Abstract
Bakgrunn
Prostatakreft er den vanligste kreftformen blant eldre menn i USA, og immunterapi har vist seg å være en lovende strategi for å behandle pasienter med metastatisk kastrering resistent prostatakreft. Arbeidet med å identifisere nye prostataspesifikt tumorantigener vil lette utviklingen av effektive kreftvaksiner mot prostatakreft. Prostataspesifikt G-proteinkoblet reseptor (PSGR) er et nytt antigen som er blitt vist å være spesifikt over-uttrykt i humane prostata kreftvev. I denne studien beskriver vi identifikasjon av PSGR-avledet peptid epitoper gjenkjent av CD8
+ T-celler i en HLA-A2 avhengig måte.
metodikk /hovedfunnene
Tjueen PSGR-avledet peptider ble spådd av en immun-informatikk tilnærming basert på HLA-A2 bindende motiv. Disse peptidene ble undersøkt for deres evne til å indusere peptid-spesifikke T-celle-responser i perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble oppnådd fra enten HLA-A2
+ friske donorer eller HLA-A2
+ prostata kreftpasienter. Erkjennelsen av HLA-A2 positive og PSGR uttrykker LNCaP celler ble også testet. Blant de 21 PSGR-avledede peptider, tre peptider, PSGR3, PSGR4 og PSGR14 ofte indusert peptid-spesifikke T-celle-responser i PBMC fra både friske donorer og prostata kreftpasienter. Viktigere, disse peptid-spesifikke T-celler anerkjent og drept LNCaP prostatakreftceller i et HLA klasse I-begrenset måte.
Konklusjon /Betydning
Vi har identifisert tre roman HLA-A2-restricted PSGR avledede peptider anerkjent av CD8
+ T-celler, som i sin tur gjenkjenne HLA-A2
+ og PSGR
+ kreftceller. De PSGR-deriverte peptider identifisert kan brukes som diagnostiske markører samt immun mål for utvikling av kreft vaksiner
Citation. Matsueda S, Wang M, Weng J, Li Y, Yin B, Zou J, et al. (2012) Identifisering av prostata-spesifikt G-proteinkoblet reseptor som Tumor Antigen Anerkjent av CD8
+ T celler for Cancer Immunterapi. PLoS ONE 7 (9): e45756. doi: 10,1371 /journal.pone.0045756
Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA
mottatt: May 11, 2012; Akseptert: 24. august 2012; Publisert: 20.09.2012
Copyright: © Matsueda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra National Cancer Institute, National Institute of Health and Cancer Research Institute og The Methodist Hospital Research Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er blitt den vanligste kreftformen blant menn i USA, og er den nest største årsaken til død av kreft i amerikanske menn [1]. Standarden på omsorg for de fleste pasienter med prostatakreft er kirurgi og /eller strålebehandling. Imidlertid tar tilbakefall av sykdommen etter kirurgi eller strålings fremdeles sted hos opptil 30% av pasientene. Selv om androgen-deprivasjonsterapi er en effektiv behandling mot tilbakevendende sykdom, de fleste av disse pasientene til slutt utvikle androgen-ildfaste prostatakreft, som er ufølsom for tradisjonell behandling. Derfor blir mer effektive og mindre giftige terapier presserende behov. Immunterapi har vist seg å være en lovende tilnærming til behandling av prostatacancer, spesielt hos pasienter med metastatisk kastrering-motstandsdyktig prostatakreft [2] – [4]. Å utnytte immunsystemet til å utrydde ondartede celler er en lovende metode for kreftterapi, men inntil nylig har det blitt møtt med bare sporadisk klinisk suksess [4] – [6]. Nyere Food and Drug Administration (FDA) godkjenning av immunterapi basert vaksine /legemiddel sipuleucel-T
(
Provenge) og ipilimumab (Yervoy) representerer milepæler innen kreft immunterapi [7], [8]. Videre, en klinisk fase III studie av gp100 peptid for melanom også produsert svært oppløftende kliniske resultater [9]. Imidlertid har de kliniske fordelene rapportert for disse agentene falt langt kort av komplett respons og permanente botemidler. I tilfelle av sipuleucel-T, overlevelsen nytte for pasienter som bare var 4,1 måneder, uten objektiv tumorregresjon eller betydelige endringer i prostata spesifikt antigen (PSA) nivåer. En fersk studie ved hjelp av dyremodeller videre avslører betydningen av tumorspesifikke antigener i fremlokkende immunresponser mot en utvikling av svulst [10], anspore mer innsats for å identifisere slike antigener for kreft immunterapi. Videre, siden noen store avvisning antigener kan gå tapt eller endres på grunn av T-celle utvalg og drepe [11], er den beste strategien for å målrette flere tumorantigener som er tilstede på enkelte svulster for immunterapi.
Til dags dato, et antall av prostata spesifikke tumorantigener har blitt godt definert, inkludert PSA [12], [13], prostein [14], [15], prostata-stamcelle-antigen (PSCA) [16], prostata-spesifikt membran antigen (PSMA ) [17] – [19], prostatisk sur fosfatase (PAP) [20] og transient receptor potensiell P8 (trp-P8) [21]. Videre har HLA-klasse I-begrenset epitoper avledet fra disse tumorantigener blitt beskrevet [22]. En ulempe med enkelt tumor antigen-basert immunterapi er at immun flukt kan forekomme. Derfor er identifiseringen av ytterligere prostata kreftspesifikke antigener for utviklingen av mer effektive og antigen-spesifikke vaksiner for pasienter med metastatisk prostata kreft nødvendig. Prostataspesifikt G-proteinkoblet reseptor (PSGR) er et medlem av den G-proteinkoblet odorant reseptor-familien, og er sterkt uttrykt i prostata kreftceller sammenlignet med normale prostataceller [23] – [25], som tyder på at PSGR kan bli målrettet for utvikling av nye immunterapeutiske strategier mot prostatakreft.
i et forsøk på å fastslå om PSGR kan bli gjenkjent av T-celler, beskriver vi identifikasjon av PSGR-avledet T-celle epitoper for T-celle anerkjennelse av en immun -bioinformatics tilnærming. Tjueen peptider som ble forutsagt å binde seg til HLA-A2-molekylet ble valgt ut og syntetisert. Alle disse peptidene ble vurdert
in vitro
for deres evne til å stimulere T-celler i PBMC fra både friske individer og pasienter prostata basert på interferon-γ (IFN-γ) frigivelse målt ved ELISA eller ELISPOT-analyser. Tre peptider ble funnet å indusere IFN-γ utgivelse i perifere T-celler fra både friske forsøkspersoner og pasienter med prostatakreft. Viktigere, kan disse peptid-spesifikke T-celler gjenkjenner HLA-A2
+, PSGR-uttrykke LNCaP celler i en HLA-klasse I-avhengig måte.
Materialer og metoder
friske donorer og prostatakreftpasienter
Ten HLA-A2
+ prostatakreftpasienter og ti HLA-A2
+ friske personer ble inkludert i studien etter skriftlig informert samtykke ble innhentet. Alle protokoller ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) fra Baylor College of Medicine før du begynner studiene. 20 ml perifert blod ble oppnådd fra hver enkelt person, og perifert blod mononukleære celler (PBMC) ble isolert ved tetthetsgradient sentrifugering ved anvendelse Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norge). De nylig isolerte PBMC ble oppbevart for senere bruk i en mL iskaldt medium inneholdende 90% FCS og 10% dimetylsulfoksid (DMSO) ved -140 ° C. Uttrykket av HLA-A2-molekyler på PBMC hentet fra kreftpasienter og friske personer ble bekreftet ved flowcytometri med FITC-merket HLA-A2 mAb BB7.2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
T2-celler (en HLA-A2
+ TAP-mangelcellelinje), PC3 celler (en HLA-A2-negative prostatakreft cellelinje), og LNCaP celler (en HLA-A2 positive prostata carcinoma cellelinje) ble alle innkjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Alle cellelinjer ble holdt i RPMI-1640 medium (Mediatech, Manassas, VA, USA), supplert med 10% FBS, 1% L-glutamin og 1% penicillin og streptomycin
Peptides
Tjueen PSGR-deriverte peptider (tabell 1) ble beregnet med BIMAS (https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI (https://www.syfpeithi.de/), og Rankpep (https://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) basert på HLA-A2-bindende motiv. Bare epitoper som ble forutsagt av i det minste to av disse algoritmene ble valgt for videre testing. Peptidene ble syntetisert ved en fast-fase-metoden ved anvendelse av en peptid-synthesizer (AApptec, Inc .; Louisville, KY, USA), ble renset ved reversfase væskekromatografi og validert ved massespektrometri. De syntetiserte peptider ble løst i DMSO ved en konsentrasjon på 10 mg /ml og lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
In vitro
stimulering av peptid-spesifikke T-celler i PBMC
PBMC (1 x 10
5-celler /brønn) enten fra friske forsøkspersoner eller prostata kreftpasienter ble inkubert med standard peptid-konsentrasjoner på 20 pg /mL per peptid [26] – [28] i 96-brønns U-bunn mikroplater (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) i 200 ul av T-celle-medium (TCM), bestående av RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA, USA), 10% humant AB-serum (dalen Biomedisinsk, Winchester, USA), 50 uM 2-merkaptoetanol, 100 U /ml interleukin-2 (IL-2), og 0,1 mM MEM ikke-essensiell aminosyre-løsning (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Halvparten av TCM ble fjernet og erstattet med frisk TCM inneholdende peptider (20 ug /ml) hver 5 dag. Etter 14 dagers dyrkning ble cellene høstet og testet for deres evne til å produsere IFN-γ svar på T2-celler (1 x 10
4 celler /brønn), som var forhåndslastet med enten PSGR peptid (5 ug /mL) eller et kontroll peptid (et irrelevant HLA-A2-bindende peptid: NLLTHVESL) som en negativ kontroll. Etter 18 timers inkubering ble supernatanter oppsamlet, og IFN-γ frigivelse ble bestemt ved ELISA-analyse.
Rapid Expansion Protocol (REP) for PSGR peptid-spesifikke T-celler
PSGR peptid spesifikk T-celler ble ekspandert ved en rask ekspansjon protokoll (REP) som tidligere beskrevet [29] med en svak modifikasjon. I korthet på dag 0, 0,1-0,5 x 10
6 PSGR peptidspesifikke T-celler ble dyrket i en T25-kolbe med 20 ml RPMI-1640 supplementert med 10% humant AB-serum, 50 uM 2-merkaptoetanol, og 30 ng /ml OKT3-antistoff (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ), sammen med 20 x 10
6 bestrålte allogene PBMC og 5 x 10
6 bestrålt Epstein Barr-virus (EBV) transformerte B-celler som feeder-celler. Kolbene ble inkubert oppreist ved 37 ° C i 5% CO
2. IL-2 (300 IU /ml) ble tilsatt på dag 1, og på dag 5, ble halvparten av cellekulturen supernatanten ble fjernet og etterfylt med friskt medium inneholdende 300 IU /ml IL-2. 14 dager etter oppstart av REP ble cellene høstet og fryses ned for senere eksperimenter
ELISA-analysen
cytokine release ble målt ved å belegge 96-brønners ELISA-plater (Thermo Fisher Scientific,. Rochester, NY , USA) med 1 mg /ml anti-humant IFN-γ (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL, USA) over natten ved 4 ° C. Platen ble vasket seks ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween-20 (vaskeløsning) for å fjerne ubundet antistoff belegg, og blokkert med 1% BSA /PBS ved romtemperatur i 2 timer. Deretter ble 50 ul supernatant tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur i 1 time, deretter 50 ul 0,5 ug /ml biotinylert anti-humant IFN-γ (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL, USA) ble tilsatt, og platene ble inkubert i ytterligere 1 time ved romtemperatur. Etter inkubering ble platene vasket og inkubert i 30 minutter med Poly-HRP-streptavidin (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) fortynnet 1:5000 i PBS /1% BSA. Platene ble vasket og 100 ul av TMB-substrat-løsning (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, Missouri, USA) ble tilsatt per brønn. Den kolorimetriske Reaksjonen ble stanset ved hjelp av 2N H
2SO4 og platene ble avlest ved 450 nm ved hjelp av en ELISA-plateleser.
IFN-y ELISPOT analysen
IFN-y ELISPOT analysen ble utført som tidligere beskrevet [27] for å kvantifisere peptid-spesifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) etter
in vitro
ekspansjon. I korthet ble 96-brønns ELISPOT-plater (Millipore; Bedford, MA, USA) ble belagt over natten ved 4 ° C med 7,5 ug /ml anti-humant IFN-γ (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL, USA). Platene ble vasket seks ganger med steril PBS for å fjerne ubundet antistoff belegg. T-cellene ble sådd ut på en 10 x
5 celler per brønn og inkubert med T2-celler alene, T2-celler pulsert med en PSGR peptid (5 ug /ml) eller et irrelevant peptid som en negativ kontroll. -Celler stimulert med 5 ug /ml OKT3-antistoff (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ, USA) ble benyttet som positiv kontroll. Etter inkubering av prøvene i 18 – 20 timer ved 37 ° C og 5% CO
2, ble platene vasket med vaskeløsning. 0,75 ug /ml biotinylert anti-humant IFN-γ (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL, USA) ble tilsatt, og platene ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Etter inkubering ble platene vasket med vaskeoppløsning og inkubert ytterligere med Poly-HRP-streptavidin (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) fortynnet 1:1000 i PBS /1% BSA i 1 time. Platene ble vasket, og 200 ul av 4-klor-1-naftol-substrat (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, USA) ble tilsatt til hver brønn. Til slutt, Platene ble vasket under rennende vann fra springen og tørket ved romtemperatur. IFN-y stikkdannende celler (SFC) ble nummerert ved hjelp av en ELISPOT leser (CTL Technologies, Minneapolis, Minnesota, USA).
RNA Utvinning og RT-PCR
RNA ekstraksjon og RT- PCR ble utført som tidligere rapportert [30]. I korte trekk, ble total RNA ekstrahert fra prostata kreft celler med 1 ml Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Tre mikrogram RNA ble revers-transkribert til cDNA i 30 ul volum og 1 ul av hver cDNA ble anvendt i påfølgende PCR-reaksjon med et par av PSGR spesifikke primere: Primer 1: 5′-GAAGATCTATGAGTTCCTGCAACTTC-3 «, primer 2: 5»- -CCCAAGCTT TCACTTGCCTCCCACAG-3 «. β-aktin ble benyttet som kontroll lasting: primer 1: 5»-CATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3 «; Primer 2: 5»-CAGACTATGCTGTCCCTGTACGC-3 «. PCR-reaksjonen ble utført under de følgende betingelser: 94 ° C i 2 minutter, 94 ° C i 30 s, 56 ° C i 30 s, 72 ° C i 1 min 20 s, totalt 35 sykluser, 72 ° C i 10 min, og β-aktin ble kjørt i 25 sykluser. Like mengder av PCR-produktene ble deretter lastet og påvises ved gel-elektroforese.
Cvtotoksisitetsmålinq
PSGR avledet peptid-spesifikke T-celler ble testet for cytotoksisitet mot både PC3 og LNCaP ved en laktatdehydrogenase (LDH ) analyse (Promega, Madison, WI, USA). Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. LDH utgivelsen ble beregnet basert på følgende formel:
Cytotoksisitet (%) = (Experimental – Effector Spontan – Target Spontan LDH release) /(Target Maximum – Target Spontan LDH release) × 100.
Spontan frigjøring ble bestemt ved hjelp av supernatanten av målcellene alene eller effektorceller alene, og den maksimale meldingen ble bestemt ved hjelp av supernatanten av målceller inkubert med en lyseløsning inkludert i LDH kit. For å bestemme om T-celle-gjenkjennelse er HLA-I begrenses, anti-HLA-I, anti-HLA-II, eller anti-CD19 mAb (alle fra ATCC, Manassas, VA, USA) ble tilsatt til brønnene ved innledningen av kulturen .
Intracellulær IFN-γ cytokin Farging
PSGR-avledet peptid spesifikke T-celler (0,5-1 x 10
6) ble dyrket med 0,5 × 10
6 T2 celler pulset med eller uten peptid (5 ug /ml) i nærvær av GolgiStop (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) i en 48-brønns plate i 4 timer ved 37 ° C. Celler ble farget med anti-CD8 og anti-IFN-γ og analysert ved bruk av et FACSCalibur maskin.
statistikker og
t-test ble anvendt for å analysere kvantitative forskjeller mellom de eksperimentelle brønnene og styr ELISA og ELISPOT-analyser. P 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Induksjon av PSGR Avledet Peptide-spesifikke CTL hos friske donorer
For å finne ut om PSGR-reaktive T-celle forløpere er til stede i sunn. fag, vi oppnådd PBMC fra 10 HLA-A2
+ friske donorer og stimuleres dem
in vitro
med hver av de 21 PSGR-avledede peptider inneholdende HLA-A2-bindingsmotiv (tabell 1). Etter 2 uker med peptid stimulering, ble supernatanter fra peptid-stimulerte T-celler analysert ved hjelp av ELISA-analysen for å påvise IFN-γ frigivelse som reaksjon på T2-celler pulsert med eller uten tilsvarende peptider. Som vist i tabell 2, 13 PSGR-avledede peptider var i stand til å indusere peptid-spesifikke T-celle-responser i det minste i en av 10 friske forsøkspersoner. Viktigere, kan PSGR3, PSGR4 og PSGR14 indusere T-celle responser i 7 av 10 friske personer, noe som indikerer at disse 3 peptider er immunogen og potensielt i stand til å utvide antigen-spesifikke T-celler hos friske personer.
tilstedeværelse av PSGR-avledet peptide CTL i prostatakreftpasienter
Siden peptid-spesifikke T-celler mot PSGR3, PSGR4 og PSGR14 ble funnet i mer enn 70% av friske personer, vi tenkte at CTL forløpere som gjenkjenner disse tre peptider kan også være høy i PBMC av prostatakreftpasienter. For å teste vår hypotese, undersøkte vi om disse tre peptid kandidatene kan indusere peptid CTL fra PBMC av HLA-A2
+ prostatakreftpasienter. PBMC fra prostatakreftpasienter ble samlet og stimulert
in vitro
med PSGR3, PSGR4 eller PSGR14 peptider. Som vist i tabell 3, PSGR3, PSGR4 og PSGR14 faktisk indusert peptid CTL fra PBMC av prostatakreftpasienter.
Anerkjennelse av prostatakreft cellelinjer ved PSGR Avledet Peptide-spesifikke T-celler
for å få et stort antall PSGR peptid-spesifikke T-celler for videre analyse, utvidet vi PSGR peptid-spesifikke T-celler identifisert i tabell 2 og 3. for å finne en effektiv konsentrasjon av peptid for lasting T2 celler for T-celle anerkjennelse utførte vi peptid titrering eksperimenter. Som vist i figur 1 A, for alle 3 peptider et peptid konsentrasjon på 5 ug /ml var tilstrekkelig til å mette bindingssetene av HLA-A2-molekyler på T2 celler for T-celle-gjenkjennelse. Derfor har vi konsekvent brukt denne peptid konsentrasjon for pre-lasting T2 celler i ELISA og /eller ELISPOT analyser. De ekspanderte T-cellene opprettholdt antigen-spesifisitet og utskilt betydelige mengder av IFN-γ etter stimulering med T2-celler pulsert med de tilsvarende peptidene, men ikke med en kontroll peptid (figurene 1A, B, C, D). ELISPOT-analyse ytterligere bekreftet tilstedeværelsen av PSGR peptid-spesifikke T-celler i ekspandert T-celler (figurene 1E, F, G)
Erkjennelsen av T2-celler forhåndsinstallert titrert konsentrasjoner av peptider (0-20 ug /ml) av ekspandert PSGR peptid-spesifikke T-celler ble testet ved hjelp av ELISA-analyse (A). De ekspanderte PSGR3 T-celler (B og E), PSGR4 T-celler (C og F) og PSGR14 T-celler (D og G) var henholdsvis ko-inkubert med T2-celler (1 x 10
4 celler /brønn) alene komplett medium (CM), eller med T2-celler forhåndslastet med enten et tilsvarende peptid (5 ug /ml) eller en kontroll peptid som en negativ kontroll. Celler ble inkubert i 18 -24 timer, ble IFN-γ sekresjon i supernatanten bestemt ved ELISA-assay (B, C og D). IFN-y flekk-dannende celler (SFC) ble nummerert ved ELISPOT-analyse (E, F og G). Dataene er plottet som middel ± SD. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001 versus kontroller (T2 celler alene eller T2 celler pulsert med en kontroll peptid).
for å finne ut om PSGR-avledet peptid-spesifikke T-celler var i stand til å gjenkjenne og drepe HLA-A2
+, PSGR-uttrykke prostatakreftceller, brukte vi en HLA- A2 negativ PC3-cellelinje og en HLA-A2 positiv LNCaP prostatakreft-cellelinje. Ekspresjonen av PSGR i disse to cellelinjer ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR. I samsvar med en tidligere rapport [31], PSGR ble sterkt uttrykt i LNCaP, men ikke i PC3, DU145 eller en normal prostata cellelinje PNT1A (figur 2 A). Som vist i figur 2B, PSGR3-, PSGR4-, eller PSGR14-spesifikke T-celler fra både friske donorer og pasienter kunne gjenkjenne og drepe HLA-A2 positiv, PSGR uttrykker LNCaP, men ikke HLA-A2 negativ PC3-celler. Disse resultater antyder at PSGR-spesifikke T-celler gjenkjenner T-celle-epitoper som er endogent prosessert og presentert av prostatatumorceller.
ekspresjon av PSGR mRNA i forskjellige cellelinjer ble bestemt ved RT-PCR (A). PSGR avledet peptid-spesifikke T-celler ble testet for cytotoksisitet mot både PC3 og LNCaP av LDH-analyse (B). Data fra B plottes som betyr ± SD. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, versus kontroll
T celler gjenkjenner PSGR-peptider i en HLA-I Restricted Manner
For å teste om svarene indusert. ved PSGR-avledede peptider er avhengig av CD8
+ T-celler ko-dyrkede vi PSGR-avledet peptid-spesifikke T-celler med T2-celler pulsert med eller uten tilsvarende peptidene i nærvær av GolgiStop i 4 timer. Farging for CD8-molekyler og intracellulær IFN-γ ble deretter utført. Bare CD8
+ T-celler ble funnet å produsere IFN-γ svar på T2-celler pulsert med tilsvarende peptider (figur 3A), mens CD4
+ T-celler ikke produsere IFN-γ (data ikke vist).
PSGR-avledet peptid-spesifikke T-celler ble ko-dyrket med T2-celler pulsert med eller uten et gitt peptid i nærvær av GolgiStop i en 48-brønns plate i 4 timer ved 37 ° C. Celler ble farget med anti-CD8 og anti-IFN-γ, og deretter analysert på et FACSCalibur maskin (A). PSGR-avledet peptid-spesifikke T-celler ble ko-inkubert med LNCaP-celler alene i medium, eller med LNCaP-celler i nærvær av enten anti-HLA-I-mAb (W6 /32), HLA-II mAb eller en kontroll mAb (anti -CD19 mAb). Etter 4 timers inkubasjon ble cytotoksisiteten mot LNCaP bestemmes av LDH-analyse (B). Data fra B plottes som betyr ± SD. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. *
P
. 0,05, versus kontroller
For å avgjøre om anerkjennelse av LNCaP celler ved PSGR-avledet peptid-spesifikke T-celler er HLA-I begrenset, co- vi dyrkede LNCaP-celler med PSGR-avledet peptid-spesifikke T-celler i nærvær av enten anti-HLA-i-mAb (W6 /32) eller styre mAbs (HLA-II mAb eller anti-CD19-mAb). Som vist i figur 3B, ble cytotoksisiteten til disse peptid-spesifikke T-celler fullstendig inhiberes ved tilsetning av anti-HLA-I mAb, men ikke med anti-HLA- II (HLA-DR) eller et kontroll mAb (anti-CD19 ), noe som antyder at anerkjennelsen av LNCaP-celler etter PSGR-avledet peptid-spesifikke T-celler er HLA-i begrenset.
diskusjon
det er vel etablert at CD8
+ T-celler spille en avgjørende rolle i å kontrollere tumorutvikling og progresjon. Peptid-epitoper avledet fra tumor-assosierte antigener (TAA) kan gjenkjennes som antigener av T-celler i sammenheng med MHC-I molekyler [32], [33]. Identifikasjon av TAA og deres peptider som er anerkjent av T-celler er avgjørende for utviklingen av effektive kreftvaksiner.
Hensikten med denne studien var å identifisere HLA-A2 binding PSGR-avledet epitoper gjenkjent av CD8
+ T-celler i PBMC av friske personer og pasienter med prostatakreft. Tre forskjellige PC-baserte prediksjon algoritmer inkludert BIMAS, SYFPEITHI, og Rankpep ble brukt til å skanne PSGR proteinsekvens for HLA-A2 peptider basert på HLA-A2 bindende motiv. Bare peptider som ble spådd suksess med minst to av tre av de ulike databaserte prediksjon algoritmer ble inkludert. Tjueen 9mer eller 10mer peptider ble valgt i denne studien i henhold til dette kriteriet. Alle disse peptidene ble testet for deres evne til å stimulere PBMC fra enten friske eller prostata kreftpasienter for å frigjøre IFN-γ. Av 21 peptider, tre peptider ofte indusert spesifikke T-celle responser i PBMC hentet fra enten friske frivillige eller kreftpasienter, og disse peptid-spesifikke T-celler også anerkjent HLA-A2
+ PSGR-uttrykke LNCaP celler, noe som tyder på at disse peptidene er naturlig behandlet av prostatakreftceller
PSGR er en prostata vev-spesifikke genet med homologi til G-protein-koblede odorant reseptor genet familie, og det er spesielt uttrykt i humane prostata vev [23] – [25].. Uttrykket av PSGR er betydelig høyere i menneskelige prostata intraepitelial neoplasi og prostatakreft enn normalt vev [25]. Forbløffende nok selv PSGR har vært ansett for å være en roman mål for prostatakreft immunterapi, T-celle epitoper avledet fra PSGR har ikke blitt identifisert. Dette er, så vidt vi vet, den første rapporten til å identifisere og karakterisere PSGR-avledet epitoper gjenkjent av CD8
+ T-celler. Identifiseringen av PSGR-avledet epitoper gjenkjent av T-celler bekrefter ytterligere PSGR som et lovende mål for utviklingen av kreftvaksiner.
fleste TAA er selvantigener [34], og derfor, selv-toleranse kan forekomme i en forsøke å beskytte individet fra utvikling av autoimmunitet. Dette anses å være et stort hinder i induksjon av TAA-spesifikke T-celler som er i stand til å utrydde svulster
in vivo.
Men i vår studie, selv om PSGR er uttrykt i normal prostata vev, immuntoleranse mot PSGR kan bli brutt, ettersom T-celle responser mot PSGR-avledet epitoper var ofte påvises i PBMC fra enten friske eller prostatakreftpasienter.
Et stort antall immunterapi kliniske studier basert på vaksiner med tumorlysatene, TAA proteiner, TAA peptider og RNA eller DNA som koder for TAA har allerede blitt gjennomført. Men de fleste av disse studiene har ikke oppnådd ønsket resultat. En grunn er at ekspresjonen av disse TAA er heterogen blant svulster fra forskjellige pasienter, og kan variere selv blant metastaser erholdt fra en pasient [35], [36], og dermed immun flukt kan oppstå når immunterapeutisk tilnærmingen er kun basert på en TAA. For å unngå immun flukt, vaksinebasert immunterapeutiske strategier som er rettet mot flere tumorantigener er avgjørende for utviklingen av vellykkede kreftvaksiner. Således identifikasjon av ytterligere prostata spesifikk tumorantigener, slik som PSGR, for T-celle-basert immunterapi er fortsatt behov for, til tross for at et antall av prostata spesifikke tumorantigener inkludert PSA [12], [13], PSCA [16], PSMA [ ,,,0],17] -. [19], PAP [20], Prostein [14], [15] og trp-p8 [21], er blitt identifisert i de siste årene
FDA har nylig godkjent en kreft vaksine, Sipuleucel-T, for behandling av pasienter med avansert prostatakreft basert på et fase III-studie [8]. Sipuleucel-T fremstilles fra autologe PBMC inneholdende antigenpresenterende celler som er inkubert med et rekombinant protein bestående av et PAP knyttet til granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF). Sipuleucel-T antagelig virker delvis ved å forsterke PAP-spesifikke CD8
+ T-celle responser, noe som ytterligere demonstrerer viktigheten av tumor antigen-spesifikke CD8
+ T-celler indusert av kreftvaksiner. Så langt er Sipuleucel-t den første cellulære Immunterapeutisk middel er godkjent av FDA for å brukes for behandling av kreftpasienter. FDA godkjenning av Sipuleucel-T som et terapeutisk kreftvaksine ikke bare bekrefter effektiviteten av cancer immunoterapi, men gir også en sterk drivkraft i feltet av kreft immunologi [37]. Derfor er identifisering og utvikling av mer romanen TAA inkludert PSGR og peptid derivater anerkjent av CTL definitivt viktig å legge til rette for utvikling av effektive kreftvaksiner mot prostatakreft samt andre typer kreft i fremtiden.
Videre epitopene gjenkjent av CD8
+ T-celler kan bli anvendt som diagnostiske verktøy for å overvåke peptid-spesifikke CD8
+ T-celler hos individer i løpet av immuniseringen, og dermed å identifisere optimale tidsrammer for immunisering under behandlingen, samt om påfølgende vaksinasjoner er nødvendig i individer når anti-tumor immunitet avtar.
i sammendraget har vi identifisert tre nye PSGR-avledet CTL-epitoper. Siden PSGR uttrykket er sterkt oppregulert i humane prostatakreft, kan PSGR-avledet peptider fungerer som diagnostiske verktøy eller immunterapeutiske mål av kreft vaksiner alene eller i kombinasjon med andre epitoper som er avledet fra andre prostata-spesifikt antigen.
takk
Vi vil gjerne takke legene. Adebusola Alagbala Ajibade og Audrea M. Burns for kritisk lesing av manuskriptet og Hui En for å få hjelp i figur forberedelse.
