Abstract
Bakgrunn
HNF1A (hepatocytter nukleær faktor en alfa) er en transkripsjonsfaktor som er kjent å regulere bukspyttkjertelen differensiering og opprettholde homeostase av endokrine bukspyttkjertelen. Nylig har genome-wide assosiasjonsstudier innblandet
HNF1A
som en mottakelighet genet for kreft i bukspyttkjertelen. Men den funksjonelle betydning og molekylære mekanismen av
HNF1A
i bukspyttkjertelen kreftutvikling er fortsatt uklart.
Metoder
Ved hjelp av RT-PCR, Western blot og immunhistokjemi metoder, vi undersøkte
HNF1A
genuttrykk i åtte bukspyttkjertelkreft cellelinjer og i paret tumor og normale vevsprøver fra pasienter med resected bukspyttkjertel ductal adenokarsinom. Vi banket ned
HNF1A
genuttrykk i to kreftcellelinjer ved hjelp av tre siRNA sekvenser. Virkningene på celleproliferasjon, apoptose, og cellesyklus samt fosforylering av Akt signale transduksjon proteiner ble undersøkt ved hjelp av ATP-testen, flowcytometri og Western blot.
Resultater
HNF1A
ble uttrykt i tre av åtte bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer og nivået på
HNF1A
mRNA og protein uttrykk var betydelig lavere i tumorer enn i normale tilstøtende vev av både RT-PCR og Western blot analyser. Immunohistokjemi viste at nivået av
HNF1A
ekspresjon var signifikant lavere i tumorvev enn i ikke-tumorvev. Selektiv blokkering av
HNF1A
av spesifikke siRNA dratt en to-fold høyere rate av celledeling, økte med 20% S-fasen og G2 fase celler, og 30-40% redusert apoptose i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Vi videre viste at
HNF1A
knockdown aktivert Akt og dens nedstrøms målet, mammalian target of rapamycin (mTOR) i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Konklusjon
Disse observasjonene gir eksperimentelle bevis støtter en mulig svulst suppressor rolle HNF1A i bukspyttkjertelkreft
Citation. Luo Z, Li Y, Wang H, Fleming J, Li M, Kang Y, et al. (2015) hepatocytter Nuclear Factor 1A (HNF1A) som en mulig svulst lyddemper i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 10 (3): e0121082. doi: 10,1371 /journal.pone.0121082
Academic Redaktør: Jose G. Trevino, University of Florida, USA
mottatt: 20 august 2014; Godkjent: 28 januar 2015; Publisert: 20 mars 2015
Copyright: © 2015 Luo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. GS Hogan forskningsmidler og Sheikh Ahmed Senter for kreft i bukspyttkjertelen forskningsmidler. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Siste innlegg GWAS (genom-wide forening studie) dataanalyser har vist at
HNF1A product: (
hepatocytter nukleær faktor 1
) genvarianter er forbundet med risiko for kreft i bukspyttkjertelen [ ,,,0],1-3]. Imidlertid er det fortsatt uklart funksjonell betydning og molekylære mekanismer av HNF1A-mediert bukspyttkjertelen kreftutvikling.
HNF1A tilhører homeobox protein familien og er en viktig transkripsjonsfaktor for mange lever gener involvert i avgiftning, homeostase og metabolisme av glukose, lipid, steroid og aminosyre [4]. I tillegg er HNF1A en viktig komponent i transkripsjons nettverk som styrer embryonal utvikling og differensiering bukspyttkjertel [5], [6]. så vel som å opprettholde vekst og funksjon av øy-p-celler hos voksne [7]. Kimcellelinje heterozygote mutasjoner av
HNF1A
har blitt funnet ansvarlig for type 3 MODY (modenhet-onset diabetes av unge) [8]. Mutasjoner eller vanlige varianter av
HNF1A
genet har også vært forbundet med risiko for type II diabetes [9-11].
Som en transkripsjonsfaktor, HNF1A har også vist seg å påvirke intestinal epitelceller vekst og celledifferensiering linjer [12], [13] og regulere ekspresjonen av mikroRNA-194 [14]. Tidligere studier i andre menneskelige kreft har foreslått en tumor suppressor rolle
HNF1A
genet. For eksempel biallelic somatiske endringer av
HNF1A
var til stede i 60% av hepatocellulært adenom og i sjeldne tilfeller av hepatocellulært karsinom i ikke-levercirrhose [15].
HNF1A
stanse ved siRNA i leverkreft celler indusert overekspresjon av flere gener som koder for vekstfaktorreseptorer, komponenter av det translasjonelle maskineri, cellesyklus, og angiogenese regulatorer [16]. Mutasjoner av
HNF1A
genet ble også påvist i kolorektal kreft med mikro ustabilitet [17] og i livmorkreft [18]. Polymorfe varianter av
HNF1A
-genet har blitt assosiert med sirkulerende nivået av C-reaktivt protein (CRP), en biomarkør av inflammasjon [19], [20]. En fersk GWAS studie av menneskelig N-glycome identifiserer HNF1A som en mester regulator av plasmaprotein fucosylation [21]. Dette tyder på at HNF1A kunne spille en rolle i utviklingen av kreft gjennom regulering av immunitet, inflammatorisk respons, og proteinfolding, samt cellevekst og differensiering. Men det er likevel ingen informasjon om uttrykket eller mutasjonsstatus og den potensielle rolle
HNF1A
i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen.
I denne studien ønsker vi å demonstrere uttrykk for
HNF1A
genet i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen og virkningen av
HNF1A
deregulering på celleproliferasjon, cellesyklus, apoptose og signaloverføring i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og menneskelig vev
Menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer ASPC-1, Panc-1, MiaPaCa-2, Hs766T, og BxPC-3 celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection og dyrket som beskrevet i deres produkt informasjon ark. Panc-28, Colo357 og dens hurtigvoksende (FG) sublinje, samt immortalisert normal human pankreatisk duktus epitelial (HPDE) cellelinje var gaver fra Drs. Craig D. Logsdon (MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas) [22], [23]. Alle cellelinjer har blitt godkjent ved å teste 14 polymorfe markører. Kreftceller ble dyrket i RPMI 1640-medium eller i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum. HPDE celle ble opprettholdt i keratinocyte serumfritt medium supplert med epidermal vekstfaktor og storfe hypofysen ekstrakt.
Formalin fast parafininnstøpte (FFPE) deler og frosne prøver fra 48 par av kirurgisk resected bukspyttkjertelen tumor vev og deres tilstøtende ikke-tumorvev ble erholdt fra MD Anderson Tissue Bank. FFPE ble brukt for immunhistokjemi. Frosne vev ble anvendt for RNA og protein utvinning. Alle vevsprøver brukt i denne studien var rest kirurgiske prøver fra pasienter som gjennomgår tumorreseksjon uten pre-operativ behandling ved MD Anderson Cancer Center med en skriftlig informert samtykke signert av hver pasient. Alle vevsprøver ble undersøkt av en patolog (Wang) for å sikre cellularitet av tumorvev og renheten av normale tilstøtende vev. Studien og samtykkeskjema ble godkjent av MD Anderson Institutional Review Board.
Immunohistochemistry (IHC) og Western blotting
Etter deparaffinization ble vevssnitt utsatt for antigen gjenfinning og endogen peroksidase aktivitet blokkering. Det primære antistoff var kanin anvendt HNF1A antistoff fra EPITOMICS (Burlingame, CA) i en fortynning på 1: 200. Etter behandling med den biotinylerte sekundære antistoff ble det antistoff-komplekset påvises ved å bruke et avidin-biotin-peroksidasekompleks løsning og visualisert ved bruk av 3,3′-diaminobenzidin (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA). En negativ kontroll ble inkludert i hvert eksperiment ved å utelate det primære antistoff. Bilder ble evaluert av et erfarent patolog for fargemønstre i forskjellige typer av pankreatiske celler, forskjellige cellulære komponenter, så vel som i tumor og normalt vev. Seksjoner fra samme vevsblokk ble også farget for fosforylert AKT og mTOR hjelp av anti-fosfor-AKT (Ser473) og anti-fosfo-mTOR (Ser2448) antistoffer. Den fargeintensitet ble scoret som 0 for negativ, en for svak, to for middels, og 3 for sterk farging. Prosentandelen av celler med positiv farging ble scoret som 0 for ingen, ett for 1-50%, og to for 50%. Den endelige farging poengsum var et produkt av intensiteten og prosent score. Forskjellen i fargings score til de ikke-tumor og tumorøse vev ble sammenlignet med paret t-test.
Proteinekspresjon ble også evaluert i proteinprøver ekstrahert fra cellelinjer og prøvene frosset vev ved hjelp av Western blotting. Protein ble ekstrahert fra hel-celle protein-lysater og konsentrasjonen bestemt ved hjelp av Bradford fargemetoden. Proteinekstrakter ble fraksjonert ved polyakrylamidgelelektroforese og overført til en mini PVDF-membran ved anvendelse av en Trans-Blot Turbo overføringssystem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). De primære antistoffer anvendes, innbefatter: HNF1A fra BD Biosciences (San Jose, CA) ved 1: 1000 fortynning; total AKT, fosfo-AKT (Ser473), og fosfo-AKT (Thr308) ved 1: 2000 fortynning; og total mTOR og fosfor-mTOR (Ser2448) ved 1: 1000 fortynning fra Cell Signaling (Danvers, MA). Beta-aktin 1: 3000 fortynninger ble anvendt som kontroll lasting. Etter inkubasjon med passende sekundære antistoffer konjugert til pepperrot-peroksidase, ble membranene utsatt for ECL western blotting deteksjonsreagens. Membraner ble strippet i 30 minutter ved 55 ° C i en buffer inneholdende 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH6.7), og 100 mM 2-merkaptoetanol for farging av flere proteiner. Farging intensiteter ble kvantifisert ved densitometrisk analyse.
mRNA-ekspresjon
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler, så vel som fra 27 par av pankreatisk tumor og deres tilstøtende ikke-tumorvev ved hjelp av Trizol reagens ifølge produsentens protokoll (Life Technologies, Grand Island, New York). Komplementært DNA ble syntetisert fra 1,0 ug av total-RNA ved bruk av cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) ble utført i tre eksemplarer prøver å bruke ferdiglagede primere og probe sett (Hs00167041-M1, Life Technologies, Grand Island, New York). RT-PCR-resultater ble først normalisert til terskelsyklusen (Ct) fra GAPDH, referert til som ΔCt. Den ganger endring i ekspresjon av gener i tumor gruppen sammenlignet med den i normalgruppen ble uttrykt som 2
-ΔΔCt, hvori-ΔΔCt lik ΔCt av tumoren gruppe minus ΔCt av den normale gruppen, som var normalisert til 1.
siRNA blokkerer
Liten interfering RNA (siRNA) transfections ble utført ved hjelp av transfeksjon reagens i henhold til produsentens protokoll (Life Technologies, Grand Island, New York). Tre forskjellige siRNA tomannsboliger målretting
HNF1A
genet (NM_000545) ble testet. Sekvensene til de sirnas er som følger: 5′-CAGUGAGACUGCAGAAGUAtt-3 «(
HNF1A
siRNA1), 5′-GGUCUUCACCUCAGACACUtt-3′ (
HNF1A
siRNA2), 5′-CACCUGUCCCAACACCUCAtt- 3 «(
HNF1A
siRNA3). En negativ kontroll siRNA eller transfeksjon reagens bare ble anvendt i transfeksjoner mock. ASPC-en og BXPC-3 celler ble transfektert og cellene ble høstet 24 timer til 96 timer etter transfeksjon.
cellevekst og spredning
Celleproliferering ble kvantifisert ved hjelp av en ATP-analyse (Promega, Madison , WI). I korthet, 10.000 celler per brønn i 96-brønners plater ble transient transfektert med
HNF1A
siRNA eller tak siRNA (10 nM). Et like stort volum av reagens ble tilsatt til kulturen 12, 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon for luminescens deteksjon. Tre uavhengige eksperimenter ble utført ved hvert tidspunkt.
Cell Cycle og apoptose assay
72h etter transfeksjon, ble cellene høstet og suspendert i citrat stabiliserende buffer inneholdende 125 mikrogram /ml propidiumjodid (PI) og RNase A. Celle syklus fordeling ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri.
Apoptose ble bestemt ved hjelp av fluoresceinisotiocyanat (FITC) annexin V og propidiumjodid (PI) dual fargemetoden 72 timer etter transfeksjon. Apoptotiske celler ble identifisert ved flowcytometrisk analyse ved hjelp av BD celle analysator og FCS Express programvare-Clinical Edition (BD Biovitenskap, San Jose, California). Både tidlig og sent apoptotiske celler ble telt for relative apoptotiske endringer. Alle forsøkene ble utført in triplo.
Alle data i gjentatte eksperimenter ble beskrevet som middelverdi ± SD. Paret t test eller student t-test (2-tailed) ble påført med
P
verdi 0,05 som signifikansnivået.
Resultater
Uttrykk for
HNF1A
i bukspyttkjertelen karsinom cellelinjer
Ved hjelp av kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og Western blot analyser viste vi at
HNF1A
ble uttrykt i tre veldefinerte bukspyttkjertelkreft cellelinjer som stammer enten fra de primære bukspyttkjertelen adenokarsinom tumorer (BxPC-3) eller metastaser (ASPC-1, Colo357) med høyeste nivået påvist i ASPC-1 (fig. 1A).
HNF1A
ekspresjon var knapt synlig i MiaPaCa-2-celler og ikke påvisbar i de resterende karsinom-cellelinjer og HPDE (fig. 1). Western blot-analyse bekreftet tilstedeværelsen av HNF1A protein i BxPC-3, ASPC-1 og Colo357-celler, lavere nivå i MiaPaCa-2 og fraværet i Panc-1, FG, Hs766T, Panc-28 og HPDE-celler (fig. 1B ).
A, mRNA uttrykk nivå i menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer i forhold til å kontrollere cellelinje COLO357 målt ved QRT-PCR. B, protein uttrykk i tilsvarende cellelinjer ved hjelp av Western blot. C, brett forskjeller i mRNA uttrykk nivåer av 27 pankreastumorer forhold til sine sammenkoblede tilstøtende ikke-tumorvev. D og E, Western blot og kvantitativ måling av ekspresjon av protein HNF1A i åtte sammenkoblede humane pankreatiske tumorer prøvene (T) og deres tilstøtende ikke-tumor (N) vev. Uttrykket nivåer av HNF1A er normalisert til de av β-aktin.
Redusert uttrykk for
HNF1A
i menneskelig bukspyttkjertelen adenokarsinom
HNF1A
mRNA uttrykk ble oppdaget av QRT-PCR på 27 parvise resected bukspyttkjertelen adenokarsinom tumorvev og deres tilstøtende ikke-tumorvev. Nivået på
HNF1A
uttrykk var betydelig lavere i svulst enn i ikke-tumorvev (
p
= 0,005, sammen
t
test) (Fig. 1C). Den midlere nivå på
HNF1A
mRNA-ekspresjon i tumorvevet ble redusert til 44,4% av den i ikke-tumorvev, selv om tre av de 27 parene viste en høyere grad av
HNF1A
ekspresjon i svulstene.
Deretter Western blot ble utført i åtte par svulst og ikke-tumorvev å undersøke HNF1A uttrykk på proteinnivå. Ved Western blot (Fig. 1D), har vi funnet et lavere nivå av HNF1A protein i 7/8 (87,5%) av tumorene sammenlignet med sine tilstøtende ikke-tumor vev (fig. 1E). Den midlere (± SD) intensiteten av det HNF1A bandet etter normalisert til den av β-actin var signifikant lavere i tumor (0,71 ± 0,11) enn de i ikke-tumorvev (0,80 ± 0,13) (
p
= 0,005, sammen
t
test). IHC eksperimenter viste klare forskjeller i HNF1A protein uttrykk mellom normal (Fig. 2A og 2B) og kreft bukspyttkjertelen (Fig. 2C og 2D). HNF1A protein var til stede med en sterk intensitet i normale endokrine og eksokrine pankreas. Holmen celle og acinar celle viste en sterkere atomkjerner flekker enn ductal cellene gjorde. I motsetning til dette, i tumorvevet, ble HNF1A uttrykt ved moderate nivåer i holmen og akinærceller men ved en lav eller upåviselig nivå i ductal celler. Stromal vev rundt de neoplastiske lesjoner viste ikke signifikant farging for HNF1A. Den gjennomsnittlige flekker score (gjennomsnitt ± SD) var 5,08 ± 2,17 versus 2,27 ± 1,45 i 48 par av ikke-tumor og tumor vev, henholdsvis (
P
0.001, sammen
t
test) (tabell 1).
Bilder (A og B) viser cytoplasmisk og nukleær uttrykk for HNF1A i normal bukspyttkjertelen vev. Den normale bukspyttkjertelen kanaler er merket med én pil. Øyceller er markert med doble piler. Bukspyttkjertelen øyceller har høyere nivå av HNF1A uttrykk enn acinar og ductal celler. Bilder (C og D) viser uttrykk for HNF1A i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (innringet) og godartede bukspyttkjertelen duktale celler og øyen celler ved siden av svulsten (til venstre). Panel E-H viser de representative mikrografer for p-AKT (E og F) og p-mTOR (G og H) ekspresjon i normale pankreas vev (E og G) og pankreatisk duktus adenokarsinom (F og H). Forstørrelser: 100X for A, E og G; 400X for B og H, 40X for C, 200X for D og F.
Blokkerings
HNF1A
av spesifikke siRNA
Tre forskjellige sirnas sekvenser målretting
HNF1A
ekson 4 (siRNA1), ekson 1 (siRNA2) eller ekson 8-9 veikryss (siRNA3) ble transfektert inn ASPC-1 og BxPC-3 celler. Kvantitativ PCR-analyse viste at 48t etter behandling, de tre uavhengige siRNA-mediert
HNF1A
knockdowns resulterte i 92%, 80% og 64% utryddelse av
HNF1A
mRNA uttrykk i ASPC-1 celler, og 98%, 74% og 65% utryddelse i BxPC-3-celler, henholdsvis (fig. 3A og 3B). Sammenfallende med mRNA-data, Western blot-analyse viste at ekspresjon av HNF1A protein i celler behandlet med spesifikke sirnas ble vesentlig redusert (fig. 3C og 3D). På den annen side ble transkripsjonsnivået
HNF1A
ikke påvirkes i vektorkontroll. Basert på disse observasjonene, brukte vi siRNA1 og siRNA2 i følgende eksperimenter.
Celler ble transfektert selvstendig med tre forskjellige sekvenser av siRNA rettet mot HNF1A (siRNA1, siRNA2, siRNA3), eller med en kontroll siRNA (Control) . Inhiberings-effektiviteten ble bedømt ved qPCR for relative nivåer av HNF1A mRNA ved 24 timer til 96 timer etter transfeksjonene. Western Blot analyser av ASPC-en og BxPC-3 celler transfektert med anti-HNF1A sirnas. Data er vist i 96 timer etter trans. Uttrykk for β-actin ble brukt som en intern kontroll.
Virkningen av
HNF1A
knockdown på cellevekst og apoptose
Ved hjelp siRNA1 og siRNA2 som et effektivt verktøy for å kneble den
HNF1A
genet, fant vi at
HNF1A
knockdown dratt en 2 ganger økt spredning av ASPC-1 (fig. 4A) og BxPC-3 (fig. 4B) celler. Spesielt, cellevekst ble ikke påvirket av transfeksjon av vektoren kontroll. Konsekvent, observerte vi at
HNF1A
knockdown fører til en 20% redusert G0 /G1 befolkning og en 20% økning S /G2 fase befolkningen i de to testede cellelinjer (fig. 4C og 4D). I tillegg sammenligne med vektoren kontroll, transfeksjon med
HNF1A
sirnas betydelig redusert andelen av apoptotiske celler. De annexin-positive celler (gjennomsnitt ± SD) ble redusert fra 44,57 ± 11,57 til 13,37 ± 1,51 i ASPC-1-celler, og fra 54,37 ± 7,58 til 12,6 ± 2,19 i BxPC-3-celler (fig. 5).
bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble transfektert med en av de to HNF1A sirnas eller en kontroll siRNA. Formeringshastigheten av de siRNA-transfekterte celler, ble vurdert ved CellTiter-Glo assay på ASPC-1 (A) og BxPC-3 (B) celler 12 timer til 72 timer etter transfeksjon. Cellesyklusfordelingen ble bestemt ved fluorescens-aktivert cellesorteringsanalyse i ASPC-1 (C) og BxPC-3 (D) -celler. Cellene ble farget med PI, og analysert for DNA innhold ved hjelp av flowcytometri 72H-enheten følgende trans. Populasjonene av celler i G1, S og G2 fasene er karakterisert ved forskjellige intensiteter av PI-A fluorescens og er indikert. Data er vist i forhold til kontrollen. * P. 0,05 sammenlignet med hver tilsvarende kontroll
72 timer etter transfeksjon med anti-
HNF1A
sirnas, de ASPC-1 og BxPC-3 celler ble farget med FITC konjugert Annexin -V /PI. Prosentandelen av Annexin V-/PI-fargede celler ble bestemt ved flow-cytometri. Dot plottet ble delt inn i en kvadrant: (1) nekrotiske celler, (2) sent apoptotiske celler, (3) levende celler, og (4) tidlig apoptotiske celler. Søylediagram viser prosentandelen av apoptotiske celler. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre forskjellige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
Tap av
HNF1A
Actives den AKT /mTOR signalveien
AKT /mTOR signalveien er avgjørende for mange aspekter av cellevekst, overlevelse, og apoptose [24]. Den konstitutiv aktivering av AKT /mTOR har vært involvert i patogenesen og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen [25]. For å belyse de molekylære mekanismene som moduleres av
HNF1A
inaktivering i kreft i bukspyttkjertelen celler, undersøkte vi effekten av
HNF1A
knockdown på AKT /mTOR signalveien. Ved hjelp av Western blotting, fant vi at onkogene signal fosfor-AKT og dens nedstrøms fos mTOR var oppregulert etter transfeksjon med
HNF1A
sirnas i begge ASPC-1 og BxPC-3 celler (Fig. 6). Følgelig nivåene av fosforylering av AKT på Ser473 og Thr308 ble betydelig økt sammenlignet med deres tilsvarende kontroll. Samtidig, grader av mTOR Ser2448 fosforylering ble bemerkelsesverdig forbedret. Ingen effekt ble observert på total AKT og mTOR uttrykk. IHC analyse i paret tumor og normal pankreas vev har også funnet signifikant høyere nivåer av AKT fosforylert og mTOR i tumorer enn i normalt vev (fig. 2, tabell 1).
ASPC-1 og BxPC-3-celler ble transfektert med kontroll siRNA og to forskjellige
HNF1A
siRNAs som angitt. 96h etter transfeksjon, ble cellelysater immunoblottet med anti- HNF1A antistoff, anti-fosfo-AKT Ser473-antistoff, anti-fosfo-Thr308 AKT-antistoff, og anti-fosfo-mTOR Ser2448 antistoff. Membranene ble strippet og re-probet med anti-AKT-antistoff, anti-mTOR-antistoff og anti-β-aktin-antistoff. De fold forskjeller i protein uttrykk nivåer av celler transfektert med
HNF1A
siRNA og kontroll siRNA ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
I denne studien har vi gitt noen eksperimentelle bevis for at
HNF1A
genet kan fungere som en tumor suppressor i bukspyttkjertelkreft. Først reduserte uttrykk for
HNF1A
ble påvist i menneskelig bukspyttkjertelen adenokarsinom både mRNA og proteinnivåer. For det andre,
HNF1A
knockdown i kreft i bukspyttkjertelen celler føre til økt celleproliferasjon og redusert apoptose. Tredje, hemming av
HNF1A
forbedret aktivering av AKT-mTOR signalveien. Disse dataene er konsistent med tidligere rapporterte observasjoner i leveren kreft studier [15], [16]. støtter en tumor suppressor rolle
HNF1A
i utvikling av kreft hos mennesker.
HNF1A
genekspresjon ble først oppdaget i leveren, senere vist seg å være uttrykt i epitel av flere organer, inkludert bukspyttkjertel, nyre og tarm [13].
HNF1A
-deficient mus (
HNF1A
– /-
) er født normalt, men lider av lever, bukspyttkjertel og nyre funksjonsfeil [26-28] . Hos mennesker, pasienter bærer mono-allel mutasjoner i
HNF1A
lider av type 3 MODY med nedsatt dysfunksjoner [8]. Somatiske mutasjoner av
HNF1A
genet har blitt rapportert i hepatoma, tykktarmskreft og livmorkreft [16-18]. Nyere GWAS studier har antydet at
HNF1A
genet er assosiert med risiko for kreft i bukspyttkjertelen [1-3], noe som førte til at pågående etterforskningen på den funksjonelle betydningen av dette genet i bukspyttkjertelkreft.
I denne studien, IHC analyse av humane pankreatiske vev har vist at HNF1A protein ble uttrykt ved et høyere nivå i øyceller og akinærceller sammenlignet med den i ductal epitelceller, noe som er konsistent med den funksjonelle betydningen av dette gen i å opprettholde homeostase av endokrin bukspyttkjertel. På den annen side, mRNA og protein ekspresjon nivå av HNF1A (ved både IHC og Western blot-analyser) var signifikant lavere i pankreatiske tumorer enn de omkringliggende ikke-tumorvev, som er forenlig med en potensiell tumor suppressor rolle av dette gen i bukspyttkjertelkreft.
tumor suppressor rolle HNF1A støttes også av funn fra genet knockdown eksperimenter. Vi har observert at hemming av
HNF1A
av sirnas i bukspyttkjertelen carcinoma celler resulterte i en betydelig økt celledeling. Lignende resultater har tidligere blitt rapportert av Molero X et al at HNF1A
– /- mus vise øket acinar celleproliferasjon i basale betingelser og etter induksjon pankreatitt [29]. For bedre å forstå mekanismen for
HNF1A
-inactivation indusert cellevekst, vi har videre vist at nedregulering av
HNF1A
resulterte i en redusert G0 /G1 fase, en økning i S-fasen, og en mild økning av G2 /M fase brøkdel. En tidligere studie utført i hepatomcelle linjer har funnet forhøyet nivå av cyclin D1 i respons til
HNF1A
inaktivering [16]. Videre studier er nødvendig for å demonstrere hvilke cellesyklus regulator modulerer
HNF1A
siRNA-mediert spredning i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer.
Vi viste ved en redusert apoptose rate i
HNF1A
-inactivated bukspyttkjertelen carcinoma celler. Denne effekten virker i strid med observasjoner gjort i humane betaceller i bukspyttkjertelen. Flere tidligere studier har vist at over-ekspresjon av en dominant-negativ mutant av
HNF1A plakater (DN-HNF1A) resulterte i redusert fosfoinositid-3-kinase (PI-3K) /Akt-aktivitet, for derved å svekke cellevekst og proliferasjon og sensibiliserende beta-celler i apoptose [28], [30-32]. Dette avviket kan skyldes forskjell i cellen og patologisk prosess, og viser den komplekse effekten av
HNF1A
i ulike typer celler og patologiske prosesser.
Vi ytterligere belyst nedstrøms signalveier som HNF1A utøver sin tumor suppressor funksjon i kreft i bukspyttkjertelen, og fant at
HNF1A
knockdown aktivert Akt /mTOR signalveien. Den PI3K /Akt /mTOR signaliserer akse spiller en avgjørende rolle i å regulere celleproliferasjon, apoptose, angiogenese og metastasering, som er sentral i utvikling og vedlikehold av kreftceller. Avvikende PI3K /Akt signalering er vanlig i bukspyttkjertelkreft [33], [34]. Våre data viste at
HNF1A
-inactivation betydelig økte nivåer av Akt Ser473 og Thr308 fosforylering og mTOR 2248 fosforylering. Det er kjent at fosforylering av Akt i det Thr 308 kan regulere proteinsyntese og celleproliferasjon mens fosforylering av Akt i Ser 473 er forbundet med resistens mot apoptose ved å kontrollere subcellulære lokalisering av pro-apoptotiske proteiner [35]. Det er kjent at mTOR, en serin-treonin-kinase, og er regulert ved fosforylering på Ser2448 i respons til PI3K /Akt onkogene signalisering. mTOR regulerer cellevekst, celleproliferasjon, celle motilitet, celleoverlevelse, proteinsyntese, og transkripsjon. Derfor er det mulig at effekten av
HNF1A
-inactivation på cellevekst og apoptose er, i det minste delvis, via mekanismen for aktivering av AKT /mTOR-signalreaksjonsveien.
Kronisk pankreatitt en kjent risikofaktor for kreft i bukspyttkjertelen. Gener som regulerer bukspyttkjertelen regenerering kan også være involvert i utviklingen av kronisk pankreatitt, og bukspyttkjertelen kreftutvikling. En fersk studie utført i et pankreatitt dyremodell har vist en skade-responsive nedregulert uttrykk for
HNF1A
i akinærceller [29], som ble knyttet til en økt acinar celleproliferasjon og redusert fordøyelsesenzymer. Tilsynelatende HNF1A styrer vevsspesifikke transkripsjons programmer fordi det forbedrer cellevekst i bukspyttkjertelen holmer men undertrykker celleproliferasjon i hepatocytter [36]. Inhibering av celleproliferasjon i akinærceller og ductal epitelceller kan være en av de viktigste mekanismer som knytter HNF1A i bukspyttkjertelen karsinogenese. En annen fersk studie har også vist at overekspresjon av
HNF1A
genet i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer hemmet cellevekst, indusert G
0 /G
1 og apoptose [37]. Disse virkninger korrelerte med HNF1A-indusert nedregulering av cellesyklus-gener og redusert ekspresjon av anti-apoptotiske gener [37].
Som konklusjon, har vi vist at
HNF1A
uttrykk er betydelig redusert i menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom svulster. Selektiv blokkering av
HNF1A
av spesifikke siRNA betydelig forfremmet kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon og hemmet apoptose in vitro. Vi har videre avdekket at
HNF1A
knockdown aktiverer Akt /mTOR signalveien i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Disse funnene støtter en eventuell svulst suppressor rolle
HNF1A
i bukspyttkjertelkreft.
