Abstract
Nyere arbeider har fremhevet glutaminase (GLS) som en sentral aktør i kreftcelle metabolisme, noe som gir glutamin avledet karbon og nitrogen til reaksjonsveier som støtter proliferasjon. Det er betydelig interesse i målretting GLS for kreftterapi, men genet er ikke kjent for å bli mutert eller forsterkes i tumorer. Som et resultat, er identifisering av medgjørlig markører som forutsier GLS avhengighet behov for oversettelse av GLS inhibitorer til klinikken. Heri vi validere et lite molekyl inhibitor av GLS og viser at ikke-småcellet lungecancerceller som er merket med lav E-cadherin og høy ekspresjon vimentin, kjennetegnene til en mesenkymal fenotype, er spesielt følsomme for hemming av enzymet. Videre lungekreftceller indusert til å gjennomgå epiteliale til mesenchymal overgang (EMT) erverve følsomhet for GLS inhibitor. Metabolske studier tyder på at mesenchymale celler har en redusert kapasitet for oksidativ fosforylering og økt mottakelighet for oksidativt stress, gjør dem ute av stand til å takle forstyrrelser forårsaket av GLS hemming. Disse funnene belyse selektive metabolske avhengig av mesenchymale lungekreftceller og foreslå nye veier som potensielle mål i denne aggressive krefttypen
Citation. Ulanet DB, Couto K, Jha A, Choe S, Wang A, Woo HK, et al. (2014) Mesenchymale Phenotype predisponerer lungekreft celler til svekket spredning og Redox stresseffekten av Glutaminase Hemming. PLoS ONE 9 (12): e115144. doi: 10,1371 /journal.pone.0115144
Redaktør: Pier Giorgio Petronini, Universitetet i Parma, Italia
mottatt: 16 juli 2014; Godkjent: 19 november 2014; Publisert: 12.12.2014
Copyright: © 2014 Ulanet et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Alt arbeidet ble finansiert av Agios Pharmaceuticals. De bevilgende myndighet, gjennom sine ansatte, som er forfatterne av dette manuskriptet, hadde en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, og utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne er alle ansatte i Agios Farmasi. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Det har blitt satt pris på i 60 år som glutamin (Gin) er en betinget essensiell aminosyre for veksten av kreftceller i kultur [1]. Glutamin er den mest tallrike sirkulerende aminosyre hos mennesker i en konsentrasjon på ca. 500 pM i serum, og mange studier indikerer at Gln er en hovedkilde for karbon og nitrogen i tumorceller [2], [3]. Ett enzym i særdeleshet, glutaminase, lokaliserer til mitokondriene og ser ut til å være kritisk for oppføring av glutamin karbon til trikarboksylsyre (TCA) syklus i mange kreftceller [4], [5]. Glutamin omdannes til glutamat og ammoniakk ved glutaminase, og glutamat karbonet blir deretter transportert inn i det TCA-syklusen via omdanning til a-ketoglutarat (α-KG) av flere forskjellige enzymer, inkludert glutamat dehydrogenase og forskjellige aminotransferase. Pattedyr bære to gener som koder mitokondrie glutaminase,
GLS1 plakater (eller KGA) og
GLS2 plakater (eller LGA), som opprinnelig ble identifisert i normal nyre og lever, henholdsvis [6].
GLS1
genet produserer to dominerende spleise varianter koding kanoniske GLS1 (også kjent som KGA) og GAC, men differensial funksjonene til disse to variantene ikke er godt forstått [7].
Flere elegant studier har vist bidraget av carbon avledet fra Gin inn i den TCA-syklusen via glutaminolysis [8], [9].
GLS1
uttrykk har også blitt identifisert som et mål av myc onkogen [10], og har blitt brukt som en effektor Rho-mediert transformasjon i brystkreftcellelinjer [11]. Interferens med GLS aktivitet via enten genetisk eller farmakologisk manipulasjon er blitt demonstrert ved en rekke grupper for å negativt påvirke veksten av enkelte kreftcellelinjer [11] – [13]. Basert på totaliteten av publiserte data på viktigheten av Gin og glutaminase i kreft, har GLS blitt fremhevet som et potensielt legemiddel mål for onkologi indikasjoner [14]. Så vidt vi vet
GLS1
ikke er mutert eller forsterkes i kreft hos mennesker. For å lette bruken av GLS1 inhibitorer i klinikken en bedre forståelse av de genetiske og fenotypiske sammenhenger som driver avhengighet av GLS1 er nødvendig.
I denne studien validere vi on-target celle-basert aktivitet av en publisert GLS1 inhibitor, BPTES (bis-2- (5-fenylacetamido-1,2,4-tiadiazol-2-yl) etyl-sulfid) [15], som viser at den virker spesifikt via en GLS1-avhengig mekanisme for å indusere anti-proliferativ og metabolske forstyrrelser i cellene. Vi bruker BPTES som et validert verktøy forbindelse for å screene et panel av lungekreft linjer og identifisere en delmengde av linjer som viser GLS avhengighet og uttrykke markører som er karakteristiske for en mesenchymale fenotype. TGF-β mediert induksjon av EMT sensibiliserte celler til GLS hemning og er forbundet med nedsatt mitokondrieluftkapasitet og øket følsomhet for oksidativt stress.
Resultater
Cell linje Disse funnene peker på en selektiv rolle for GLS i mesenkymale NSCLC celler, som utnytter GLS for å gi en karbonkilde for oksidativ fosforylering og for å opprettholde Redox balansen som kreves for mobilnettet spredning. panelet og validering av BPTES som et verktøy sammensatt
for å få innsikt i genetiske /fenotypiske determinanter av GLS avhengighet, skjermet vi et panel av cellelinjer med den publiserte GLS1 inhibitor BPTES [15]. Vi fokusert spesielt på en tumortype, lungekreft, på grunn av det store antallet etablerte cellelinje modeller tilgjengelig. Av de 62 lunge linjene valgt for analyse ved hjelp BPTES, har 44 blitt klassifisert som NSCLC (S1 tabell i S2 File). Relative vekstrater (mu_
BPTES /mu_
DMSO) ble beregnet etter medikamentell behandling for å best sammenligne relative følsomhet for BPTES mellom cellelinjer som varierte i dobling tid. Omtrent 30% av disse 62 linjene oppviste betydelig følsomhet for BPTES som angitt i 40% reduksjon i vekstrate (figur 1A, S1 S2 i tabell fil.). Graden av følsomhet for BPTES var svært variert, med celledød tydelig i enkelte cellelinjer (μ
BPTES /μ
DMSO 0; f.eks A427) og en nær fullstendig mangel på respons i andre (f.eks NCI- H1563). Siden CellTiter-Glo (CTG), som måler ATP-nivåer, ble brukt som en hurtig, surrogat metode for screening av celletallet etter BPTES behandling, vi bekreftet at effektene av glutaminase inhibering på cellulære ATP-nivåer var en representativ avlesning av celletallet. Vurdering av celle nummer av DNA innhold (Syto60) viste en tilsvarende effekt av BPTES behandling på celleproliferasjon som indikert av CTG i 72 timer endepunkt (S1 figur i S1 File).
(A) Sensitivitet av et panel av NSCLC-linjer til inhibering av vekst av 10 uM BPTES i en 72 timers proliferasjonsanalyse. Vekstrater (MU) plottet i forhold til DMSO kontroll for hver cellelinje (mu /max). (B, C) A427 foreldreceller eller celler som stabilt uttrykker en tom vektorkontroll (Con), vill-type GAC (GAC), eller en BPTES-resistent GAC enzym (GAC-BR) ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av BPTES (A ) eller den inaktive BPTES analoge, AGX-4769 (C), i en 72 timers proliferasjonsanalyse. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter med middelverdi og standardavvik er angitt. (D, E) Måling av isotopomer merket
13C (5) -Glu (D) eller
13C (4) Asp (E) fra celler behandlet i 4 timer med BPTES eller med inaktive analog AGX-4769. Resultatene er gjennomsnittet av tre replikater med standardavviket er angitt. Beregnede p-verdier fra student t-test,
(3 × 10
-8),
** (10
-9),
# (10
-7 ),
## (2 × 10
-6).
for å bekrefte at effekten av BPTES på cellene er på målet, vi konstruert A427 celler til overuttrykker cDNA som koder for en tidligere beskrevet BPTES resistent mutert GAC, kalt GAC-BR (F318A og F322A) og vurderes virkningen av BPTES på cellevekst av disse cellene i forhold til celler som overuttrykker villtype GAC (GAC-WT) eller tom vektor. GAC-BR er ute av stand til å binde BPTES men opprettholder katalytisk aktivitet [16]. Overekspresjon av GAC-BR gjengitt A427 celler resistente mot veksthemmende effekten av BPTES (Fig. 1B), mens celler som uttrykker tom vektor eller GAC-WT beholdt betydelig følsomhet for BPTES. Den beskjedent avstumpet effekten av BPTES på vekst av GAC-WT i forhold til foreldre eller tomme vektor uttrykker linjene er sannsynlig på grunn av ~2x økning i GAC uttrykk i denne modellen. Vi utnyttet også dette systemet for å adressere on-target effekter av BPTES ved modulering av de novo syntese av glutamat og aspartat fra glutamin. Figur S2 (i S1 fil) fremhever strømmen av karbon fra glutamin til glutamat og nedstrøms TCA-mellomprodukter som har blitt beskrevet [8], [9]. Overekspresjon av GAC-BR, men ikke GAC-WT, bedres den BPTES induserte blokk i glutamin strømme inn glutamat og aspartat (Fig. 1D, E). Den ufullstendige restaurering av
13C (5) -aspartate nivåer kan gjenspeile er særlig følsomme denne metabolitten til GLS hemming, kanskje på grunn av bidrag fra både karbon og nitrogen fra glutamin til aspartat biosyntese og /eller på grunn av effekter fra hemming av endogen GLS1 aktivitet. En biokjemisk inaktive BPTES analog, AGX-4769, med en konservativ modifikasjon (S3 figur i S1 File), ble brukt til å behandle de samme cellelinjer og hadde ingen effekt på spredning eller nedstrøms metabolitter (fig. 1C-E). Disse dataene indikerer at effekten av BPTES om spredning og modulering av nedstrøms metabolitter skyldes hemming av GLS1 og ikke på grunn av off-target effekter.
Som enda et middel for å validere nytten av BPTES som et verktøy sammensatte til skjermen for GLS avhengighet, utførte vi siRNA mediert knockdown av GLS1 (enten totalt eller GAC spesifikt) i en undergruppe av seks av de NSCLC linjer fra panelet. Alle 3 linjer som var følsomme for BPTES var også følsomme for GLS KD, mens tre som ikke var følsomme for BPTES var mindre /ikke sensitive (S4 figur i S1 File). Mens KD av GAC alene resulterte i en betydelig veksthemming i BPTES sensitive linjer, KD av total GLS1 resulterte i en enda mer dyptgripende nyrefunksjon indikerer at begge isoformer av GLS1 (KGA og GAC) bidra til vekst /levedyktighet av disse cellene.
GLS1 avhengighet i NSCLC med en mesenchymale (EMT) fenotype
Basert på omfanget av BPTES følsomhet observert over de 62 cellelinjer (Fig. 1), søkte vi etter transkripsjons markører som er forbundet med følsomhet eller resistens ved hjelp av en offentlig tilgjengelig datasett fra Broad Institute (https://array.nci.nih.gov/caarray/project/golub-00327). Av notatet, verken GLS1 eller GLS2 mRNA uttrykk nivåer korrelert med følsomhet. De 200 beste sondene som viser mest signifikant korrelasjon med følsomhet ble deretter sendt til GeneGO pathway analyse (https://portal.genego.com/cgi/data_manager.cgi). Vi bemerket at ingen metabolisme messige reaksjonsveier er sterkt assosiert med BPTES respons, noe som indikerer at ingen iboende forskjeller i metabolisme mellom sensitive og resistente celler ikke er bredt reflekteres på transkripsjonsnivå (tabell S2 i File_S2). Interessant, fire av de 25 banene ble knyttet til EMT (rangerer en, 15, 23, 25, Fig. 2A). Immunrespons trasé ble også sterkt representert i denne analysen. Mens vi valgte å fokusere våre undersøkelser om sammenhengen mellom EMT og GLS1 avhengighet, er det bemerkelsesverdig at en kobling mellom NF-kB og glutaminaseaktivitet har blitt demonstrert av andre [11], [17].
(A ) GeneGo analyse indikerer fire topp-ranking mesenchymale signaturer som korrelerer med BPTES følsomhet. P-verdiene beregnes innenfor GeneGo programvaren ved hjelp av hypergeometrisk fordeling. (B) Anti-sammenheng mellom høy E-cadherin lav vimentin RNA uttrykk nivåer og følsomhet for BPTES. (C) Mu /mumax verdier avbildet etter 72 timers behandling av NSCLC linjer med 10 mikrometer BPTES. Like protein mengder kreftcellelinje ekstrakter ble elektroforese, med gruppen av mer sensitive linjer på venstre og minst følsom på høyresiden, og immunoblottet for de angitte proteiner. Histon H3 ble anvendt som en kontroll lasting. (D) Kvantitering av gjennomsnittlig GAC proteinnivåer i forhold til PC-proteinet uttrykket (+/- SEM) i BPTES sensitive (n = 7), middels (n = 7), og ufølsomme (n = 7) linjer.
P
= 0.03 sammenligne GAC /PC protein nivåer i sensitive i forhold til ufølsomme linjer;
P
= 0,06 sammenligne følsomme for mellom grupper (uparet to-tail t-test).
For å identifisere spesifikke markører predikerer BPTES følsomhet, undersøkt vi listen over betydelig korrelerte prober fra ovennevnte analyse for individuelle EMT relaterte gener. E-cadherin og vimentin var positivt og negativt korrelert med vekst i nærvær av BPTES (det vil si mangel på sensitivitet til GLS hemming), henholdsvis (fig. 2B). Lav E-cadherin /høy vimentin er godt definert markører for celler som har en mesenchymale fenotype [18]. En signifikant korrelasjon ble også observert i flere andre gener vanligvis modulert under EMT, inkludert claudin4 /7 og ZEB1 (tabell S3 i File_S2). Etter den første BPTES skjerm, en undergruppe av 21 av de NSCLC linjene ble re-undersøkt for BPTES følsomhet og analysert for protein uttrykk nivåer av utvalgte markører identifisert fra transkripsjons profilering analyse (figur 2C, D;. Tabell S4 i File_S2). I 6/7 av de beste sensitive NSCLC linjer, ble lav E-cadherin og høy vimentin proteinnivåer reproduserbart observert (Fig. 2C). Gruppen av sensitive linjer ble også preget av en gjennomsnittlig høyere andel av GAC /pyruvat karboksylase (PC) protein nivåer (Fig 2C, D;.
P
= 0,03). Lignende resultater ble oppnådd sammenligne de totale GLS1 /PC-nivåer. Vi valgte å fokusere på GAC nivåer som dette isoform dominerer i de fleste kreftceller. PC protein nivåer alene var signifikant forhøyet i ufølsom i forhold til sensitive linjer (
P
= 0,02) og mRNA nivåer negativt korrelert med BPTES følsomhet i større panel av 60+ lungekreft linjer skjermede (Pearson korrelasjon faktor: 0,29 ; Pearson
P
verdi: 0,03). Siden pyruvat karboksylase kan erstatte glutaminase i å tilby karbon til TCA syklus [19], foreningen av endrede GAC /PC-forhold med følsomhet for GLS hemming antyder muligheten for at alternative moduser av karbon oppføring i TCA kan påvirke GLS avhengighet.
Interessant, de tre NSCLC linjene som var mest følsomme for BPTES (A427, LXF289, SW1573) alle bærer aktiverende mutasjoner i β-catenin (T41A i A427 og LXF289, S33F i SW1573, tabell S4 i File_S2). Wnt /β-catenin signalering er en av flere veier som har vært implisert i å drive EMT [20]. Som et resultat har vi brukt siRNA mediert knockdown av β-catenin i A427-celler for å fastslå om tap ville resultere i en forandring i følsomheten for BPTES. Påfallende, β-catenin knockdown medførte redusert følsomhet for BPTES behandling (fig. 3A). Interessant nok var reduksjonen i β-catenin proteinnivåer ledsaget av en økning av E-cadherin nivåer (Fig. 3B), som er tidligere beskrevet i blærecancerceller [21]. I fravær av BPTES behandling, β-catenin KD resulterte i en beskjeden. (23% reduksjon;
P
= 0,02) funksjon i cellevekst (Fig. 3A)
(A) A427 celler ble transfektert med ikke-targeting (NT) eller β-catenin målretting sirnas og behandlet med de indikerte konsentrasjoner av BPTES (venstre panel). Vekstratene ble normalisert til DMSO behandlede celler transfektert med NT sirnas. Høyre panel viser effekten av β-catenin sirnas på vekst av DMSO behandlede celler. (B) Immun av A427 proteinekstrakter som samles inn fra cellene 72 timer etter transfeksjon. (C) NCI-H358-celler ble behandlet med 25 ng /ml TGF-ß i 4 uker. Induksjon av EMT ble bekreftet ved tap av E-cadherin og gevinst på vimentin. EMT ble ledsaget av en økning i GAC forhold til PC-proteinnivåer (Resultatene er representative for 2 uavhengige eksperimenter). Actin nivåer indisert for protein normalisering. (D) NCI-H358 foreldre og 6wk TGF-ß behandlede celler ble behandlet i tre eksemplarer med BPTES i 72 timer og cellevekst vurdert av CTG. Resultatene er representative for 3 uavhengige eksperimenter og plottes som gjennomsnittlig vekstrate (+/- SD) sammenlignet med DMSO behandlede celler.
TGFB-indusert EMT i NCI-H358 NSCLC celler fører til GLS1 avhengighet
for bedre å forstå bidraget fra mesenchymale versus epitelial fenotype til GLS avhengighet, behandlet vi NCI-H358-celler, som er fenotypisk epitel (høy E-cadherin /lav vimentin) og utviser moderat følsomhet overfor BPTES (fig. 2C), med TGFfi å indusere EMT. Som det har blitt rapportert [22], TGFp forskjøvet NCI-H358 linje til en mesenchymale fenotype som demonstrert ved redusert E-cadherin og forhøyet vimentin (Fig. 3C). Spesielt, GAC protein nivåer ble også berørt i løpet av denne overgangen, med en 2-ganger økning i proteinnivået i mesenchymale variant (fig. 3C). I motsetning til dette ble PC-nivåer noe redusert (1,4 x reduksjon) ved EMT, noe som resulterer i en økt GAC /PC-forhold (fig. 3C). Interessant, samtidig med økningen i GAC uttrykk, nivåer av mindre fremtredende uttrykt KGA isoform redusert (~40%) ved EMT. Forskriften og potensialet differensial funksjonen til de ulike GLS1 isoformer er fortsatt uklart. I samsvar med den modell som forutsier mesenchymale karakter GLS1 avhengighet, viste de TGFp-behandlede NCI-H358-mesenchymale celler betydelig forbedret følsomhet for å BPTES i forhold til de ubehandlede celler (fig. 3D). Den TGFB behandlet linjen hadde en 1,5-2 ganger redusert veksttakt i forhold til foreldrelinjen, men fra den større panel linjer vist, var det ingen sammenheng mellom vekst og følsomhet for BPTES. Disse data, sammen med uttrykket analyser av cellelinjen panel, sterkt hevder at mesenchymal lungekreftceller er disponert for avhengighet av GLS1.
Siden glutaminase tjener som en sentral regulator av glutamin karbon inntreden i TCA, vi spurte om hemming av GLS1 ulikt påvirker oksidativ fosforylering (OXPHOS) i epiteliale forhold til mesenchymale (NCI-H358_M) linje. Mitokondrie oksygenforbruk ble målt i sanntid etter BPTES behandling. Ved baseline O
2 forbruk rate (OCR) var ikke signifikant forskjellig mellom de to linjene (s5a figur i S1 File). Etter to timers behandling med BPTES, ble OCR forhold redusert i epitel og mesenchymale linjer i forhold til DMSO behandlede celler (figur 4A;. S5b figur i S1 File). Spesielt med økende tid etter BPTES behandling, OCR i foreldrelinjen sakte utvinnes, mens OCR fortsatte å avta med tid i NCI-H358_M celler (fig. 4A, S5b figur i S1 File). Nedgangen i OCR var ikke gjenspeiler redusert celle nummer på dette tidlig (20 timer) tidspunkt (S5C figur i S1 File). For å bekrefte at denne effekten av GLS hemming var ikke unikt for NCI-H358-celler vi har utført det samme eksperimentet i et ekstra par bokstaver (NCI-H1703) og ufølsomme (NCI-H1563) celler. Inhibering av O
2-forbruket var svært selektivt for GLS1 avhengige NCI-H1703 linje (fig. 4B) som antyder at svekkelse av oksidativ fosforylering er en komponent av den anti-proliferative effekter indusert av GLS inhibering.
(A) NCI-H358-epitel og mesenkymale linjer eller (B) NCI-H1703 (BPTES sensitiv) og NCI-H1563 (BPTES ufølsomme) celler ble behandlet med DMSO eller 8 uM BPTES og oksygenforbruksrate (OCR) ble overvåket over en 20 hr behandling. Dataene normalisert til OCR ved tid null (100%) og presentert som middelverdier +/- SEM.
P
= 0,024 sammenligne endringer i oksygenforbruk med BPTES i epiteliale vs mesenchymale linjer;
P
= 0,00017 sammenligne NCI-H1703 og NCI-H1563-celler. (C) OCR etter behandling med de angitte medikamenter for å forurolige mitokondriell respirasjon. Data normalisert til OCR måling før oligomycin behandling. (D) Tilsetning av pyruvat til media gjenoppretter den reduserte FCCP respons i mesenchymale linje. Gjennomsnittsverdier +/- SEM indikert. Resultater representant for 2-3 uavhengige eksperimenter.
Differensial virkningen av BPTES på mitokondriell respirasjon i mesenchymale versus epitel linje ledet oss til å stille spørsmål ved om disse linjene kan mer generelt skiller seg i deres evne til å adaptivt svare på metabolsk /mitokondrie stress. For å utforske en slik mulighet, utførte vi sekvensiell behandling av celler med oligomycin (ATP syntase inhibitor), FCCP (frakobler åndedrett fra ATP syntese, tillater vurdering av maksimal respirasjon), og rotenon (hemmer inntrengning av elektroner ved Complex I) [23]. Påfallende, de NCI-H358_M celler var defekt i økende O
2 forbruket i respons til FCCP, en indikasjon på en nedre luftkapasitet på disse cellene (figur 4C,. S5D figur i S1 File). Nylig ble det demonstrert at pyruvat er nødvendig for stimulering av maksimal OCR i brystkreftceller [24]. Interessant, tilleggs supplering av RPMI medium (inneholdende 11 mM glukose og 2 mM glutamin) med 2 mM pyruvat, i nærvær av mitokondrielle inhibitorer gjenenes evne til NCI-H358_M celler til å svare på FCCP med en øket OCR (fig. 4D) , noe som indikerer at disse cellene kan være ute av stand til å effektivt utnytte endogene forsyninger av pyruvat /andre alternative karbonkilder til tilstrekkelig drivstoff deres reserve luftkapasitet. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at overgangen til en mesenchymale tilstand kan føre til en svekket evne til å adaptivt svare på GLS hemming og potensielt andre mitokondrielle påkjenninger.
Vi neste testet om alternative karbonkilder kan også redde svekket veksten av NCI-H358_M celler etter BPTES behandling. Tilsetning av enten natrium pyruvat eller en celle gjennomtrengelig analog av α-KG, dimetyl-2-oksoglutarat (m-αKG), til vekstmediet resulterte i en redning av proliferasjon til ~85-90% som ble observert i bærerbehandlede celler, sammenlignet til ~45% for dimetylsuksinat (fig. 5). I motsetning αKG og pyruvat, har succinate vidt vi vet ikke vært rapportert å ha anti-oksiderende egenskaper. Siden glutamat avledet fra glutamin kan trekkes inn i glutation (GSH) biosyntese og bidra til å opprettholde redox balanse [25] (så vel som å fyre opp under TCA via konvertering til a-KG) vi undersøkte også effekten av en celle gjennomtrengelig derivat av GSH , glutation redusert etylester (GSH-MEE) og antioksidanten N-acetylcystein (NAC) på BPTES indusert veksthemming. Både GSH-MEE og NAC alene gjenveksten til ~75-85% av den bærerbehandlede celler, mens kombinasjonen av pyruvat og NAC gjenopprettet proliferasjon til nær 95%, som fra kontrollceller (Fig. 5). Disse funnene tyder på at svekkelser i både Redox stress og TCA syklus anaplerosis bidra til anti-proliferative effekter av GLS hemming i disse cellene.
NCI-H358_M celler ble behandlet med DMSO eller 8 mikrometer BPTES i tre eksemplarer i nærvær eller fravær av dimetyl-2-oksoglutarat (m-α-KG), natriumpyruvat, dimetylsuksinat, glutation redusert etylester (GSH-MEE), eller N-acetylcystein (NAC) i 96 timer og cellevekst ble målt ved CTG. Resultater representant for 2 uavhengige eksperimenter. Verdiene viser midlere vekstrate +/- SD forhold til celler behandlet med DMSO alene.
P
verdier sammenligne DMSO vs BPTES behandling med de ulike redningsforhold:
P
= 0,0001 (ingen redning),
P
= 0,04 (m-α-KG),
P
= 0,001 (2 mM pyruvat),
P
= 0,0003 (m-succinate),
P
= 0,01 (GSH-MEE),
P
= 0,003 (NAC),
P
= 0,06 (pyruvat + NAC).
for ytterligere å belyse mekanismen bak den differensielle følsomheten til epiteliale og mesenchymale NCI- H358-celler til GLS hemming, vi utførte en metabolsk analyse av disse cellene, undersøke mønstre av glutamin og glukose (Glc) utnyttelse (Glc merking skjematisk avbildet i S6 figur (i S1 File) og virkningene av GLS hemming. Vi først bekreftet at BPTES ble forhold hemme GLS i begge linjene ved å overvåke
13C (5) -Gln og
13C (5) -Glu nivåer ved LCMS i celler matet med jevnt merket
13C-GLN (U-
13C-Gln). Ved hjelp av
13C (5) -Glu /
13C (5) -Gln nivå som en avlesning for GLS aktivitet, demonstrert vi effektiv (97%) hemning av GLS aktivitet både epiteliale og mesenchymale linjer (fig. 6A; S7 Figur i S1 File). Disse data indikerer at de aller fleste av omdannelse av Gin til Glu i disse cellelinjene blir katalysert ved GLS1 og ikke GLS2 eller andre Gln utnytte enzymer. En mulig hypotese for å forklare forskjellig sensitivitet av de to linjene var at mesenchymale celler kan fortrinnsvis utnytte glutamin til drivstoff TCA. Overraskende, en 4 timers innmating av celler med U-
13C-Gln demonstrerte betydelig bidrag av glutamin til citrat bassenger i både den epiteliale (63%) og mesenchymale (49%) linje (fig. 6B). I samsvar med den fremtredende bidrag glutamin til citrate bassenger, BPTES en 20 timers behandling reduseres de totale nivåer av TCA metabolitter, inkludert α-KG og citrate (Fig.6C, S7 figur i S1 File). Liten eller ingen effekt av stoffet på celle tall ble observert innen denne tiden av BPTES behandling i disse (S5C figur i S1 File) og andre cellelinjer testet (S1 figur i S1 File). Til tross for det faktum at glutamin bidro tydelig til citrat-pools i epiteliale sammenlignet med mesenchymale linje (fig. 6B), citrat-nivåene falt mer dramatisk og til lavere (61%) totalt antall nivåer i BPTES behandlede NCI-H358_M celler. Tatt sammen med den økte fallet i O
2 forbruk av BPTES i mesenchymale sammenlignet med epithelial linje, tyder disse data på en mulig svekkelse i muligheten av mesenchymale linjen for å tilpasse seg til en blokk med Gln strømmen inn i TCA, kanskje på grunn til en differensial evne til å bruke alternative karbonkilder i denne innstillingen.
NCI-H358 epitelial (E) og mesenkymale (M) linjene ble behandlet med DMSO eller 8 uM BPTES i 20 timer. Celler ble enten umerket eller U-
13C-GLC eller U-
13C-GLN etiketter ble inkludert for de siste 4 timer med medikamentell behandling og nivåer av sentrale karbon metabolitter ble målt ved LCMS. (A) Inhibering av GLS aktivitet ved BPTES. (B) Prosent av citrate basseng som er enten umerket eller inneholder karbon som stammer fra U-
13C-GLN (DMSO behandlede celler). (C) TCA metabolitten og glutation basseng størrelser +/- BPTES. Data ble samlet i tre eller fire eksemplarer fra 3 uavhengige eksperimenter (for α-KG og citrat) og vist som gjennomsnitt +/- SD nivåer i forhold til NCI-H358 DMSO behandlede celler; verdier ble normalisert for celle nummer,
P
= * 1 × 10
-5; ** 4 × 10
-6; *** 9 × 10
-8 (D) Citrate isotopomer prosenter fra
13C (6) -Glc merkede celler behandlet +/- BPTES. *
P
= 0,001, **
P
= 0,002 sammenligne% citrate m + 2 i DMSO eller BPTES behandlet E vs M celler, henholdsvis. (E) Endringer i relative forholdstall på DHAP og 3PG nivåer i EvsM celler +/- BPTES.
P
verdier for sammenligning av metabolitter +/- BPTES: * 0.1, ** 0,57,
# 0,04,
## 0,07. Resultater representant for 2 uavhengige eksperimenter.
Interessant, overvåking av glukose flyt inn i TCA ved hjelp av en U-
13C-GLC-feed (S7 figur i S1 File), avslørte glukose bidrag til 28% og 37% av den totale citrat bassenget i epitel og mesenchymale celler, respektivt; ved BPTES behandling ble denne relative bidrag redusert til 15% i epiteliale og 3% i mesenchymale linje (figur 6D;. S7 figur i S1 File), som indikerer en selektiv blokk i glukose strømning inn i TCA med BPTES behandling i mesenchymale linje. I samsvar med denne oppfatningen, undersøkelse av glykolytiske mellom basseng størrelser avslørte økt DHAP og redusert 3-PG nivåer (Fig 6E,. S7 figur i S1-fil) med BPTES behandling i mesenchymale linjen, noe som indikerer en blokk i flyten på dette trinnet i glykolysen.
i tillegg til forskjeller i metabolitter involvert i bioenergetisk /biosyntetiske veier, de NCI-H358_M celler hadde lavere redusert glutation (GSH) nivåer i både basal og BPTES behandlet innstillingen i forhold til epithelial variant (fig 6C.; S7 Figur i S1 File). I 6 ekstra NSCLC linjer undersøkt, var det en lignende trend mellom graden av nedgang i GSH bassenger med BPTES følsomhet (S8A figur i S1 File), som fører oss til å undersøke effektene av BPTES behandling på ROS-nivåer.
Modulation av oksidativt stress ved GLS hemming i mesenkymale NSCLC celler korrelerer med følsomhet
for å teste om følsomhet for GLS hemming korrelert med økt oksidativt stress på BPTES behandling, vi målte nivåer av reaktive oksygenforbindelser (ROS) ved hjelp av CM-H2DCFDA i NCI-H358 epitelial og mesenchymale par samt et annet par av BPTES sensitive (NCI-H1703) /ufølsomme (NCI-H838) linjer. NCI-H838 linjen ble valgt for undersøkelse siden, lik den NCI-H358 linje, viser det dårlig sensitivitet overfor BPTES tross for å ha et betydelig bidrag av Gin å TCA karbon bassenger (upubliserte data). Mens GLS hemming gitt økte ROS nivåer i alle de fire linjene som ble testet, de sensitive linjene utstilt et større omfang av økning i ROS av BPTES (7,4 vs 4,4 ganger i NCI-H358_M forhold til foreldre, 15,9-fold vs 4,6 ganger i NCI -H1703 sammenlignet med NCI-H838-celler, fig. 7A). Interessant nok har det vist seg at oksidativt stress kan redusere karbohydrat fluks gjennom glykolyse via inaktivering av enzymene, inkludert GAPDH [26]. Samlet utgjør disse data tyder på en modell der økt ROS generasjon følgende GLS hemming i mesenchymale celler sensitizes til GLS hemming delvis via hemming av glukose strømme inn TCA, noe som resulterer i reduserte citrate nivåer og OXPHOS (Fig. 7C).
(A) Cellene ble behandlet med BPTES i 20 timer og ROS-nivåer målt med CM-H2DCFDA fargestoff. Resultater representant for 3 uavhengige eksperimenter; data plottet som ROS-nivåer i forhold til DMSO behandling av hver cellelinje (gjennomsnitt +/- SD);
P
= 0.01 sammenligne induksjon av ROS ved BPTES i 2 par av sensitive /ufølsomme linjer. (B) NCI-H358 epitel og mesenchymale linjer ble behandlet med BSO eller H
20
2 i en 72 timers CTG analysen. Resultater representant for 2-3 uavhengige eksperimenter og plottet som gjennomsnitt +/- SD. (C) Modell for følsomheten av mesenchymale NSCLC-celler til GLS inhibering. Hemming av Gin → Glu konvertering av BPTES svekker flyten av karbon fra Gin inn i TCA i begge linjene.
