Abstract
De fleste nyrecellekarsinomer (RCC) er preget av tap av funksjon av tumorsuppressorgenet von Hippel Lindau (VHL), som fungerer som ubiquitin ligase for hypoksi-induserbar faktor-1α ( HIF-1α). I fravær av VHL, blir HIF-1α proteinet stabilisert og bidrar til tumorgenese. Nyere data viser antitumor effekt av VHL promoter i RCC-celler. Denne studien viser at N-myc nedstrøms-regulert gen 2 (NDRG2) er en potensiell regulator av VHL. NDRG2 er involvert i spredning og invasjonen av kreftcelle, dessuten er det ofte nedregulert i nyrecellekarsinom. Heri vi evaluert effekten av NDRG2 overekspresjon på spredning og invasjon i menneskelige nyrekreftceller. Den 786-O og A498 human nyrekreft cellelinje ble infisert med Ad-NDRG2 eller Ad-LacZ. Overekspresjon av NDRG2 ikke bare hemmet veksten av cellene, men også undertrykkes invasjonen. Videre studier viste at tumorsuppressorgenet VHL var oppregulert, mens transkripsjonsfaktor HIF-1a og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) ble nedregulert i 786-O-celler infisert av Ad-NDRG2. Til slutt, i en naken mus modell, intratumorale injeksjoner av Ad-NDRG2 hver 3 dager til sammen sju ganger betydelig hemmet veksten og angiogenese av xenopodet 786-O svulster. Som konklusjon, indikerer disse data at NDRG2 kan være involvert i proliferasjon og invasjon ved å påvirke ekspresjonen av VHL og HIF-1α. NDRG2 kan være en attraktiv terapeutisk mål for nyrecellekarsinom.
Citation: Gao L, Wu G-j, Liu B, Shen M-z, Pan T-j, Yu C-g, et al. (2013) oppregulering av pVHL sammen med nedregulering av HIF-1α ved NDRG2 Expression Demper spredning og invasjon i nyre kreftceller. PLoS ONE 8 (12): e84127. doi: 10,1371 /journal.pone.0084127
Redaktør: Georgios Gakis, Eberhard-Karls-universitetet, Tyskland
mottatt: 9 juli 2013; Godkjent: 12 november 2013; Publisert: 20.12.2013
Copyright: © 2013 Gao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Bevilgninger gitt ved National Natural Science Foundation of China (nr 81230043 og nr 81272812) og Chinese National Key Basic Research Development Program (2009CB521704). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nyrecellekarsinom (RCC) er blant de 10 mest vanlige kreftformen hos både menn og kvinner [1]. RCC omfatter en histologisk mangfoldig gruppe av faste tumorer, som oppstår fra forskjellige deler av nyren [2]. De aller fleste av RCC er klare cellenyrecellekreft (CCRCCs), preget av tap av funksjon av tumorsuppressorgenet von Hippel Lindau (VHL). Defekter i VHL genet er den vanligste årsaken til familiær CCRCC, og mer enn 80% av pasienter med sporadisk CCRCC har en inaktiv VHL genet eller tap av VHL genet [3].
VHL er en klassisk verge hemme renal startfasen [4-6]. Proteinet som kodes av VHL VHL genet, er en komponent av en E3 ubiquitin-ligaser kompleks som inkluderer elongin-B, elongin-C, og Cullin-2 [7,8]. Blant de godt dokumenterte substrater av den pVHL er den hypoksi-induserbar faktor (HIF-1α), som er en transkripsjonsfaktor som styrer ekspresjonen av hypoksi-indusert faktorer som pyruvat dehydrogenase kinase (PDK) -1, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og så videre [9,10]. Disse målgener har innflytelse på energiomsetningen, celleproliferasjon og metastasering av CCRCC [11]. Under normal oksygen binder HIF-1α pVHL gjennom sine hydroksylerte prolinresidier og polyubiquitinated av pVHL, som til slutt fører til nedbrytning av HIF-1α via proteasome. Under hypoksi, er HIF-1α ikke hydroksylerte og rømming fra pVHL-mediert degradering. Den labile HIF-1α danner så funksjonell transkripsjonsfaktor ved å knytte med konstitutivt uttrykt HIF-1β subenheten [12]. Sammen, binder dette komplekset til DNA-motiver referert til som hypoksi responselementer for å regulere ekspresjonen av et antall gener som er involvert i cellevekst, metastase og angiogenese. Derfor ved å fremme nedbrytning av HIF-1α, kan pVHL undertrykke HIF-1α stimulert transkripsjon og fungere som en nøkkel tumor suppressor [13]. pVHL tap er et vanlig arrangement i CCRCC, som fører til HIF-1α stabilisering og den opp-regulering av dens målgener. Det er blitt vist at VEGF ekspresjon ofte forhøyet sammen med HIF-1α oppregulering i mange humane cancere [14]. En tidligere studie viste at pVHL er i stand til å øke ekspresjon og aktivitet av en annen velkjent tumor suppressor, p53 [14]. Men hvordan pVHL selv er regulert har sjelden blitt rapportert. Nyere data har vist antitumor effekt av en pVHL promoter i RCC [15].
N-myc Nedstrøms regulert Gene 2 (NDRG2), er medlem av NDRG familien, er en nylig identifisert tumor suppressor. Det har blitt rapportert at NDRG2 ekspresjon nedregulert i en rekke forskjellige karsinomer, inkludert leverkreft, kreft i bukspyttkjertelen, meningeom og prostatakreft. Studier fra vår lab og andre har vist at NDRG2 er involvert regulering av celleproliferasjon, apoptose, differensiering og stressrespons [16-21]. Av notatet, vår tidligere studie antydet at NDRG2 oppregulert uttrykk for p53 og pVHL mens nedregulerer uttrykk for VEGF og HIF-1α i brystkreftcellelinjer [22]. Nylig er det rapportert at NDRG2 er nedregulert i CCRCC vev i forhold til tilstøtende ikke-neoplastiske vev [23]. Videre tvungen ekspresjon av NDRG2 hemmer veksten av klar celle RCC (CCRCC) cellelinjer og induserer celleapoptose [24]. Disse funnene tyder på at NDRG2 spiller en viktig rolle i kreftutvikling av CCRCC. Imidlertid er den nøyaktige rollen til NDRG2 i CCRCC ikke fullt ut forstått.
I denne studien forsøkte vi å finne ut om det er et regulatorisk sammenheng mellom NDRG2 og pVHL. Vi først undersøkt uttrykk korrelasjon mellom NDRG2 og pVHL i tumorvev fra CCRCC pasienter. Deretter utførte vi
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter for å undersøke effekten av NDRG2 overekspresjon på celle atferd, samt på uttrykk for pVHL og nedstrøms effektbokser, HIF-1α og VEGF .
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Menneskelige prøver ble innhentet fra alle pasienter med skriftlig informert samtykke. Både skriftlig informert samtykke og studien ble godkjent av Institutional Review Board av Xijing Hospital, fjerde Military Medical University. Musene som brukes i denne forskningen ble hentet fra fjerde Military Medical University, og ble opprettholdt på patogen-frie forhold. Alle prosedyrer ble utført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Review Board av Xijing Hospital, fjerde Military Medical University og dannet NIH retningslinjer for etisk bruk av dyr.
Tissue innsamling og immunhistokjemi
totalt 130 formalinfiksert parafin-embedded eksemplarer av primær klarcellet nyrecellekarsinom og deres tilstøtende normale nyre vev ble samlet ved Institutt for patologi av Xijing Hospital, Xi’an. Alle prøver ble innhentet fra pasienter som ga informert samtykke til bruk av overskytende patologiske prøver for forskningsformål. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke. Bruken av menneskelig vev i denne studien ble godkjent av Institutional Review Board av den fjerde Military Medical University og ble gjennomført i henhold til internasjonale retningslinjer for bruk av menneskelig vev. Anti-NDRG2 (1: 500 fortynning) antistoffer ble innkjøpt fra BD Corporation (BD, NY, USA). Anti-HIF-1a (1: 500 fortynning) og anti-VEGF (1: 1000 fortynning) antistoffer var fra Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-VHL antistoff (1: 500 fortynning) var fra Neomarkers Corporation (Taipei, Kina). Anti-β-aktin-antistoff (1: 2000 fortynning) var fra Sigma (Sigma, USA). Den immunhistokjemi kit ble kjøpt fra BOOSTER Company (Wuhan, CHN).
immunhistokjemi farging ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Både intensiteten og graden av immunologisk farging ble analysert semikvantitativt. Seksjoner uten merking eller med færre enn 5% merkede celler ble bedømt som 0. seksjoner ble bedømt som en 1 hvis 5-25% av cellene ble merket, som en 2 hvis 25-50% av cellene ble merket, og som et tre hvis 50-75% av cellene ble merket. Til slutt, merking av ≥75% av cellene ble merket som en 4. fargeintensitet ble scoret på samme måte, med 0 som brukes for negativ farging, en for svakt positiv, to for moderat positiv og 3 for sterkt positiv. Poengene for prosentandelen av positive celler og for fargeintensitet ble multiplisert for å generere et immunoreaktivt poengsum for hver prøve. Produktet av mengden og intensitetspoeng ble beregnet slik at en sluttresultatet av 0 indikerte ingen uttrykk, 1-4 antydet svak ekspresjon, 5-8 indikerte moderat ekspresjon og 9-12 er angitt sterk ekspresjon. Bildene ble samlet inn gjennom lysmikroskopi (Olympus, Japan).
Cellelinjer og reagenser
Menneskelige nyrekreft cellelinjer 786-O og A498 ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). Cellelinjene ble opprettholdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. For hypoksi behandling ble celler dyrket under hypoksiske betingelser (1% O
2, 5% CO
2 og 94% N
2) og høstet ved 24 timer etter infeksjon.
Cell vekstanalyse
celler ble sådd ut (5 x 10
3-celler per brønn) i triplikat i 96-brønners plater. Etter fjerning av medium, 40 MOI adenovirus som uttrykker NDRG2 [24] eller den negative kontroll-genet LacZ (Ad-LacZ) ble tilsatt i serumfritt RPMI 1640, inkubert i 2 timer, erstattet med friskt RPMI 1640 supplert med 10% FBS. Platene ble så inkubert i 0, 24, 48 og 72 timer. Antallet levedyktige celler ble bestemt ved anvendelse av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse og lesing av absorbansen ved 490 nm. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter.
Migrasjon og invasjon analyser
Cell migrasjon og invasjon analysene ble utført i hovedsak som tidligere beskrevet [15]. Invasjon analysen med en Matrigel-belagte membran og migrering analysen med en Matrigel-ubelagt membran ble utført ved anvendelse av en 24-brønners kammersystem (BD Biosciences, Bedford, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble trypsinisert og sådd ut i det øvre kammer på 2,5 x 10
5-celler /brønn i serumfritt medium. Vektoren som bærer LacZ eller NDRG2, ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 40, ble tilsatt umiddelbart etter cellekledning. Medium supplert med 5% FBS (anvendt som en chemo-tiltrekningsmiddel) ble plassert i den nedre brønnen. Inkubasjon ble utført i 24 timer ved 37 ° C i fuktet luft med en 5% CO
2 atmosfære. Cellene ble tillatt å migrere gjennom en porøs, Matrigel-belagt eller ubelagt membran (BD Biosciences). Etter inkubering ble kamrene fjernet, og invaderende celler på den nedre side av membranen ble fiksert med metanol og farget med Gimsa. Antallet av invaderende celler eller migrerende celler ble bestemt ved telling fem kraftige felt (x 400) på hver membran og beregnet som det gjennomsnittlige antall av celler pr felt. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter.
Western blot-analyse
Celler ble sådd ut (5 x 10
5 celler per brønn) i triplikat i 24-brønners plater . Etter fjerning av medium, 40 MOI Ad-NDRG2 eller Ad-LacZ ble tilsatt i serumfritt RPMI 1640, inkubert i 2 timer, erstattet med friskt RPMI 1640 supplert med 10% FBS. Etter dyrking i 24 timer ble cellene vasket med kald PBS og umiddelbart lysert i en lyseringsbuffer [1% Triton X-100 150 mmol /l NaCl, 100 mmol /l KCl, 20 mmol /l HEPES, 10 mmol /l EDTA, 1 mmol /l natrium-ortovanadat, 10 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin, og 1 pmol /L fenylmetylsulfonylfluorid] på is. Western blotting-analyse ble utført i henhold til standardprotokollen ved bruk av nitrocellulose-membraner (Bio-Rad). For immunoblotting ble membraner inkubert med primære antistoffer for over natten ved 4 ° C, etterfulgt av 2 timers inkubering med en 1: 2000 fortynning av pepperrotperoksydase (HRP) -bundne sekundært antistoff. Til slutt ble de immunoreaktive proteinene detektert av kjemiluminescens påvisningssystem.
Immunofluorescens-analyse
786-O-celler ble sådd på dekkglass. Etter fjerning av medium, 40 MOI Ad-NDRG2 eller Ad-LacZ ble tilsatt i serumfritt RPMI 1640, inkubert i 2 timer, erstattet med friskt RPMI 1640 supplert med 10% FBS. Platene ble deretter inkubert som beskrevet ovenfor i 24 timer. Etter permeabiliseringen (0,5% Triton X-100), fiksering (4% formaldehyd), og blokkerer (10% normalt geiteserum og 0,5% Triton X-100), mus anti- NDRG2, VHL, HIF-1α og VEGF monoklonalt antistoff var tilsatt til cellene for over natten ved 4 ° C respektivt. Cellene ble så farget med FITC-konjugert eller Cy3-konjugert geit-anti-mus polyklonalt antistoff ved 37 ° C i 2 timer i mørke. Fluorescens fargeintensitet ble deretter undersøkt ved immunfluorescens mikroskopi.
ELISA
Celler ble sådd (5 × 10
5 celler per brønn) i tre eksemplarer i 24-brønners plater. Etter fjerning av medium, 40 MOI Ad-NDRG2 eller Ad-LacZ ble tilsatt i serumfritt RPMI 1640, inkubert i 2 timer, erstattet med friskt RPMI 1640 supplert med 10% FBS. Betinget media av 24 timer cellekulturer ble analysert for VEGF ved å bruke kommersielle sandwich-ELISA kits (Endogen, Woburn, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Hver prøve ble testet i duplikat. Data ble uttrykt i VEGF (pg /ml).
veksthemming analyser
in vivo
Seks uker gamle BALB /C atymiske (nu /nu) mus ble gitt av Experimental Animal Center for fjerde Military Medical University (Xi’an, Kina). Alle protokoller ble godkjent av Animal Care og bruk komité på fjerde Military Medical University og ble utført i samsvar med dyr omsorg reglene fastsatt av universitetet (Permit Nummer: 10001). Alle forsøk ble gjort for å redusere antall dyr brukt, og for å minimere deres lidelser. 786-O-cellene ble høstet og resuspendert i sterilt PBS. 786-O-celler (5 × 10
6 celler) i 0,2 ml ble injisert subkutant i venstre flankene av de seks uker gamle nakne mus. Når den gjennomsnittlige størrelse av tumorer nådde 200 mm
3, alle musene delt i tre grupper tilfeldig (Ad-NDRG2, Ad-LacZ og PBS kontroll-grupper, n = 10 per gruppe). Intratumorale injeksjoner av adenovirus (1 × 10
9 pfu i 100 ul PBS) ble gjort hver 3 d for totalt syv ganger. Tumorvolumene ble beregnet på grunnlag av kalibermålinger av lengden (a) og bredden (b) av lesjoner ved hjelp av følgende formel: V = ab
2/2. Vekstkurven ble deretter avledet fra disse dataene. Betingelsene for musene ble overvåket hver dag, og muse overlevelse ble målt gjennom hele forsøksperioden. Musen ble ofret ved halshugging, da det dukket opp kakeksi, som ble karakterisert som en generell tilstand av dårlig helse, ledsaget av et tap av lean body mass og fettmasse, svakhet, tretthet, treghet, kraftig redusert matinntak, ascites og anoreksi [25]. Alt offer ble utført under anestesi (ketamin 130 mg /8,8 mg xylazin /kg kroppsvekt). Deretter vevsprøver ble fjernet for å fremstille parafinsnitt for histologisk farging. Uttrykket nivåer av NDRG2, pVHL, HIF-1α, VEGF-protein i de inokulerte tumorene ble påvist ved anvendelse av histologi og immunhistokjemi, som beskrevet ovenfor.
Statistisk analyse
De statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS programvare versjon 19.0. Sammenligninger mellom grupper ble foretatt ved hjelp av enveis ANOVA analyse og Fishers eksakte test. Kaplan-Meier-kurver og log-rank-tester ble anvendt for overlevelsesanalyse.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Expression of NDRG2, pVHL og HIF-1α i normale nyrevevet, og CCRCC vev
For å finne ut om regulering mellom NDRG2 og pVHL eksisterer i CCRCC, vi først oppdaget uttrykk for NDRG2 og de av pVHL og HIF-1α i 130 CCRCC prøver og sammenkoblede normalt vev. Som vist i tabell 1 og figur 1, frekvensen av NDRG2 positivt uttrykk i CCRCC vevsprøver var 30,0% (figur 1A og 1B), som var signifikant lavere enn i normalt nyrevev 60,0% (figur 1G og 1H) (
P
= 4,40 × 10
-9). Og frekvensen av pVHL positivt uttrykk i CCRCC vevsprøver (figur 1C og 1D) var også betydelig lavere enn i normalt nyrevev (Figur 1I og 1J) (26,9% vs 66,2%,
P
= 3.02 × 10
-10). Tvert imot, frekvensen av HIF-1α positiv ekspresjon i CCRCC vevsprøver (figur 1E og 1F) var signifikant høyere enn i normalt nyrevev (figur 1K og 1L) (55,4% vs. 33,7%,
P
= 0.006). Videre, som er vist i fig 1M og 1 N, uttrykket nivåer av NDRG2 var positivt korrelert med de av pVHL i CCRCC vevsprøver (
r
= 0,749,
P
= 3,25 x 10
-5), mens uttrykket nivåer av NDRG2 var negativt korrelert med de av HIF-1α i CCRCC vevsprøver (
r
= -0,331,
P
= 1,85 × 10
-3).
Gruppe
undergruppe
Negativ (%)
Positiv (%)
χ
2
P
verdi
NDRG2 CCRCC tissue91 (70,0) 39 (30,0) 23.64
P
= 4,40 × 10
-9normal nedsatt tissue52 (40,0) 78 (60,0) pVHLCCRCC tissue95 (73,1) 35 (26,9) 40.21
P
= 3.02 × 10
-10normal nedsatt tissue44 (33,8) 86 (66,2) HIF-1αCCRCC tissue58 (44,6) 72 (55,4) 8,18
P
= 0,006 normal nyrefunksjon tissue81 (62,3) 49 (37,7) Tabell 1. uttrykk for NDRG2, pVHL og HIF-1α i normale nyrevevet, og CCRCC vev.
CSV ned CSV
Representative photomicrographs av immunhistokjemisk farging for NDRG2, pVHL og HIF-1αin normal nedsatt vev og CCRCC vev. (A og B) NDRG2 ekspresjon i CCRCC vev (200 x forstørrelse). (C og D) pVHL ekspresjon i CCRCC vev (200 x forstørrelse). (E og F) HIF-1α uttrykk i CCRCC vev (200 × forstørrelse). (G og H) NDRG2 uttrykk i normale nyre tubuli (200 × forstørrelse). (I og J) pVHL uttrykk i normale nyre tubuli (200 × forstørrelse). (K og L) HIF-1αexpression i normale nyre tubuli (200 × forstørrelse). (M) Uttrykket nivåene av NDRG2 er positivt korrelert med de av pVHL. (N) Uttrykket nivåer av NDRG2 er negativt korrelert med de av HIF-1α. Antallet av prøven ble vist som «målestokk». Ulikheter på tvers av gruppene ble analysert ved bruk av Pearson korrelasjonskoeffisient og grafen ble generert av SPSS19.0 programvare.
NDRG2 overekspresjon hemmer proliferasjonen av humane nyrekreftceller
in vitro
for å undersøke effekten av NDRG2 overekspresjon på veksten av menneskelige nyrekreftceller, brukte vi Ad-LacZ eller Ad-NDRG2 å infisere 786-O-celler og A498 celler. Etter infeksjon i 24 timer, sterk ekspresjon av det NDRG2 protein i 786-O-celler (figur 2A) og A498-celler (figur 2B) ble bekreftet ved western blot-analyse ved å bruke et monoklonalt antistoff mot NDRG2. Inhibering i celleformering ble målt ved MTT-analyse 12, 24, 36, 48, 60 og 72 timer etter infeksjon. Som vist i figur 2C og 2D, Ad-LacZ hadde ingen signifikant virkning på celleformering i begge cellelinjer sammenlignet med kontrollgruppen (
P
verdi ved 24, 36, 48, 60 og 72 h er 0,55, 0,61 , 0,96, 0,98 og 0,60 henholdsvis 786-O celler;
P
verdi er 0,60, 0,68, 0,60, 0,15 og 0,60 i henholdsvis A498 celler). Men celleproliferasjon ble betydelig hemmet i Ad-NDRG2-smittet 786-O celler (
P
verdi på 24, 36, 48, 60 og 72 timer er 048, 1,54 × 10
-4, 2,01 × 10
-4, 2,15 × 10
-4 og 4,32 × 10
-6 henholdsvis 786-O-celler) og Ad-NDRG2-infiserte A498 celler (
P
verdi er 0,47, 0,43, 2,20 × 10
-4, 4,08 × 10
-4 og 1,70 × 10
-6 henholdsvis A498 celler), henholdsvis, sammenlignet med Ad-LacZ gruppe.
(A og B) Expression nivåer av NDRG2 protein i Ad-NDRG2-smittet 786-O og Ad-NDRG2-infiserte A498 celler ble henholdsvis undersøkt ved Western blotting. (C og D) Veksten av de 786-O og A498-celler ble hemmet av overekspresjon av NDRG2 etter 72 timers inkubering. Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av enveis ANOVA. *** Indikerer
P
0,001, sammenlignet med Ad-LacZ-gruppe.
NDRG2 overekspresjon hemmer invasjonen og migrasjon av menneskelige nyrekreftceller
in vitro
For å ytterligere evaluere effekten av NDRG2 overekspresjon på metastatisk aktivitet, vi utførte
in vitro
Matrigel-belagte Transwell invasjons analyser, så vel som trekk analyser med to forskjellige humane renale kreftcellelinjer, 786-O og A498. Representative mikrobilder ble tatt fra den nedre overflate av transwell filteret, og cellene som migrerte invaderte eller ble farget med Gimsa. Som vist i figur 3A og 3B, invasiv potensial, som bestemmes ved cellenes evne til å invadere en Matrigel barriere, ble signifikant undertrykt av Ad-NDRG2 infeksjon hos 786-O-celler (
P
= 1,46 x 10
-5
vs
Ad- LacZ gruppe) og A498-celler (
P
= 2,23 × 10
-5
vs
Ad- LacZ gruppe) . Men det var ingen signifikante forskjeller mellom adresse LacZ gruppe og en kontrollgruppe i begge 786-O celler (
P
= 0,79) og A498 celler (
P
= 0,58). Videre overekspresjon av NDRG2 i disse cellelinjene undertrykte betydelig migrasjon gjennom transwellsammenlignet med Ad-LacZ infeksjon (
P
= 1.19 × 10
-5 for 786-O-celler og
P
= 1.09 × 10
-3 for A498 celler, henholdsvis) (Figur 3C og 3D). Men det var ingen signifikante forskjeller mellom adresse LacZ og kontrollgrupper i begge cellelinjer (
P
= 0,73 for 786-O-celler og
P
= 0,94 for A498 celler)
(A og B) invasjonen evne ble beregnet ved hjelp av Transwell belagt med Matrigel. Mengden invaderte celler ble beregnet i fem tilfeldige høy effekt felt (400 × forstørrelse). Histogrammet representerer kvantifisering av celler som invaderte. (C og D) migrasjon evne ble beregnet ved hjelp av Transwell ubestrøket med Matrigel. Mengden av migrerte celler ble beregnet i fem tilfeldige høy effekt felt (400 × forstørrelse). Histogrammet representerer kvantifisering av cellene som migrerte. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik (SD) for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av enveis ANOVA. ** Eller *** indikerer
P
0,01 eller
P
0.001, henholdsvis sammenlignet med Ad-LacZ gruppe.
Regulering av uttrykk for pVHL, HIF-1α og VEGF ved oppregulering av NDRG2 i 786-O celler
for å forstå den molekylære mekanisme som NDRG2 hemmer 786-O-celler spredning og invasjon, analyserte vi effekten av NDRG2 på uttrykk for pVHL, HIF-1α og målet VEGF, som spiller viktige roller i celleproliferasjon og invasjon av nyrekreft . Vi smittet de 786-O-celler med Ad-NDGR2 og undersøkt pVHL, HIF-1α og VEGF uttrykk ved western blot analyse. Som et resultat, er beskrevet vi den økte ekspresjon pVHL og redusert HIF-1α og VEGF i forhold til den for kontrollgruppen og Ad-lacZ-gruppe 786-O-celler (figur 4A). I mellomtiden brukte vi immunofluorescens-analyse for å bekrefte ytterligere regulering av ekspresjonen av pVHL, HIF-1α og VEGF ved overekspresjon av NDRG2. Indirekte immunfluorescens merking viste svake signaler om NDRG2 og pVHL i kontrollgruppen og Ad-lacZ gruppe 786-O-celler, mens det var sterkere farging av NDRG2 og pVHL i Ad-NDRG2-infiserte 786-O-celler. Videre signalene fra HIF-1α og VEGF i kontroll og Ad-LacZ gruppen var sterkere enn de i Ad-NDRG2 gruppe (figur 4B).
(A) 786-O, Ad-LacZ-786-O og Ad-NDRG2-786-O-celler ble inkubert i henhold normoxia og hypoksi i 24 timer. Etter inkubering ble cellene analysert ved hjelp av western blot-analyse. p-aktin proteinnivåer ble anvendt som en kontroll lasting. (B) Etter smitte av 786-O-celler med 40 MOI Ad-NDRG2 henhold normoxia for 24 timer, protein nivåer av NDRG2, pVHL, HIF-1α og VEGF i cellene ble målt ved hjelp av immunfluorescens analysen (400 × forstørrelse).
VEGF produksjonen hemmes av NDRG2 overekspresjon
for å teste om NDRG2 uttrykk påvirker VEGF produksjon i nyrekreftceller, brukte vi Ad-NDRG2 å infisere 786-O og A498 celler og målte VEGF-nivåer i cellekulturmediet i henhold til normoksisk eller hypoksiske forhold. Resultatene av ELISA-analysen viste at Ad-NDRG2 gruppe av 786-O-celler, sammenlignet med Ad-LacZ viste signifikant redusert VEGF-sekresjon under enten normoksisk (figur 5A) (
P
= 7,32 x 10
-8) eller hypoksiske forhold (figur 5B) (
P
= 9,95 × 10
-8). I mellomtiden, VEGF utskillelsen av A498 celler ble også betydelig redusert etter NDRG2 overekspresjon tilstand uavhengig av normoxia (figur 5C) (
P
= 6,12 × 10
-7) og hypoksi (figur 5D) (
P
= 0,005). Men Ad-LacZ infeksjon har ingen effekt på VEGF produksjon sammenlignet med kontrollgruppen enten i normoxia (
P
= 0,55 for 786 O celler;
P
= 0,91 for A498 celler) eller i hypoksi (
P
= 0,94 for 786 O celler;
P
= 0,90 for A498 celler)
(A og B) 786-O, Ad-LacZ-786-O. og Ad-NDRG2-786-O-celler ble inkubert i henhold normoxia og hypoksi i 24 timer. Etter inkubasjon ble mediet analysert for VEGF-nivåer ved ELISA-analysen. (C og D) A498, Ad-LacZ- A498 og Ad-NDRG2- A498 celler ble inkubert i henhold normoxia og hypoksi i 24 timer. Etter inkubasjon ble mediet analysert for VEGF-nivåer ved ELISA-analysen. Dataene var gjennomsnitt ± standardavvik (SD) for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans ble vurdert med enveis ANOVA. ** Eller *** indikerer
P
0,01 eller
P
0.001, henholdsvis sammenlignet med Ad-LacZ gruppe.
bekjempelse av tumorvekst i en naken mus modell av intratumoral injeksjon av Ad-NDRG2
For å undersøke effekten av Ad -NDRG2 på tumorvekst
in vivo
, injisert vi adenovirus (1 x 10
9 pfu i 100 ul PBS) Ad-NDRG2, Ad-lacZ eller PBS hver 3 dager til pre-etablerte menneske 786- O nyrekreftsvulster (ca. 200 mm
3) dyrket i nakne mus. Som vist i figur 6A, oppnådde Ad-NDRG2 gruppe en vedvarende og betydelig hemming av tumorvekst sammenlignet med Ad-LacZ gruppe (
P
verdi er 0,002, 1,54 × 10
-6, 1,77 × 10
-6, 9,7 x 10
-11, 8,69 x 10
-12 og 1,35 x 10
-9 ved Day6, 9, 12, 15, 18 og dag 21 henholdsvis). Kaplan-Merier overlevelsesanalyse viste at intratumoral injeksjon av Ad-NDRG2 signifikant forlenget mus overlevelse ganger (
χ
2 = 11,75,
P
= 0,003) (figur 6B). Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom kontrollgruppen og Ad-LacZ gruppe (
χ
2 = 4.67,
P
= 0,122), og resultatene var i samsvar med de av
in vitro
analyser. Etter at musene ble avlivet, ble tumorene fjernet for analyse av ekspresjonen av NDRG2, pVHL, HIF-1α og VEGF. Immunolabeling for VEGF og HIF-1a var lavere i tumorer skåret ut fra mus i Ad-NDRG2 gruppe. Videre NDRG2 og pVHL uttrykk nivåer i Ad-NDRG2 gruppe ble dramatisk økt mens HIF-1a og VEGF nivåer redusert sammenlignet med Ad-LacZ gruppe (NDRG2,
P
= 6,47 × 10
-8 ; pVHL,
P
= 1,55 × 10
-8, HIF-1α,
P
= 0,0001; VEGF,
P
= 6,07 × 10
-7). Det var ingen signifikant forskjell mellom kontroll- og Ad-LacZ grupper (NDRG2,
P
= 0,98; pVHL,
P
= 0,94; HIF-1α,
P
= 0,78, VEGF,
P
= 0,69) (figur 7A og 7B).
(A) Tumor vekstkurve. Den tumorvekst ble vurdert hver 3. dag til dag 21 av behandlingen ved å måle to vinkelrette diametre og beregne volumet i mm
3. Statistisk analyse ble vurdert med enveis ANOVA. ** Eller *** indikerer P 0,01 eller P 0.001 sammenlignet med Ad-LacZ gruppe. (B) Kaplan-Meier kurve ble vist i Control, Ad-LacZ og Ad-NDRG2 grupper, med hver gruppe bestående av ti mus. Det var en signifikant forskjell mellom Ad-NDRG2 og Ad-LacZ behandlinger. Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av log-rank tester. ** Indikerer
P
0,01 sammenlignet med Ad-LacZ gruppe.
(A) intratumorale uttrykk for NDRG2, pVHL, HIF-1a og VEGF ble vurdert ved Immunohistochemistry (200 × forstørrelse) på parafin-embedded 786-O celle tumor seksjoner. Representative bilder vises. (B) Integrert optisk tetthet (IOD) verdier av NDRG2, pVHL, HIF-1α og VEGF protein uttrykk av svulstene ble evaluert. ImagePro Plus software ble benyttet for å analysere IOD verdier av de positive deler av immunhistokjemisk farging, og de resulterende histogrammer er vist. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av enveis ANOVA. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD. *** P 0,001.
Diskusjoner
Selv om kirurgisk reseksjon og adjuvant behandling blir ofte brukt til å behandle nyrekreftpasienter, den generelle overlevelse for nyrekreft krever forbedring. Det er kjent at RCC er motstandsdyktig mot radio-, hormono-, og kjemoterapi [26]. Derfor er utvikling av biologisk behandling for nyrekreft et presserende behov. Forekomst og utvikling av nyrekreft er avhengig av ekspresjonen av flere beslektede gener, slik som HIF-1α, PDK1, VEGF og så videre [27].
Flere studier har nå vist at HIF-1α up-regulerer uttrykket av PDK1 og VEGF [28]. Videre PDK1 og VEGF uttrykk er økt i RCC [29,30]. PDK1 er kjent for å fosforylere og aktivere enkelte proteinkinaser som hører til AGC-familien av proteinkinaser. Ett av proteinkinaser er proteinkinase B (PKB, også kjent som Akt). PDK1 aktiverer Akt ved å fosforylere en Ser /Thr rest i aktiverings sløyfen. Akt veien er abnormt aktivert i CCRCC og involvert i spredning og metastasering [31]. Og VEGF er bærebjelken blant alle angiogene faktorer og fremmer både tumorigenesis og invasjon av RCC [32]. HIF-1α er også ofte overexpressed i nyrekreft, som korrelerer med dårlig klinisk prognose [33]. Siden forhøyet HIF-1α ekspresjon oppregulerer ekspresjonen av PDK1 og VEGF, som fremmer tumorprogresjon.
