -) og sen apoptotisk (annexin V + /propidium idodide +) cellepopulasjoner (fig. 8A og B). Behandling med 10 mm 3-PO alene ikke har en signifikant effekt på antall tidlig eller sent apoptotiske celler sammenlignet med kontrollgruppen. Behandling med 300 mikrometer AA induserte en signifikant (
P
0,05) gradvis økning i både tidlig og sent apoptotiske celler. Tidlig apoptotiske celler ble påvist så snart som 15 minutter etter behandling, og nådde et maksimum på 29% ved 3 timer etter behandling. Prosentandelen av tidlige apoptotiske celler falt på fire timer. En tilsvarende gradvis økning i den sene apoptotiske celler skjedde i AA-behandlede celler i løpet av den fire timers behandlingsperioden, med den første påvisbare betydelig forskjell fra kontroll observert ved 30 minutter og nådde 18% ved 4 timer. Den kombinasjonsbehandling oppviste også en gradvis økning i begynnelsen av apoptotiske celler fra 15 minutter til 3 timer, men prosentandelen av tidlige apoptotiske celler var signifikant høyere enn den som ble observert med AA alene og nådde et maksimum på 56% ved 3 timer etter behandling. I likhet med AA alene behandling, antall tidlige apoptotiske celler ble redusert med en samtidig økning i slutten av apoptotiske celler ved 4 timer. Prosentandelen av sen apoptotiske celler ved 4 timer etter behandlingen var 50%, og var signifikant (
P
0,05). Høyere enn 26% observert i celler behandlet med AA alene
( A) Analyse av tidlige apoptotiske celler og (b) sen apoptotiske celler med annexin V-binding og propidium idodide farging. H1299 cellene ble behandlet med enten AA (300 uM), 3-PO (10 uM) eller en kombinasjon av AA og 3-PO i de angitte tidsrom. Cellene ble deretter farget med annexin V og propidiumjodid og visualisert ved fluorescens mikroskopi. Et minimum av 200 celler ble bedømt for hver prøve og data representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. (C) Analyse av kaspase 3/7 aktivitet. Chen et al. Chen et al.
